内脂素对THP-1源性巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1表达的影响

目的：观察内脂素（visfatin）对人单核细胞株THP-1源性巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）表达的影响,探讨visfatin诱导THP-1源性泡沫细胞形成的机制。方法：THP-1单核细胞诱导分化为巨噬细胞,予不同浓度和时间的visfatin进行干预,分别运用油红O染色观察细胞浆脂滴变化,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测各组细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达,酶荧光学法检测细胞内总胆固醇（TC）和游离胆固醇（FC）含量,TC与FC之差为胆固醇酯（CE）含量。结果：与对照组比较,visfatin干预组细胞浆脂滴明显增多,细胞内FC和CE含量增加（均P<0.05）。Visfatin呈浓度和时间依赖性地下调ABCA1 mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结论：Visfatin下调THP-1源性巨噬细胞ABCA1的表达,使细胞内FC流出减少,CE合成增加,从而诱导泡沫细胞的形成。     

Ghrelin对THP-1源性泡沫细胞ATP结合盒转运子A1和G1表达的调控作用

目的： 研究单核/巨噬细胞分化成为泡沫细胞过程中ghrelin对人ATP结合盒转运子A1和G1（ABCA1/ABCG1）表达的调控作用。方法: 体外培养人源单核细胞系THP-1,由佛波酯（PMA）作用使其分化为巨噬细胞,后者可在氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）存在条件下进一步转变为泡沫细胞。巨噬细胞加入不同浓度的Ghrelin预孵2 h后再加入ox-LDL作用不同时间,油红O染色法观察细胞内脂滴含量,运用PT-PCR法检测ABCA1和ABCG1 mRNA水平,Western blotting法检测ABCA1和ABCG1蛋白表达,采用酶法,通过荧光分光光度计检测细胞内外胆固醇含量并计算胆固醇流出率。结果: Ghrelin干预可明显减少细胞内脂滴的形成,显著增加胆固醇流出率,并能显著增加单核/巨噬细胞泡沫化过程中ABCA1和ABCG1 mRNA 水平和蛋白表达,且此作用呈浓度依赖性而不呈时间依赖性。结论: Ghrelin可能通过上调ABCA1和ABCG1转录翻译水平延缓动脉粥样硬化的发生。     

Ghrelin对THP-1细胞泡沫化过程中酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1表达的影响

目的： 研究单核/巨噬细胞分化成为泡沫细胞过程中ghrelin对人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT-1)表达以及细胞内胆固醇酯的影响。方法: 体外培养人源单核细胞系（THP-1）,由佛波酯（PMA）作用使其分化为巨噬细胞,后者可在氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）存在条件下进一步转变为泡沫细胞。巨噬细胞加入不同浓度的ghrelin预孵2 h后再加入ox-LDL,油红O染色法观察细胞内脂滴含量,运用RT-PCR法检测ACAT-1 mRNA水平,Western blotting法检测ACAT-1蛋白表达,采用酶法,通过荧光分光光度计检测细胞内胆固醇酯含量。结果: Ghrelin可明显减少THP-1源性泡沫细胞内脂滴的形成,显著降低细胞内胆固醇酯含量,并能显著降低单核/巨噬细胞泡沫化过程中ACAT-1 mRNA 水平和蛋白表达,且此干预作用呈浓度依赖性。结论: Ghrelin可能通过ACAT-1转录翻译水平的下调延缓动脉粥样硬化的发生。     

花青素对小鼠巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响

目的：研究植物化学物质花青素对小鼠巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响，探讨花青素促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流的分子机制。方法： 制备乙酰化低密度脂蛋白（AcLDL），以其负载小鼠腹腔巨噬细胞形成巨噬泡沫细胞，观察不同浓度花青素Cy-3-G和Pn-3-G对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响以及调节胆固醇外流有关的基因过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）表达的情况。结果：AcLDL可促进胆固醇在巨噬细胞中大量蓄积，造成泡沫细胞的形成。花青素Cy-3-G和Pn-3-G能引起巨噬泡沫细胞内胆固醇的大量外流，并且增加PPAR-γ基因的表达。结论：花青素Cy-3-G和Pn-3-G促进胆固醇外流的作用与其增加PPAR-γ基因的表达有关。     

Sortilin调控ABCA1蛋白水平影响荷脂巨噬细胞内脂质流出

目的　探讨Sortilin对荷脂THP-1巨噬细胞ABCA1蛋白表达及胞内脂质流出的影响。 方法　采用Western blot和qRT-PCR检测细胞内ABCA1蛋白和mRNA表达水平；Co-IP实验检测Sortilin和ABCA1的结合情况；高效液相色谱法检测细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯含量变化；油红O染色观察细胞内脂滴情况。 结果　Sortilin下调细胞内ABCA1蛋白水平，但对其mRNA水平无显著影响；Co-IP结果表明Sortilin能与ABCA1结合；与对照组相比，Sortilin过表达后荷脂巨噬细胞内胆固醇流出减少，胞内脂质含量增加且脂滴肥大，数量明显增多，Sortilin沉默后荷脂巨噬细胞胆固醇流出增加，胞内脂质含量减少，脂滴瘦小，数量减少；溶酶体抑制剂氯喹共处理可部分逆转Sortilin过表达对巨噬细胞ABCA1蛋白和胆固醇流出的抑制作用。 结论　Sortilin下调巨噬细胞ABCA1蛋白水平，抑制胆固醇流出，促进胞内脂质蓄积。     

核因子κB活化与THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的关系

目的：探讨核因子κB活化对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ATP结合盒转运子A1（ABCA1）基因表达的影响。方法：体外培养THP-1细胞并构建泡沫细胞模型，使用肿瘤坏死因子α（TNF-α）和NF-κB活化抑制剂对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲基甲酮（N-α-tosyl-L-phenylalanine chloromethy ketone，TPCK）孵育细胞，以RT-PCR法和Western blot法测定THP-1源性泡沫细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达情况，借助Sandwich ELISA法观察核因子κB活化／核易位情况。结果：TNF-α可即刻激活NF-κB，并导致干预24小时后泡沫细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达下调；若预先用TPCK孵育，则TPCK可抑制TNF-α对NF-κB的激活，且24小时后泡沫细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达下调幅度减小；TPCK延迟孵育则对TNF-α的效应抑制不显著。结论：炎症因子TNF-α可即刻激活NF-κB信号途径，早期活化的NF-κB可阻遏THP-1源泡沫细胞ABCA1基因和蛋白的表达，影响泡沫细胞内胆固醇的流出。     

甲基莲心碱对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响

目的探讨甲基莲心碱(Nef)对巨噬泡沫细胞形成的作用及机制。方法采用体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,ox-LDL诱导建立泡沫细胞模型,用Nef进行干预。油红O染色观察细胞内脂质堆积情况,酶比色法定量细胞内总胆固醇和胆固醇酯的变化,免疫荧光和流式细胞术分析CD36受体蛋白表达,RT-PCR检测CD36受体mRNA表达。结果与ox-LDL诱导组相比,Nef保护组巨噬细胞的油红O染色阳性细胞数和细胞内脂质含量均显著减少;同时CD36受体蛋白和mRNA表达明显降低。结论Nef可抑制ox—LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化,该作用可能与Nef下调巨噬细胞CD36受体表达,从而减弱巨噬细胞对ox—LDL的摄取有关。     

Sortilin调控ABCA1蛋白水平影响荷脂巨噬细胞内脂质流出

目的　探讨Sortilin对荷脂THP-1巨噬细胞ABCA1蛋白表达及胞内脂质流出的影响。 方法　采用Western blot和qRT-PCR检测细胞内ABCA1蛋白和mRNA表达水平;Co-IP实验检测Sortilin和ABCA1的结合情况;高效液相色谱法检测细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯含量变化;油红O染色观察细胞内脂滴情况。 结果　Sortilin下调细胞内ABCA1蛋白水平,但对其mRNA水平无显著影响;Co-IP结果表明Sortilin能与ABCA1结合;与对照组相比,Sortilin过表达后荷脂巨噬细胞内胆固醇流出减少,胞内脂质含量增加且脂滴肥大,数量明显增多,Sortilin沉默后荷脂巨噬细胞胆固醇流出增加,胞内脂质含量减少,脂滴瘦小,数量减少;溶酶体抑制剂氯喹共处理可部分逆转Sortilin过表达对巨噬细胞ABCA1蛋白和胆固醇流出的抑制作用。 结论　Sortilin下调巨噬细胞ABCA1蛋白水平,抑制胆固醇流出,促进胞内脂质蓄积。     

溶血卵磷脂对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响

目的：探讨溶血卵磷脂（LPC）对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响，为动脉粥样硬化（AS）的防治研究提供理论依据。方法：分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，密度梯度超速离心法分离人血浆低密度脂蛋白（LDL），乙酰化后形成乙酰化低密度蛋白（AcLDL),用AcLDL负载巨噬细胞使之形成巨噬泡沫细胞模型。用酶学荧光法检测细胞胆固醇外流，用乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测培养基中LDH活性来反映LPC的细胞毒性。结果：LPC处理巨噬泡沫细胞24h后，培养基中胆固醇含量明显高于对照组（1．7－4倍），细胞内胆固醇含量明显低于对照组。且LPC引起细胞胆固醇外流增加同时，培养基中LDH活性并没有明显差异。结论：在10－80μmol/L剂量范围内，LPC可以剂量依赖性地促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流，且这一效应与LPC的细胞毒性之间没有关系。     

可溶性Klotho蛋白抑制THP-1源性泡沫细胞形成

目的:探讨可溶性Klotho(KL)蛋白对THP-1源性泡沫细胞形成的影响。方法:THP-1单核细胞与160 nmol/L佛波酯孵育48 h后,诱导分化为THP-1源性巨噬细胞,给予THP-1源性巨噬细胞不同浓度(25、50、100和200μg/L)的可溶性KL蛋白预处理后,再由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导其转变为泡沫细胞。油红O染色观察细胞内脂滴形成情况,通过液体闪烁计数法测定THP-1源性泡沫细胞内胆固醇流出情况,酶荧光法检测细胞内游离胆固醇及胆固醇酯的含量,并分别用Western blot法及RT-qPCR法检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)和ATP结合盒转运体A1(ABCA1)的蛋白及mRNA表达。结果:可溶性KL蛋白能增加THP-1源性巨噬细胞内胆固醇流出,抑制THP-1源性泡沫细胞形成,且可溶性KL蛋白呈一定浓度依赖性地抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成过程中ACAT1表达的上调和ABCA1表达的下调(P<0.05)。结论:可溶性KL蛋白能够抑制THP-1源性泡沫细胞形成,其机制可能与靶向调控细胞内ACAT1和ABCA1的表达有关。     

miRNA-33对Hcy干预RAW264.7巨噬细胞衍生的泡沫细胞表达ABCA1/ABCG1的影响

目的:研究同型半胱氨酸(Hcy)是否通过微小RNA-33 (miRNA-33)抑制三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)和三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1)的表达,从而降低胆固醇逆转运(RCT)效率。方法:复制RAW264.7巨噬细胞经氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导为泡沫细胞的模型,油红O染色确定模型是否复制成功,用LipofectamineTM2000将miRNA-33 mimics和miRNA-33 inhibitor分别转染入细胞内,再给予5 mmol/L的Hcy干预24 h后进行实验;用油红O染色观察细胞内脂滴情况;real-time PCR和Western blot检测ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表达水平;液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇流出率;高效液相色谱分析细胞内胆固醇含量。结果:(1)与空白对照组相比,miRNA-33 mimics组细胞内脂滴含量增加,ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表达量降低(P 0.05),细胞内胆固醇含量逐渐增加(P 0.05),细胞内胆固醇流出率逐渐减少(P 0.05);(2)与空白对照组相比,miRNA-33 inhibitor组检测结果与miRNA-33 mimics组的结果相反,差异具有统计学意义(P 0.05);(3)空白对照组、miRNA-33 mimics-NC组和miRNA-33 inhibitor-NC组3组间相比,所有检测结果的差异均无统计学显著性。结论:Hcy可间接通过诱导miRNA-33表达而抑制ABCA1和ABCG1的蛋白表达,降低RCT效率。     

血管紧张素-(1-7)通过AC-cAMP途径增加THP-1源性泡沫细胞ABCA1的表达并减少细胞胆固醇含量

目的: 构建THP-1源性泡沫细胞模型,探讨血管紧张素-(1-7) 和腺苷酸环化酶抑制剂MDL对THP-1源性泡沫细胞胆固醇逆转运相关蛋白——ATP结合盒转运子A1(ABCA1)表达和胆固醇含量的影响。方法: 将THP-1源性单核细胞诱导为巨噬细胞,加入氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)建立泡沫细胞模型。实验分为4组:正常泡沫细胞组、MDL组、Ang-(1-7)组和MDL+Ang-(1-7)组。处理24 h后,分别通过ELISA法、荧光定量PCR法和Western blotting检测各组细胞cAMP表达水平、ABCA1 mRNA相对表达量和蛋白含量,闪烁计数法检测各组细胞胆固醇流出率,高效液相色谱法检测各组细胞胆固醇含量。结果: (1)Ang-(1-7)组cAMP表达水平、ABCA1 mRNA相对表达量和蛋白含量较泡沫细胞组有明显升高(P<0.05),胆固醇流出率较泡沫细胞组明显增高(P<0.05),胆固醇含量较泡沫细胞组显著降低(P<0.05)。(2)MDL组cAMP表达水平、ABCA1 mRNA相对表达量和蛋白含量较泡沫细胞组有明显降低(P<0.05),胆固醇流出率较泡沫细胞组明显降低(P<0.05),胆固醇含量较泡沫细胞组增高(P<0.05)。(3)MDL+Ang-(1-7)组数值介于Ang-(1-7)组与泡沫细胞组之间。结论: (1)Ang-(1-7)能促进泡沫细胞ABCA1的表达增加,促进胆固醇外流,减少泡沫细胞胆固醇含量,逆转泡沫细胞的形成。(2) MDL可以抑制腺苷酸环化酶的活性,减少cAMP的生成,从而部分拮抗Ang-(1-7)的上述作用,但不能完全阻断Ang-(1-7)的作用。     

血管紧张素Ⅱ对THP-1源性泡沫细胞ATP结合盒转运子A1的影响

目的： 以THP-1源性泡沫细胞为研究对象，探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对THP-1源性泡沫细胞ATP结合盒转运子A1(ABCA1)表达、细胞内胆固醇含量及胆固醇流出的影响。方法: 运用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）和Western blotting分别检测AngⅡ对ABCA1 mRNA与ABCA1蛋白表达的影响，采用酶法，通过荧光分光光度计检测细胞内胆固醇含量，应用液体闪烁计数仪检测胆固醇流出的变化。结果: AngⅡ能引起THP-1源性泡沫细胞胆固醇含量显著升高(P<0.05)、ABCA1表达显著减少（P<0.05），AngⅡ受体拮抗剂厄贝沙坦（Irb）能显著减少细胞内胆固醇含量(P<0.05)、促进细胞内胆固醇流出及减轻AngⅡ对ABCA1的抑制作用(P<0.05)。结论: AngⅡ有通过其受体抑制ABCA1表达，促进泡沫细胞形成，加速动脉粥样硬化的作用。     

载脂蛋白A-Ⅰ对三磷酸腺苷结合盒转运体A1的影响

目的：以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象，观察载脂蛋白A-I对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的影响,从而探讨载脂蛋白A-I对动脉粥样硬化(As)发生发展的影响。方法:用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出, 高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量, 运用逆转录-多聚酶链反应和Western 印迹分别检测ABCA1 mRNA 与ABCA1蛋白的表达,用流式细胞术检测细胞平均ABCA1荧光强度。 结果:载脂蛋白A-I引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞总胆固醇、游离胆固醇与胆固醇酯呈时间依赖性减少, 而ABCA1蛋白质水平、细胞平均ABCA1荧光强度以及细胞内胆固醇流出呈时间依赖性增加,但ABCA1 mRNA没有明显变化。巯基蛋白酶抑制剂(leupeptin 和ALLN)增加ABCA1蛋白质水平,而其它蛋白酶抑制剂(pepstatin A、aprotinin及phosphoramiddon)不增加ABCA1蛋白质水平,蛋白体抑制剂(lactacytin)和溶酶体抑制剂(NH4Cl)也不影响ABCA1蛋白质水平。 结论:巯基蛋白酶可降解THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质,而载脂蛋白A-I可阻碍巯基蛋白酶降解ABCA1蛋白质,从而提高THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1 蛋白质水平, 增加细胞内胆固醇流出, 降低细胞内胆固醇聚积。     

黄芪甲苷通过调控miR-33a及ABCA1信号发挥抗动脉粥样硬化作用

目的:观察黄芪甲苷是否通过调控微小RNA-33a(miR-33a)而影响下游信号三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达,促进巨噬细胞内胆固醇流出,从而研究黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的作用机制。方法:体内实验:采用HE染色检测各组小鼠主动脉横截面病理损伤程度real-time PCR和Western blot分别检测小鼠主动脉ABCA1的mRNA和蛋白表达。体外实验:建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,然后用黄芪甲苷含药SD大鼠血清处理,采用real-time PCR检测细胞miR-33a表达;细胞随机分为空白血清组、黄芪甲苷含药血清组及黄芪甲苷含药血清+miR-33a mimic处理组,real-time PCR和Western blot法检测细胞ABCA1的mRNA和蛋白表达,油红O染色和高效液相色谱法检测细胞内脂质含量,[3H]法检测细胞内胆固醇流出。结果:体内实验显示,黄芪甲苷组小鼠血管各层结构正常,排列整齐,局部有小灶性的钙化颗粒物沉积,病变轻,斑块小,泡沫细胞和脂质减少,弹力板基本完整,病变程度明显轻于模型组。与模型组相比,黄芪甲苷组小鼠主动脉的miR-33a表达量降低,ABCA1 mRNA和蛋白相对表达量均升高(P 0. 05)。体外实验显示,在不影响THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞活性的情况下,黄芪甲苷含药血清能明显上调ABCA1的mRNA和蛋白表达,但能被转染miR-33 mimic抑制;黄芪甲苷含药血清可减少细胞中的脂质蓄积,但能被细胞中转染miR-33 mimic所弱化;黄芪甲苷减少细胞内胆固醇蓄积与其促进细胞内胆固醇流出有关,细胞中转入过量miR-33a可以抑制胆固醇流出。结论:黄芪甲苷可通过减少miR-33a的生成,进而上调ABCA1表达,促进巨噬细胞中胆固醇流出,这可能是黄芪甲苷抗动脉粥样硬化作用的分子机制之一。     

肥大细胞改变THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇含量及抑制胆固醇流出

目的：以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象，探讨肥大细胞（MC）对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量、分配和流出的影响及机制。方法： THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞在MC颗粒释放物存在或缺乏下与高密度脂蛋白3（HDL₃）共育。高效液相色谱检测泡沫细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和酯化胆固醇(EC)含量，用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出，运用逆转录聚合酶链反应检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的mRNA水平，采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测HDL₃及apoA-Ⅰ的降解。结果： MC组泡沫细胞内TC、FC明显高于对照组（TC对照组为527.3 mg/g，MC组为917.9 mg/g）；EC/TC比值低于对照组（7.6% vs 47.5%）；细胞内胆固醇流出少于对照组(26.92％±2.6％ vs 40.98％±3.4％,P<0.05)；而泡沫细胞ABCA1的mRNA水平与对照组无明显差异。MC颗粒释放物处理HDL₃后，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，约有28%的apoA-Ⅰ被降解，在分子量26 kD左右处出现了新的条带，产生了1个26 kD的小多肽。结论：肥大细胞可通过降解HDL₃及apoA-Ⅰ抑制细胞内胆固醇流出而增加细胞内胆固醇蓄积，这个作用与ABCA1表达无直接关系。