二甲双胍对糖基化终产物诱导血管平滑肌细胞钙化的抑制作用

目的:在细胞水平观察二甲双胍对晚期糖基化终产物(AGEs)诱导的血管平滑肌细胞钙化的抑制作用。方法:应用大鼠血管平滑肌细胞株(A7R5)进行体外实验,分别设对照组、牛血清白蛋白(BSA)组、AGE-BSA组、二甲双胍与AGE-BSA共干预组。将200 mg.L-1 AGE-BSA与不同浓度(10-4、5×10-5、10-5 mol.L-1)的二甲双胍在含10 mmol.L-1β-甘油磷酸的钙化培养液中共培养血管平滑肌细胞,观察不同浓度二甲双胍对血管平滑肌细胞钙化的影响。采用全自动生化分析仪测定细胞层钙含量,磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶活性,RT-PCR检测骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA表达,Western blotting检测BMP-2蛋白表达。结果:与对照组相比较,AGE-BSA组细胞层钙含量增加,碱性磷酸酶活性升高,细胞BMP-2 mRNA表达升高,BMP-2蛋白表达增加(P<0.01);不同浓度二甲双胍与AGE-BSA共干预可降低AGEs诱导的上述指标升高。结论:AGE-BSA可促进血管平滑肌细胞钙化,二甲双胍可剂量依赖性地抑制AGE-BSA诱导的钙化促进作用。     

高糖刺激血管平滑肌细胞表达cbfα-1和OC的实验研究

目的 研究高糖在刺激大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)转分化过程中对相关骨基质蛋白如核心结合因子α-1(cbfα-1)和骨钙索(OC)表达的影响,并探讨高糖在诱导血管钙化发生过程中可能的作用机制.方法 原代培养VSMC,分为正常糖浓度组(5 mmol/L D-葡萄塘)、高糖组(25 mmol/L D-葡萄糖)和甘露醇组(5mmol/L D-葡萄糖+25 mmol/L甘露醇),在不同时间点检测各组VSMC的钙沉积指标;茜素红染色了解各组VSMC钙化程度;实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测各组cbfα-1和OC的mRMA水平和蛋白表达变化;碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)的活性.免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平.结果 与正常糖浓度和甘露醇对照组相比较,高糖组VSMC钙沉积和钙化染色均明显增强,cbfα-1和OC的mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05),α-SMA蛋白表达下降(P<0.05),均呈时间依赖性.高糖刺激后VSMC的ALP的活性比对照组增加了近2倍.结论 高糖介导的平滑肌细胞钙化可能与高糖促进VSMC分泌骨基质蛋白cbfα-1和OC水平增加有关;高糖在促进VSMC钙化同时,使VSMC的α-SMA表达水平降低,促进其向成骨样细胞转分化.     

钙化血管细胞凋亡基因的变化

目的：观察钙化血管细胞凋亡的现象和细胞凋亡基因的表达，以认识细胞凋亡在血管钙化发病中的意义。方法：利用维生素D3(Vitamin D3)和尼古丁（nicotine）制备大鼠血管钙化模型，检测血管钙含量、碱性磷酸酶（ALP）活性、^45Ca摄入和血管骨钙素含量；应用原位缺口末端标记（TUNEL）、免疫组织化学及DNA Ladder方法检测钙化血管的凋亡情况；应用免疫组织化学方法和^3H-TdR参入方法观察钙化血管的增殖情况。结果：血管的钙含量、ALP活性、^45Ca摄取、骨钙素含量均显著增高。钙化血管中存在凋亡细胞，表现为细胞缩小、核浓缩、核碎裂等。TUNEL结果显示，钙化血管的凋亡指数比正常组高36％，且Caspase-3和Bax的表达明显增强；Bcl-2的表达亦高于正常组；而NF-κB基因表达比正常组低26％。钙化组可见清晰的DNA阶梯状条带，正常组则未出现。钙化组主动脉平滑肌细胞的增殖指数较正常组增加，^3H-TdR参入量增加了2.5倍。结论：钙化血管细胞的凋亡及增殖基因的表达均增强。     

血管紧张素Ⅱ对大鼠血管钙化的影响

目的在钙化大鼠主动脉血管平滑肌细胞上观察血管紧张素Ⅱ对钙化的影响及其信号通道。方法用β磷酸甘油制备钙化的大鼠血管平滑肌细胞,再以血管紧张素Ⅱ,血管紧张素Ⅱ1型受体阻断剂缬沙坦,通过Von Kossa染色及检测钙含量、碱性磷酸酶活性、骨钙素浓度来探讨血管紧张素Ⅱ对钙化的影响及其信号通道。结果血管紧张素Ⅱ增加大鼠体内碱性磷酸酶活性、血管平滑肌细胞钙含量、体内骨钙素浓度升高,其P0.05;而血管紧张素Ⅱ1型受体阻断剂可通过鼠体内血管紧张素Ⅱ对于血管平滑肌细胞钙含量调节和对其碱性磷酸酶活性及骨钙素浓度上调作用(P0.05)。结论血管紧张素Ⅱ可促进β磷酸甘油诱导的血管平滑肌细胞钙化。     

环孢素A对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察环孢素A（CsA)对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响，以探讨钙调神经磷酸酶（CaN)依赖的信号通路在血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法；以体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞为模型，实验分为三组：（1）AngⅡ组，（2）CsA AngⅡ组，（3）对照组。检测细胞增殖活度（MTT法），增殖细胞核抗原（PCNA）表达（免疫组化定量技术），细胞数目（直接计数法）的变化。结果：AngⅡ组血管平滑肌细胞增殖活度（吸光度表示），PCNA表达水平（光密度值表示）和细胞数目明显高于对照组（P＜0．01或P＜0．05），CsA＋AngⅡ组血管平滑肌细胞增殖活度，PCNA表达水平和细胞数目较AngⅡ组明显降低，差异显著（P＜0．01或P＜0．05）。结论：环孢素A可显著阻滞血管紧张素Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞增殖，这种作用可能通过抑制CaN活性，阻断CaN介导的信号传导通路所致。     

双特异性磷酸酶1通过视神经萎缩蛋白1抑制血管平滑肌细胞钙化

目的 研究双特异性磷酸酶1(DUSP1)/视神经萎缩蛋白1(OPA1)信号通路对血管平滑肌细胞钙化的作用。方法 采用体外血管钙化模型,β磷酸甘油和氯化钙诱导大鼠主动脉血管平滑肌细胞钙化,茜素红S染色检测细胞钙化,ELISA测定钙含量,TUNEL检测细胞凋亡,Western blot测定DUSP1、OPA1、Runt相关转录因子2(Runx-2)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平。采用细胞转染的方法过表达DUSP1和敲减OPA1表达,观察细胞钙化、钙含量、细胞凋亡率和Runx-2、BMP-2、Caspase-3表达水平。结果 β磷酸甘油和氯化钙诱导血管平滑肌细胞钙化模型中,DUSP1(t=11.951,P<0.001)、OPA1(t=8.487,P<0.001)蛋白表达水平均显著下降。过表达DUSP1能促进OPA1蛋白表达(t=-8.921,P<0.001),减轻血管平滑肌细胞钙化,降低细胞钙含量、细胞凋亡率以及Runx-2、BMP-2、活化的Caspase-3的表达(P均<0.001);而敲减OPA1表达能促进血管平滑肌细胞钙化,增加细胞钙含量、细胞凋亡率以及Runx-2、BMP-2、活化的Caspase-3的表达(P均<0.001)。结论 DUSP1可能通过促进OPA1蛋白表达起到抑制血管平滑肌细胞钙化的作用。     

Bax抑制因子1可抑制体外培养的大鼠血管平滑肌细胞的钙化

目的 探讨Bax抑制因子1（BI-1）对血管平滑肌细胞钙化的具体作用机制。方法 使用β磷酸甘油和氯化钙诱导大鼠主动脉血管平滑肌细胞建立钙化模型。将模型分为对照组（使用常规培养基）、BI-1过表达组（过表达BI-1蛋白后使用常规培养基）、钙化组（使用钙化培养基）、钙化+BI-1过表达组（过表达BI-1蛋白后使用钙化培养基）4组。运用茜素红S染色测定血管平滑肌细胞钙沉积,酶联免疫吸附法测定细胞碱性磷酸酶活性和钙含量,Western blot法测定Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达水平。结果（1）随着钙化诱导时间的延长,BI-1蛋白表达明显下降,结果具有明显差异性（P=0.001）;（2）使用质粒转染方法过表达BI-1蛋白后,细胞钙含量、碱性磷酸酶活性明显降低（P=0.0006）,Runt相关转录因子2和骨形态发生蛋白2表达明显下降（P=0.0001）,血管钙化减轻;（3）钙化诱导后血管平滑肌细胞凋亡率增加,而过表达BI-1后细胞凋亡率明显减少（P=0.01）,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3水平下降（P=0.0003）。结论 BI-1抑制细胞凋亡、钙磷沉积和细胞骨型分化起到减轻血管钙化作用。     

低强度脉冲超声抑制血管平滑肌和成纤维细胞的钙化

目的：探究低强度脉冲超声（low intensity pulsed ultrasound,LIPUS）对高钙磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞（rat vascular smooth muscle cell,rVSMC）及大鼠血管成纤维细胞（rat vascular adventitial fibroblasts,rVAF）钙化是否有抑制作用。方法：提取rVSMCs及rVAF,通过钙浓度测定、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定、茜素红染色等方法检测不同声强的低强度脉冲超声对钙化的作用;Western blot、real?time PCR探究低强度脉冲超声对细胞成骨分化的作用。结果：LIPUS处理显著抑制了高钙磷培养基诱导rVSMCs及rVAF的钙沉积及ALP活性的升高,同时在14 mW/cm2 声强LIPUS处理后,rVSMCs及rVAF的成骨分化标志物的表达显著降低。结论：LIPUS抑制高磷钙诱导的rVSMCs及rVAF成骨分化标志物的表达,因此LIPUS对高钙磷引起的rVSMC和rVAF钙化具有保护作用。     

3-芳基香豆素衍生物抑制血管钙化的机制

为揭示3-芳基香豆素衍生物3-(4′-羟基苯基)-6-羟基香豆素（SJ-6）对抗血管钙化的作用机制,采用晚期糖基化终产物（AGEs）对人体主动脉血管平滑肌细胞（HCASMCs）进行钙化诱导并通过茜素红染色及定量进行钙化鉴定。分别检测了化合物SJ-6对碱性磷酸酶（ALP）活力、细胞增殖率、钙含量、总活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、AGEs、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6(1L-6)、白细胞介素β（1L-β）、成骨相关转录因子2 m RNA(Runx2 m RNA)、晚期糖基化终产物受体（RAGE）、核因子κB(NF-κB)、NADPH氧化酶-1(NOX-1)、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶B(AKT)、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、α-平滑肌肌动蛋白（SMA-α）蛋白表达的影响。根据研究结果发现化合物SJ-6可明显降低钙化细胞模型中AGEs含量、ALP活性、细胞内钙离子含量、ROS含量、Runx2 m RNA以及炎症因子TNF-α、1L-6和1L-β的含量（P <0.05）,并升高SOD的含量（P <0.01）,这些作用与阳性对照药氨...     

L-精氨酸对血管钙化大鼠核心结合因子1表达的影响

目的探讨L-精氨酸（L-arginine,L-Arg）对大鼠血管钙化的作用及其机制。方法利用维生素D3、尼古丁制备大鼠血管钙化模型,并将大鼠随机分为6组：对照组（CON）、钙化组（VDN）、L-NAME组（L-NA）、钙化＋L-NAME组（VLN）、钙化＋低剂量L-Arg组（VLA）、钙化＋高剂量L-Arg组（VHA）。常规饲养6周后采集标本,胸主动脉行Von Kossa染色,用原子吸收分光光度法检测大鼠血管组织钙含量、碱性磷酸酶活性及NO含量,western blot技术检测核心结合因子1（core binding factor-1,cbfα1）的表达。结果 VonKossa染色,VDN组明显见到钙化颗粒,并成片状,使用L-Arg干预后钙化颗粒明显减少;VDN组的血管组织钙含量、碱性磷酸酶活性较CON组均明显增加（P〈0.05）,VLA与VHA组血管组织钙含量、碱性磷酸酶活性均较VDN组明显降低（P〈0.05）;VDN组血管组织NO含量较CON组明显减少（P〈0.05）,VLA与VHA组均较VDN组升高（P〈0.05）;western blot检测表明,VDN组cbfα1表达水平较CON组明显升高（P〈0.05）,VLA与VHA组较VDN组明显降低（P〈0.05）。结论 L-Arg可能通过降低核心结合因子1的表达起到减轻血管钙化的作用。     

晚期糖基化终产物对高糖诱导NRK-52E细胞的转分化作用

目的：探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E的转分化干预作用。方法：大鼠肾小管导管上皮细胞株设空白组（不给葡萄糖）、高糖组（25mmol/L葡萄糖）、AGEs干预组（100mg/LAGEs）、高糖AGEs干预组（100mg/LAGEs＋25mmol/L葡萄糖）,培养72h后,用Westernbolt检测转化因子β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2（MMP2）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及甲状旁腺素相关肽（PTHrP）在NRK-52E细胞的表达,活性氧（ROS）含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果：高浓度葡萄糖上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达,AGEs显著上调高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA和PTHrP表达,提高ROS含量。结论：AGEs可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。     

血管紧张素Ⅱ对培养人血管平滑肌细胞钙化的影响

目的:观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对培养人血管平滑肌细胞钙化的影响,以探讨血管钙化发生的机制。方法:体外培养人动脉平滑肌细胞,用β甘油磷酸(βGP)诱导细胞钙化。培养细胞分4组:正常对照组;βGP组:βGP终浓度为10mmol·L-1;AngⅡ组:AngⅡ终浓度为10-7mol·L-1;βGP+AngⅡ组:同时加入相同浓度的βGP和AngⅡ,连续培养10d。采用Vonkossa染色、细胞层钙沉积定量和细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性测定判断钙化程度,用流式细胞仪测细胞周期分布和细胞凋亡率。结果:βGP组细胞Vonkossa染色见大量黑色颗粒状沉积物弥漫分布于细胞层,βGP+AngⅡ组细胞之间散在分布黑色沉着点;βGP+AngⅡ组细胞钙沉积显著低于βGP组[分别为(1.336±0.096)和(2.056±0.441)μmol·L-1,P<0.01];βGP+AngⅡ组细胞内ALP活性显著低于βGP组[分别为(277.57±87.81)和(691.27±128.06)IU·L-1,P<0.01]。正常对照组与AngⅡ组细胞比较,Vonkossa染色、细胞钙沉积量和ALP活性均无显著性差异。流式细胞仪结果显示,βGP+AngⅡ组细胞凋亡率显著低于βGP组,G0/G1期细胞比例降低,S期的比例升高(P<0.05)。结论:10-7mol·L-1的AngⅡ可抑制钙化血管平滑肌细胞的体外钙化进程。其作用可能与抑制ALP活性和促进细胞增殖、抑制凋亡有关。     

硫化氢联合阿托伐他汀钙对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的 观察硫化氢联合阿托伐他汀钙对血管平滑肌细胞凋亡的影响.方法 培养兔血管平滑肌细胞（VSMCs）3～8代,分为对照组、硫化氢组、阿托伐他汀钙组以及硫化氢联合阿托伐他汀钙组（简称联合干预组）,共4组,分别给予相应干预,TUNEL法检测VSMCs的凋亡情况.结果 VSMCs凋亡率：与对照组相比,硫化氢组、阿托伐他汀钙组以及联合干预组VSMCs的凋亡率均增加（P＜0.01）;与硫化氢组相比,联合干预组VSMCs凋亡率增加（P＜0.01）,阿托伐他汀钙组VSMCs凋亡率减少（P＜0.01）.结论 硫化氢、阿托伐他汀钙以及两者联合均可促进VSMCs的凋亡,其中以两者联合效果最为明显,硫化氢的作用强于阿托伐他汀钙.     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞死亡受体Fas、TNFR1mRNA表达的影响

目的通过观察同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞死亡受体Fas、TNFR1mRNA表达的研究,探索同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞凋亡的分子机制。方法应用RT-PCR技术对死亡受体Fas、TNFR1mRNA的表达进行观察。结果 RT-PCR技术检测结果发现同型半胱氨酸使血管平滑肌细胞Fas、TNFR1mRNA的表达呈浓度和时间依赖性上调（P〈0.05）。结论同型半胱氨酸诱导人血管平滑肌细胞死亡受体Fas、TNFR1 mRNA表达增加,这可能是同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞凋亡的机制之一。     

糖基化终末产物损伤冠状动脉平滑肌细胞Kv通道

目的 研究糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）对大鼠冠状动脉平滑肌细胞电压门控性钾离子（voltage-gated K⁺,K_v）通道电流的影响。方法 分离大鼠冠状动脉平滑肌细胞,分为空白对照组、糖基化牛血清白蛋白（AGE-bull serum albumin,AGE-BSA）组、AGE-BSA+抗AGE受体抗体（anti-receptor of AGEs immunoglobulin G,anti-RAGE IgG）组进行干预。采用膜片钳技术检测各组细胞K_v通道电流,采用Western blotting、实时荧光定量PCR方法检测各组细胞K_v1.2和K_v1.5通道蛋白及mRNA的表达。结果 AGE-BSA直接干预冠状动脉平滑肌细胞明显抑制了平滑肌细胞的K_v电流达32.7%,并使K_v1.2和K_v1.5通道蛋白及mRNA的表达明显下调。而给予anti-RAGE IgG预处理30 min后再加入AGE-BSA刺激,平滑肌细胞的Kv电流密度及Kv1.2和Kv1.5通道蛋白及mRNA的表达与空白对照组相比,差异无统计学意义。结论 AGEs通过结合RAGE损伤冠状动脉平滑肌细胞K_v通道。     

晚期糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞增殖影响的实验研究

目的：研究晚期糖基化终产物（Advanced Glycation end Products,AGEs）对体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs）增殖的影响。方法：组织贴块法培养大鼠VSMCs,给予不同浓度AGE-牛血清白蛋白（AGE-BSA）连续处理VSMCs 168 h（7 d）,每24 h采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,绘制细胞生长曲线,计算细胞增殖促进率。结果：80 mg/L终浓度的AGE-BSA在培养72、961、20 h,10、20、40 mg/L终浓度的AGE-BSA在培养96、120、1441、68 h均可显著促进细胞增殖（P〈0.05） 40 mg/L终浓度的AGE-BSA在培养96 h时细胞增殖促进率最大（72.1%）。结论：AGEs具有促进VSMCs增殖作用,这一作用在一定范围内具有剂量依赖性。     

MiRNA-26a通过调控结缔组织生长因子缓解血管平滑肌细胞的钙化

目的 探究miRNA-26a调控结缔组织生长因子对血管平滑肌细胞钙化的作用。方法 将细胞分为对照组、模型组、模型+AR234960组、AR234960+miR-26a mimic组和miR-26a mimic组。对照组细胞正常培养基培养,模型组VSMC细胞诱导钙化,模型+AR234960组的VSMC细胞诱导钙化后加入AR234960激动剂干预,AR234960+miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后用AR234960激动剂和miR-26a mimic处理,miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后转染miR-26a mimic。茜素红染色测定各组细胞钙化沉积;试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）活性;荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞miR-26a、OPG、OPN、BMP-2、Collagen II基因和蛋白表达情况。双荧光素酶基因验证miR-26a与CTGF的结合。结果 平滑肌A7r5细胞钙化后,miR-26a的表达随着钙化时间的增加而降低（P<0.05）,而CTGF的表达随钙化时间的增加而增加（P<0.05）。茜素红染色结果显...     

SCAP/SREBP2/LDLr通路在LPS诱导人血管平滑肌细胞泡沫化中的作用

目的：研究炎症介质——脂多糖（LPS）是否通过扰乱固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白-固醇调节元件结合蛋白2（SCAP-SREBP2）复合物介导的低密度脂蛋白受体（LDLr）负反馈调控,增加人血管平滑肌细胞对天然低密度脂蛋白胆固醇（LDL）摄取,导致泡沫细胞形成。方法：人血管平滑肌细胞在无血清培养基中培养24 h后,分为对照组（继续无血清培养）;高脂组（加入LDL负荷,终浓度为25μg/ml）;高脂加LPS组（加入LDL负荷,终浓度为25μg/ml,同时加入LPS,终浓度400 ng/ml）;高脂加LPS加肝素组（加入LDL负荷,终浓度为25μg/ml,加入LPS,终浓度400 ng/ml,加入肝素,终浓度5 mg/ml）,以上各组细胞培养24 h后收获。酶化学法检测细胞内胆固醇浓度,油红O染色法检测细胞内脂质水平,Real time PCR法检测LDLr、SREBP2表达水平,细胞免疫化学法检测SCAP蛋白表达,激光共聚焦检测SCAP在内质网与高尔基体间的转位情况。结果：细胞内胆固醇测定及油红O染色发现,LPS通过增加人血管平滑肌细胞对非修饰LDL摄取,导致人血管平滑肌细胞转变为泡沫细胞。在LPS不存在时,25μg/ml LDL减少LDLr mRNA水平（P〈0.05）。然而,LPS增加LDLr mRNA水平,逆转25μg/ml LDL对LDLr的抑制效应,不恰当的增加了血管平滑肌细胞对LDL摄取（P〈0.05）,LPS刺激也导致了SCAP蛋白表达增加和SREBP2的mRNA水平升高（P〈0.05）,同时促进了SCAP从内质网转移到高尔基体。这些结果提示LPS通过增加SCAP/SREBP2复合物从内质网到高尔基体转位,干扰了胆固醇介导的LDLr负反馈调控,使非修饰LDL在血管平滑肌细胞内堆积,导致泡沫细胞形成。结论：本研究提示,在LPS刺激条件下,SCAP/SREBP2/LDLr通路可能是血管平滑肌细胞泡沫化的另一条通路。