Bcl-xl/LipofectamineTM2000比值对人角膜基质细胞转染效率的影响

目的检测Bclxl/LipofectamineTM2000复合物中两者比值对转染人角膜基质细胞转染效率的影响,探讨其用于人角膜基质细胞基因转染的最佳比值。方法选择Bclxl/LipofectamineTM2000比值1∶2、1∶4、1∶8、1∶10四个实验组制备载体复合物转染人角膜基质细胞,转染时间24h。在转染后3d,采用半定量RTPCR检测目的基因Bclx1mRNA表达的变化;采用免疫组织化学染色法及流式细胞计数法检测目的基因Bclx1表达阳性细胞率。数据采用SPSS软件分析。结果Bclxl/LipofectamineTM2000载体复合物中两者比值能显著影响其对人角膜基质细胞的转染效率,存在最佳的比值。当Bclxl/LipofectamineTM2000比值为1∶8时,培养的人角膜基质细胞获得了最佳的转染效率。转染后3d,定量PCR显示1∶8组mRNA表达水平高于其他组(P<0.05),Bclx1免疫组化染色及流式细胞计数法均显示1∶8组转染效率最高,阳性细胞率为(45.6±2.0)%(免疫组织化学染色法),(48.3±3.0)%(流式细胞计数法)(P<0.05)。结论LipofectamineTM2000能有效介导外源基因Bclxl转染人角膜基质细胞。Bclxl/LipofectamineTM2000载体复合物比值为1∶8时转染效率最高。     

8型重组腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因在角膜基质细胞中的表达及影响

目的:评价8型重组腺相关病毒(rAAV8)介导增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染角膜基质细胞后的表达及对细胞增殖的影响。方法:以不同MOI的rAAV8-EGFP转染大鼠角膜基质细胞,转染后以倒置荧光显微镜观察角膜基质细胞中GFP的表达,流式细胞仪分析角膜基质细胞中rAAV8-EGFP表达的阳性率。MTT法分别检测rAAV8和rAAV8-EGFP转染对角膜基质细胞增殖的影响。结果:倒置荧光显微镜观察rAAV8-EGFP转染角膜基质细胞后GFP的阳性表达7d达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV8-EGFP对角膜基质细胞的转染效率分别为31.5%(MOI=5×103),42.5%(MOI=5×104),54.8%(MOI=5×105);MTT检测结果显示rAAV8及rAAV8-EGFP转染对角膜基质细胞增殖均无明显影响。结论:rAAV8-EGFP能有效地转染角膜基质细胞,并且对细胞增殖无明显影响。     

阳离子脂质体介导的p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响

目的 探讨阳离子脂质体介导的外源标志基因LacZ转染人角膜基质细胞的有效性和安全性及p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响。方法 （1）利用阳离子脂质体lipofectamine^TM reagent介导的外源标志基因LacZ的质粒DNA转染人角膜基质细胞,行X－gal染色,确定转染率;（2）利用免疫细胞化学和四甲基偶氮唑盐法,观察阳离子脂质体lipofectamine^TM reagent介导p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响;（3）用0．5％锥虫蓝染色观察各组细胞活性率。结果 阳离子脂质体lipofectamin^TM reagent可介导含标志基因LacZ的质粒DNA对人角膜基质细胞的转染,在1：4和1：8两组中均观察到转染率随转染时间延长而增高,随观察时间延长而降低,在质粒DNA／脂质体比例为1：8,转染时间为24h,观察2d时达高峰,为40．5％;阳离子脂质体lipofectamine^TM reagent介导外源p21WAF1基因转染可提高人角膜基质细胞中p21蛋白的表达,并抑制该细胞的增殖;0．5％锥虫蓝染色显示各组细胞活性率均≥90％,未见明显细胞毒性。结论 阳离子脂质体可介导外源目的基因对人角膜基质细胞安全、相对高效的转染;其介导的p21WAF1基因转染可抑制人角膜基质细胞的增殖;并无明显细胞毒性反应。     

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的:探讨血清1型腺相关病毒(rAAV1)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达及转染率。方法:采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒(rAAV1-EGFP)感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型,用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h,再用此缝线间断缝合,将植片移植到大鼠角膜植床,术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果:按rAAV1-EGFP不同转染倍数(MOI)转染角膜基质细胞。转染后3d,在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达;随MOI值的增高而增强,转染后7~9d达到高峰,此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率,MOI=103时是16.3%,MOI=104时是30.3%,MOI=105时是43.6%,MOI=106时是47.5%。rAAV1-EGFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论:rAAV1-EGFP可以在体内外稳定、有效转染大鼠角膜基质细胞,是角膜基质细胞理想的报告基因。     

真核基因重组Sox2及其在小鼠角膜基质细胞中的表达

目的 基因重组构建具有穿膜活性的核转录因子Sox2真核表达系统,将其转染至小鼠角膜基质细胞,检测其在小鼠角膜基质细胞中的表达.方法 利用重叠延伸PCR法重组目的基因Sox2-PTD构建质粒,测序检测重组DNA序列是否克隆正确.确定正确序列后将其转染至小鼠角膜基质细胞.倒置显微镜下观察细胞生长情况,转染后约10 d免疫荧光化学鉴定其表达.结果 成功构建质粒PCDNA3.1-Sox2-PTD;4个转录因子测序结果显示:Sox2基因测序结果与基因模板序列100％一致;成功转染至小鼠角膜基质细胞中;荧光显微镜下观察可见,Sox2-PTD在细胞浆和细胞核内均有表达,主要分布在细胞核内.结论 成功构建核转录因子的真核表达系统,可转染至小鼠角膜基质细胞并引起细胞形态和表型的变化,为真核重组外源蛋白诱导角膜基质细胞转化为多能干细胞奠定基础.     

脂质体介导兔角膜内皮细胞基因转染的观察

目的观察阳离子脂质体Lipofectamine2000能否介导目的基因转移至兔角膜内皮细胞内及脂质体潜在的毒副作用。方法RT-PCR检测特异性胶原Ⅷ进行细胞鉴定,通过体外细胞转染实验优化阳离子脂质体与质粒DNA的浓度和比例,选择Lipo-fectamine^TM 2000/pEGFP-N1比值3∶1,脂质体体积分别为0μL、6μL、9μL、12μL转染兔角膜内皮细胞,荧光显微镜观察目的基因的表达,透射电镜观察细胞超微结构。结果RT-PCR扩增得到单一产物,与预期的扩增序列大小完全一致,角膜内皮细胞内可见脂质体介导的绿色荧光蛋白表达,Lipofectamine^TM 2000浓度能显著影响其对兔角膜内皮细胞的转染效率,存在最佳浓度,在35mm培养皿中,3μg DNA与9μL脂质体转染效率最高,透射电镜显示12μL脂质体可导致细胞器出现肿胀、崩解现象。结论阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至角膜内皮细胞内,在35mm培养皿中,12μL脂质体对角膜内皮细胞有一定的毒副作用。     

反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞增生的影响

目的探讨反义cyclinD1基因转染后人角膜基质细胞增生的改变。方法人角膜组织来源于北京大学第一医院眼库体外培养人角膜基质细胞,采用第2代或第3代细胞用于实验。利用阳离子脂质体lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染入体外培养的人角膜基质细胞。同时设非转染组（以PBS代替cyclinD1质粒及lipofectamine）及lipofectamine转染组（以PBS代替反义cyclinD1质粒）作为对照。应用免疫细胞化学法观察lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白表达的影响,应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法观察其对人角膜基质细胞增生的影响,并用质量分数0.5%锥虫蓝染色观察活细胞比率。结果非转染组和lipofectamine转染组均有大量人角膜基质细胞的细胞核cyclinD1染色呈棕褐色,反义cyclinD1转染组只有少量人角膜基质细胞细胞核cyclinD1染色呈棕褐色。与非转染组和lipofectamine转染组比较,反义cyclinD1转染组在转染后2、6、10dcyclinD1蛋白在培养的人角膜基质细胞中的表达明显降低,差异均有统计学意义（t=6.050、t=5.180、t=5.040,P〈0.01;t=6.190、t=5.670、t=5.010,P〈0.01）,而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义（t=1.120、t=1.310、t=1.010,P〉0.05）。转染后2、6、10d,反义cyclinD1转染组人角膜基质细胞的A570值分别低于非转染组和lipofectamine转染组,差异均有统计学意义（t=5.830、t=5.210、t=4.920,P〈0.01;t=5.130、t=5.010、t=4.850,P〈0.01）,说明抑制了基质细胞的增生,而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义（t=1.110、t=1.230、t=1.120,P〉0.05）。0.5%锥虫蓝染色显示各组活细胞比率均在90%以上,未见明显的细胞毒性。结论阳离子脂质体介导的反义cyclinD1基因转染在转染后一定时间内可降低人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白的表达,抑制人角膜基质细胞的增生,未见明显细胞毒性,为角膜基质过度愈合反应的基因治疗奠定了基础。     

阳离子聚合物介导下白细胞介素1受体拮抗剂基因兔角膜原位转染及其表达

目的 探讨阳离子聚合物即线性聚乙烯亚胺（PEI）介导下兔角膜基质注射PEGFP-IL-1ra质粒进行基因角膜原位转染的有效性和安全性。方法 以人cDNA文库为模板进行聚合酶链反应（PCR）,获得人IL-1ra cDNA片段,构建重组质粒PEGFP-hIL-1ra。以阳离子聚合物为介导转染角膜内皮细胞,通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪、蛋白免疫印迹技术检测转染后IL-1ra基因和蛋白的表达。实验组30只Wistar大鼠角膜基质注射PEGFP-hIL-1ra质粒和PEI-in-vivo的混合溶液20μl（含10μg质粒）,对照组15只Wistar大鼠角膜基质注射PEI-in-vivo溶液20μl。注射后1、3、6、14、21d,收集角膜通过HE染色、透射电镜、锥虫蓝-茜素红染色、免疫组织化学观察IL-1ra基因角膜原位转染后的细胞结构和功能的变化。荧光显微镜下追踪IL-1ra-GFP融合蛋白在角膜的表达部位和表达强度。结果 以cDNA文库为模板扩增出hIL-1ra cDNA片段,构建重组质粒PEGFP-hIL-1ra。经PstⅠ和BamHI酶切及DNA测序证实了插入片段方向和大小正确。PEI-in-vitro介导下PEGFP-hIL-1ra转染角膜内皮细胞12h后,可见10％～15％细胞中有GFP荧光表达。Western-blotting检测可见相对分子质量为44000的hIL-1ra-GFP蛋白表达。PEGFP-hIL-1ra质粒和PEI-in-vivo角膜基质注射后1d,角膜上皮基底细胞可见荧光条带,6d时全角膜荧光强度达到高峰,14d开始减弱,21d角膜上皮层尚存微弱荧光。对照组观察期内始终未见绿色荧光。实验组角膜HE染色未见病理性改变,角膜上皮基底细胞层p63抗体阳性;锥虫蓝-茜素红联合染色未见角膜内皮细胞损伤;透射电镜显示角膜各层细胞的细胞质内可见IL-1ra-GFP颗粒,未见细胞器的损害。结论 阳离子聚合物介导下角膜基质注射PEGFP-hIL-1ra质粒可快速、有效地将IL-1ra基因转入角膜并表达,为临床上使用抗炎细胞因子IL-1ra对角膜免疫炎性反应相关疾病进行基因治疗提供了新的技术平台。（中华眼科杂志,2006,42：686-693）     

脂质体介导外源基因体外转染兔角膜内皮细胞条件的优化

目的:观察阳离子脂质体LipofectamineTM 2000是否能介导目的基因转移至兔角膜内皮细胞,并优化转染条件。方法:体外培养兔眼角膜内皮细胞,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,通过体外细胞转染实验,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件,荧光显微镜观察目的基因的表达。结果:角膜内皮细胞内可见脂质体介导的绿色荧光蛋白表达,LipofectamineTM在细胞融合度为80%~90%,脂质体/DNA为3L/g,脂质体的量为1.8μL,转染时间为5h时,转染效率最高。结论:阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至角膜内皮细胞内,GFP可作为报告基因优化脂质体转染条件。     

组织因子途径抑制物2对角膜基质细胞表达MMPs的影响

目的:探讨组织因子途径抑制物(TFPI-2)与体外角膜基质细胞基质金属蛋白酶(MMPs)表达的关系。方法:体外兔角膜基质细胞原代、传代培养;脂质体介导人类TFPI-2真核表达载体pBos-Cite-neo/TFPI-2转染基质细胞,G418筛选阳性细胞,RT-PCR和Western-blot技术检测转染前后三组角膜基质细胞(转染TFPI-2基因组K-TFPI-2、转染空载体组K-V、未转染组K-P)中TFPI-2mRNA以及相应蛋白质的表达水平;利用明胶酶谱法分析比较转染前后三组角膜基质细胞表达MMPs的活性差异。结果:K-TFPI-2组角膜基质细胞TFPI-2mRNA和蛋白质的表达较K-P和K-V组显著上调(mRNA:0.79±0.02vs0.51±0.03和0.48±0.02,P=0.000和P=0.000;蛋白质:24.5±0.8vs15.5±0.5和14.9±0.9,P=0.000和P=0.000);与K-P和K-V组相比,K-TFPI-2组细胞表达MMP-1,2的活性下降(MMP-1:12.3±0.7vs16.7±1.2和15.9±0.7,P=0.001和P=0.003;MMP-2:15.4±1.3vs18.2±1.1和17.8±1.1,P=0.027和P=0.046)。结论:TFPI-2表达可明显抑制角膜基质细胞表达MMPs的活性,为进一步开展角膜新生血管性疾病的基因治疗提供实验依据。     

Mechanical corneal epithelium scraping and ethanol treatment up-regulate cytokine gene expression differently in rabbit cornea

PURPOSE: To explore inflammation and wound healing in the rabbit eye following topical ethanol treatment or mechanical debridement. METHODS: Seventy-six pigmented rabbit corneas were divided into four groups: mechanical group (n = 33), which received mechanical epithelial debridement; ethanol-30 (n = 18) and ethanol-60 groups (n = 18), which were treated with 20% ethanol for 30 and 60 seconds, respectively; and control group (n = 7), which remained untreated. Corneal epithelial and stromal keratocyte changes were examined with hematoxylin-eosin and terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUPT nick end labeling (TUNEL) staining at 3 hours (day 0) and days 1, 2, 3, 5, and 7. Interleukin (IL)-1alpha, IL-8, monocyte chemotactic protein (MCP-1), and transforming growth factor (TGF)-beta1 expression were examined using real-time polymerase chain reaction. RESULTS: Stromal keratocyte cell death was higher in the mechanical group on day 0 (P = .002) and in the ethanol-60 group on days 3, 5, and 7 (P < .05). Keratocyte cell death was more pronounced in the ethanol-60 group than in the ethanol-30 group. In the mechanical group, IL-1alpha, IL-8, and MCP-1 expression was up-regulated starting on day 0 (P < .05) and returned to baseline on day 5 to 7. TGF-beta1 expression was up-regulated in the mechanical group throughout the experiment (P < .05). In the ethanol-30 and ethanol-60 groups, IL-1alpha expression was up-regulated on day 0, IL-8 expression was slightly up-regulated on day 0, and MCP-1 and TGF-beta1 expression were not up-regulated. CONCLUSIONS: Mechanical epithelial removal initially induces more keratocyte cell death, but deep stromal keratocyte death persists longer with ethanol treatment. In this rabbit model, mechanical epithelial removal upregulated inflammatory cytokines and TGF-beta1 gene expression more than ethanol treatment.     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜M-ller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜M-ller细胞的可行性和区别。方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜M-ller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜M-ller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜M-ller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染M-ller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高。两者比较有统计学意义(P<0.01)。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Mller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜M-ller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Müller细胞的可行性和区别.方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Müller细胞.分别用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜Müller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间.结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白.转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染Müller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高.两者比较有统计学意义(P＜0.01).随后,两者转染效率均逐渐降低.电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Müller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d.结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Müller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长.     

纳米粒子PLGA介导p27kip1基因转染抑制兔RPE细胞增殖的研究

目的:通过聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒子载体介导p27kip1基因转染视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelium,RPE)细胞,观察其对视网膜脱离(retinadetachment,RD)的兔眼RPE增殖的抑制情况。方法:制备p27kip1基因纳米粒子,并进行基因含量的测定。然后制备RD动物模型,应用免疫组织化学法检测PCNA蛋白的表达,蛋白质印迹法检测p27kip1蛋白在各视网膜细胞的表达。结果:p27kip1基因治疗组于7,14,28d的PCNA蛋白表达阳性率较对照组明显低,差异具有统计学意义(P<0.05),表明PCNA蛋白阳性表达受到p27kip1基因纳米粒子的明显抑制。且基因转染组3,7,14d时p27kip1蛋白表达较对照组明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:p27kip1基因有可能作为一个目的基因,借助新兴的基因载体纳米粒子用于抑制RPE细胞增殖的基因治疗。     

增生性玻璃体视网膜病变模型眼内定向 转染报告基因的研究

目的观察目的基因在玻璃体增生膜的表达情况,以探讨基因治疗增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR) 的可行性。方法用β-半乳糖苷酶基因作为报告基因,以逆转录病毒载体携带,直接注入PVR模型眼玻璃体腔中,观察其在PVR 眼各组织表达情况。结果 基因转染后可见玻璃体增生膜组织有转染基因表达,表达主要位于增生膜的表面,而视网膜组织及其它眼组织未见表达。结论逆转录病毒载体用于PVR的基因治疗有靶向性作用,表明PVR基因治疗具有可行性。(中华眼底病杂志,2001,17:224-226)     

大鼠角膜碱烧伤后角膜淋巴管生成及VEGF-C和VEG-FR-3的表达

目的:研究大鼠角膜碱烧伤后角膜淋巴管生成及VEGF-C和VEGFR-3的表达。方法:制作角膜碱烧伤模型,应用免疫组化方法检测正常角膜及烧伤后1,3,5,7,14,21,28d角膜组织中VEGF-C和VEGFR-3的表达,免疫组化LYVE-1(淋巴管内皮特异标记物)染色观察角膜中淋巴管生成情况,电镜观察烧伤后14d角膜新生淋巴管状况。结果:角膜碱烧伤后,VEGF-C和VEGFR-3的表达明显升高,烧伤后3d,角膜中出现淋巴管。结论:角膜碱烧伤后新生淋巴管生成伴VEGF-C和VEGFR-3高表达。