表皮生长因子及其受体对结肠癌干细胞的增殖调控

背景：肿瘤干细胞是肿瘤组织中一小部分具有自我更新、多向分化以及高度增殖能力的肿瘤细胞。研究发现表皮生长因子（EGF）可促进肿瘤干细胞增殖。目的：探讨EGF及其受体（EGFR）在结肠癌干细胞增殖调控中的作用。方法：结肠癌细胞株HT29、HCTll6培养于无血清培养基中,以EGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子（IGF）分别干预细胞。MTT11法检测EGFR抑制剂吉非替尼对结肠癌细胞球细胞的增殖抑制作用,体外实验检测EGFR抑制剂吉非替尼、PDl53035对细胞球形成的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡。体内实验检测结肠癌细胞球和细胞株的成瘤能力,real、timePCR检测两者干细胞标记LGR5、Musashi-1和分化标记CK20表达。结果：EGF组HCT116细胞形成的细胞球数量显著高于空白对照、bFGF、IGF组（P〈0．05）。吉非替尼能抑制HCT116细胞球细胞增殖和细胞球形成,并诱导细胞凋亡,作用呈浓度依赖性。HCT116细胞球成瘤时间较细胞株显著缩短,移植瘤体积显著增大（P〈0．05）。LGR5、Musashi-1在细胞球中的表达显著高于细胞株,而CK20在细胞株中的表达显著高于细胞球（P〈0．05）。结论：EGF对结肠癌细胞株HCTll6、HT29形成细胞球具有促进作用。EGFR抑制剂可抑制结肠痛细胞球增殖并诱导细胞凋亡,相关作用可能与调控LGR5、Musashi-1和CK20表i大有关。     

过表达Bmi-1促进CD133~+CD44~+HCT116结肠癌干细胞发生上皮间质转化

目的探讨Bmi-1促进结肠癌干细胞发生迁移、侵袭的作用及机制。方法常规培养结肠癌HCT116细胞,成球培养基法(SFM)和磁珠分选法(MACS)富集和筛选CD133~+CD44~+HCT116结肠癌干细胞;流式细胞学鉴定结肠癌干细胞CD133和CD44表型,体外平板克隆实验和CCK8法鉴定细胞增殖克隆能力,裸鼠体内成瘤实验鉴定细胞致瘤能力。构建过表达Bmi-1质粒并转染CD133~+CD44~+HCT116结肠癌干细胞,Western blotting验证细胞中Bmi-1、E-cadherin及Vimentin的表达情况。平板划痕实验和Transwell实验评价转染后不同细胞的迁移和侵袭能力。结果 CD133~+CD44~+HCT116结肠癌细胞具有更强的体外克隆增殖能力和体内致瘤能力,可作为结肠癌干细胞研究模型;过表达Bmi-1后促进CD133~+CD44~+HCT116结肠癌干细胞的E-cadherin表达下降,而Vimentin表达上升;过表达Bmi-1后细胞24 h迁移速度为(18.44±0.59)μm/h,明显高于对照组(1.88±0.21)μm/h和普通组(1.92±0.36)μm/h(P0.05),同时其侵袭细胞数(37.67±2.51)也明显高于对照组(9.33±0.58)和普通组(7.67±0.58)(P0.05)。结论 Bmi-1介导CD133~+CD44~+HCT116结肠癌干细胞发生上皮间质转化(EMT)而促进肿瘤侵袭、转移。     

无血清悬浮法培养结肠癌HT29细胞系及肿瘤干细胞样亚群筛选

目的:研究无血清培养基悬浮培养人结肠癌细胞系HT29,筛选并鉴定HT29结肠癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群。方法:通过无血清培养基筛选结肠癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群。应用克隆形成实验、表面标志检测、双苯酰亚胺(Hoechst)33342染色检测来确定培养细胞中肿瘤干细胞比例及其培养后的肿瘤干细胞含量变化。结果:结肠癌细胞系HT29中约50%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由飘浮的细胞球。细胞球可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,分化后细胞与培养储存的HT29细胞形态无明显差异。流式细胞仪检测表面标志,HT29细胞系中CD44+细胞含量为(44.18±2.18)%,而细胞球中CD44+细胞含量为(83.41±11.21)%;双苯酰亚胺33342染色检测提示HT29中侧群(sidepopulation,SP)细胞含量为(3.82±0.08)%,而细胞球中含量明显增高。结论:结肠癌细胞系HT29可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。该细胞系中含有一定比例的具有增殖和自我更新能力的结肠癌干细胞样细胞亚群。表面标志以及双苯酰亚胺33342检测差异提示细胞球中仅部分细胞具有干细胞的功能。     

吲哚美辛对结肠癌细胞成瘤裸鼠作用的蛋白质组学研究

目的研究吲哚美辛对人结肠癌细胞系HCT116成瘤裸鼠蛋白质表达谱的影响，寻找吲哚美辛抗结肠癌作用的相关蛋白。方法应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离吲哚美辛处理组和未处理组HCT116成瘤裸鼠瘤组织的总蛋白，胶体考马斯亮蓝染色，图像扫描获取凝胶电泳图谱后，分析比较两组间差异表达的蛋白质，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得经胶内胰酶酶解的差异蛋白点的肽质指纹图谱，用Mascot软件查询数据库。结果所获双向凝胶电泳图谱分辨率高、重复性好，蛋白质点数约1100，吲哚美辛处理组与未处理组的匹配率分别为96．0％和93．6％。两组间共有31个差异表达蛋白点，吲哚美辛处理组有6个蛋白质点表达上调，25个表达下调。获得18张肽质指纹图，经查询数据库初步鉴定12个蛋白质，多数蛋白与肿瘤增殖、浸润、凋亡和肿瘤免疫等相关，包括半乳糖凝集素-1、膜联蛋白及转录因子等。结论吲哚美辛对HCT116结肠癌细胞成瘤裸鼠的作用可能与多种蛋白直接或间接相关，这些蛋白的研究有助于进一步阐明吲哚美辛抗结肠癌作用机制及肿瘤治疗药物新型靶标的发现。     

结肠癌干细胞的肿瘤形成特征及其临床价值

目的:研究结肠癌干细胞的肿瘤形成价值及其可能的临床价值.方法:对结肠癌干细胞进行无血清培养,以流式细胞仪检测CD133和CD44表达,以5-氟尿嘧啶(5-flurouracil,5-Fu)处理结肠癌干细胞并观察其增殖抑制,对结肠癌干细胞进行动物实验以确定其成瘤特征.结果:Hoechest33342染色后,HT-29干细胞相对于HT-29细胞有明显的核拒染现象;流式细胞仪发现HT-29细胞CD133阳性表达比率为44.6%,C D44阳性表达比率为0.6%;而经过培养提纯后的HT-29干细胞CD133阳性表达比率为92.6%,CD44阳性表达比率为97.8%,C D 1 3 3与C D 4 4阳性表达比率显著提高;HT-29干细胞相对于HT-29细胞对5-Fu有明显的耐药作用,HT-29细胞IC50值为1.394μg/m L,HT-29干细胞的IC50值为13.087μg/m L,IC50值有明显的增高在恢复血清培养后,体外增殖活性明显增强;HT-29干细胞体内生长速度比H T-29细胞体内生长速度显著要缓慢,H T-29细胞的肿瘤体积是HT-29干细胞肿瘤体积的两倍多;HT-29干细胞在小鼠富血管区(腋下和腹股沟淋巴结)的生长速率比皮下生长速率有明显的提高,但与HT-29细胞的生长速率还有明显差距.结论:在结肠癌细胞株存在结肠癌干细胞,通过无血清培养能分离出具有干细胞特征的结肠癌干细胞株,结肠癌干细胞对5-Fu具有耐药性,在适当微环境下其能快速生长,转化为成熟的结肠癌细胞,提示了改变结肠癌干细胞微环境可能是防止肿瘤复发的一个途径.     

肝癌细胞株SMMC7721中CD133＋和CD133-亚群生物学特性的比较

背景：肝癌是常见的恶性肿瘤之一,易复发、转移,术后5年生存率较低。目前肿瘤干细胞学说已成为肿瘤研究的热点．CD133是一种肿瘤干细胞的标记物。目的：比较肝癌细胞株SMMC7721中CD133＋和CD133一亚群的生物学特性差异．并初步探讨CD133＋亚群的干细胞特性。方法：采用免疫磁珠法（MACS）分选SMMC7721细胞中CD133＋和CD133一亚群．以流式细胞术检测CD133表达量,平板克隆形成实验检测CDl33体外增殖能力,裸鼠成瘤实验检测体内致瘤性．CCK-8法检测对5-氟尿嘧啶（5-Fu）的敏感性。结果：MACS分选并培养1周后,CD133＋亚群中CD133表达量明显下降。与CD133-亚群相比．CD133＋亚群的体外克隆形成率明显增高,裸鼠肿瘤的体积明显升高,对5-Fu的敏感性降低．差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论：肝癌SMMC7721细胞中CD133＋亚群较CD133-亚群更具有肿瘤干细胞的特性．     

结肠癌干细胞标志分子及其功能研究现状

结肠癌干细胞是一小部分存在于结肠癌中具有自我更新、无限增殖和多项分化潜能的肿瘤干细胞,它与结肠癌的复发、转移和治疗耐受有着密切的联系.通过结肠癌细胞表面表达的标志分子如CD133、CD44、CD29、ALDH1和Wnt等从结肠癌中分离得到少部分具有干细胞特性的结肠癌细胞即结肠癌干细胞,以这部分肿瘤干细胞作为肿瘤治疗靶点将为肿瘤治疗带来新的治疗方向.此文就标志分子在结肠癌干细胞筛选及生物学中的功能研究作一回顾,并探讨其作为肿瘤干细胞治疗靶点的可能性.     

卵巢癌CD90^＋肿瘤细胞的分离及其肿瘤干细胞生物学特性观察

目的：分离人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞中的CD90^＋细胞,并观察其肿瘤干细胞的生物学特性。方法从卵巢癌患者腹水中分离原代卵巢癌细胞,采用流式细胞术检测人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞的CD133、CD90阳性率。流式分选得到CD90^＋、CD90^-细胞后,采用RT-PCR法检测其干细胞及上皮间质化（EMT）相关基因mRNA相对表达,Transwell小室侵袭试验观察细胞侵袭力,克隆形成试验观察细胞增殖分化能力,悬浮成球试验观察干细胞潜能,免疫缺陷小鼠体内有限稀释成瘤试验观察成瘤时间和成瘤率。结果人卵巢癌细胞系SKOV3的CD133和CD90阳性率均低于原代卵巢癌细胞,P均＜0．05。在人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞中,CD90^＋细胞干细胞相关基因（CD133、OCT4）和EMT间质标志相关基因（N-cadherin、Vimentine、MMP9）相对表达、穿到膜背面的细胞数、细胞克隆数、悬浮成球数均高于CD90^-细胞,EMT上皮标志相关基因E-cadherin相对表达均低于CD90^-细胞,P均＜0．05。随着接种细胞数目的增加,CD90^＋、CD90^-细胞的成瘤率和成瘤时间均升高,CD90^＋细胞升高更明显。结论卵巢癌细胞中,CD90^＋细胞高表达间质属性基因和干细胞相关基因,具备更高的侵袭力、增殖分化能力、体内成瘤能力和干细胞潜能,CD90^＋细胞分离可能成为卵巢癌干细胞分离的新方法。     

肿瘤坏死因子-α活化的人源骨髓间充质干细胞对结肠癌细胞 HT29生长及侵袭的影响

目的：探讨 TNF-α活化的人源骨髓间充质干细胞（MSC）对结肠癌细胞株 HT29生长、转移的影响。方法制备、收集 MSC 条件培养液（CM）及 TNF-α活化的 MSC（T-MSC）条件培养液（TCM）。采用 MTT 比色法检测在α-最低基础培养液（α-MEM）、CM、TCM 中培养2、4、6 d 的 HT29细胞增殖率。制备下层不接种细胞、接种 MSC 或接种 T-MSC,上层均含有 HT29细胞的双层软琼脂糖共培养体系,表面加入α-MEM 后培养30 d,检测单细胞肿瘤集落形成能力。利用悬滴法制备的 HT29肿瘤球进行3D 基质胶侵袭实验,检测α-MEM、CM、TCM 中 HT29细胞的侵袭能力。实时聚合酶链反应检测在α-MEM、CM、TCM 中培养的 HT29细胞中上皮钙黏素 mRNA 表达变化。两组数据比较采用成组 t 检验,多组数据比较采用单因素方差分析。结果培养4～6 d 后,CM 或 TCM 组 HT29细胞增殖率显著高于α-MEM 组（第4、6天各组吸光度值分别为0．57±0．06、0．51±0．02、0．22±0．01和0．45±0．01、0．73±0．04、0．15±0．02）,差异均有统计学意义（tCM ＝8．090、21．140,tTCM ＝21．190、17．950;P 均＜0．05）。软琼脂糖实验培养后30 d,T-MSC 共培养的 HT29单细胞集落数目明显多于其他两组。3D侵袭实验中 TCM 刺激后 HT29向周围侵袭能力强于α-MEM 组[侵袭率分别为（82±2）％和（65±8）％],差异有统计学意义（t＝2．848,P ＜0．05）。TCM 刺激后 HT29细胞中膜上皮钙黏素 mRNA 水平较α-MEM 组显著下降（0．32±0．02比1．00±0．00）,差异有统计学意义（t ＝35．190,P ＜0．05）。结论TNF-α活化的人源 MSC 可促进结肠癌细胞生长及侵袭。     

DAC及TSA对结肠癌细胞系中TIP30基因表达的影响及伊立替康敏感性探讨

目的 探讨DAC及TSA对结肠癌细胞系中抑癌基因TIP30表达的影响,以及与伊立替康敏感性的关系.方法 DAC及TSA处理体外培养的结肠癌细胞系HCT116及HT29,RT-PCR法检测结肠癌细胞系HCT116及HT29药物干预前后抑癌基因TIP30表达情况的变化.MTT法检测结肠癌细胞株HCT116和HT29在不同浓度CPT-11下的凋亡情况,绘制生长抑制曲线并计算半数抑制浓度.结果 HCT116及HT29细胞系经DAC及DAC和TSA联合作用后使原来不表达或低表达的抑癌基因TIP30重新表达或表达增强;结肠癌细胞系HT29与HCT116相比伊立替康敏感性较强,DAC处理后2个细胞系伊立替康敏感性均增强.结论 TIP30基因的异常甲基化是结肠癌发生发展中的常见现象,结肠癌细胞系中TIP30启动子甲基化可能是基因失活的主要调控机制,DAC单独干预和DAC及TSA联合干预效果相似,均能显著增加高甲基化抑癌基因的重新表达.基因甲基化水平可能与化疗敏感性相关.     

A subpopulation of CD24⁺ cells in colon cancer cell lines possess stem cell characteristics

Cancer stem cells (CSCs) have been shown to contribute to the resistance and relapse in a range of cancer types such as breast cancer and glioma. However, colon cancer stem cells remain poorly characterized. Here we reported that CD24+ subpopulation in colon cancer cell lines HCT116 and SW480 exhibited cancer stem cell-like characteristics. Using flow cytometry candidate CSCs markers were selected after initial screening of known CSCs markers from other types of cancer on colon cancer cell lines HCT116, SW480 and HT29. CD24 was expressed in the minority of bulk cell population of HCT116 and SW480 cell lines. Moreover, functional tests demonstrated that CD24+ cells exhibited enhanced chemotherapy-resistance, self-renewal and tumorigenic capacity both in vitro and in vivo, compared to CD24- subpopulations. These results suggest that CD24+ subpopulation in colon cancer cell lines HCT116 and SW480 exhibits CSCs like characteristics, and represents a nice model to study and develop effective strategies to overcome chemo-resistance and relapse of colon cancer.     

MiR-590-3p在胰腺癌干细胞中的表达

目的 应用无血清培养基分离胰腺癌干细胞,检测其miR-590-3p的表达。方法 运用无血清培养基克隆培养ASPC-1、PANC1细胞,检测其单克隆形成、分化及细胞周期、半数抑制浓度(IC50)和表面标记物CD24+、CD44+表达。实时定量PCR法检测细胞miR-590-3p的表达。结果 经无血清培养基培养,(0.94±0.53)％的ASPC-1细胞和(0.57±0.12)％的PANC1细胞能存活,呈克隆球样悬浮生长,并可以在体外连续传代。加入血清后细胞球又重新贴壁生长。ASPC-1细胞球G0/G1期比例和CD24+、C44+、CD24+ CD44+的细胞比例及IC50分别为(75.3±5.4)％、0.96％～2.01％、27.52％～34.47％、0.35％ ～0.44％和(224.37±5.71) μg/ml,均显著高于亲本细胞的(43.7±3.8)％、0.38％～0.42％、17.65％ ～ 18.25％、0.05％～ 0.08％、(11.43±2.10) μg/ml(P值均＜0.05)。PANC1细胞球G0/G1期比例和CD24+、CD44+、CD24 +CD44+的细胞比例及IC50分别为(80.1±4.7)％、5.31％ ～9.84％、72.05％ ～93.06％、4.91％ ～5.21％、(296.58±4.27) μg/ml,均显著高于亲本细胞的(46.1±5.3)％、4.09％～4.97％、47.71％～55.66％、1.48％ ～2.63％、(26.17±3.81) μg/ml(P值均＜0.05)。ASPC-1、PANC1细胞球miR-590-3p表达分别是亲本细胞的4.67和4.52倍。结论 应用无血清培养基可以从ASPC-1、PANC1细胞系中分离出具有干细胞特性的胰腺癌细胞球,其miR-590-3p表达上调,该基因可能是胰腺癌干细胞特性维持的关键基因。     

Upregulated CD133 expression in tumorigenesis of colon cancer cells

AIM: To analyze the upregulated CD133 expression in tumorigenesis of primary colon cancer cells. METHODS: Upregulated CD133 expression in tumorigenesis of colorectal cancer cell lines (Lovo, Colo205, Caco-2, HCT116 and SW620) was analyzed by flow cytometry. Human colon cancer tissue samples were stained with anti-human CD133. SW620 cells were sorted according to the CD133 expression level measured by fluorescence-activated cell sorting. Spheroids of colorectal cancer cells were cultured with the hanging dro...     

Cancer stem cell markers CD133 and CD24 correlate with invasiveness and differentiation in colorectal adenocarcinoma

AIM： To verify that CD markers are available for detecting cancer stem cell populations and to evaluate their clinical significance in colon cancer.METHODS： Immunohistochemistry for CD133, CD24 and CD44 was performed on the tissue microarray of 523 colorectal adenocarcinomas. Medical records were reviewed and clinicopathological analysis was performed.RESULTS： In colorectal adenocarcinoma, 128 of 523 cases （24.5%） were positive and 395 cases （75.5%） were negative for CD133 expression. Two hundred and sixty-four of 523 cases （50.5%） were positive and 259 cases （49.5%） were negative for CD24 expression. Five hundred and two of 523 cases （96%） were negative and 21 cases （4%） were positive for CD44 expression. Upon clinicopathological analysis, CD133 expression was present more in male patients （P = 0.002） and in advanced T stage cancer （P = 0.024）. Correlation between CD24 expression and clinicopathological factors was seen in the degree of differentiation （P= 0.006）. Correlation between CD44 expression and clinicopathological factors was seen in the tumor size （P = 0.001）. Survival was not significantly related to CD133, CD24 and CD44 expression.CONCLUSION： CD markers were related to invasiveness and differentiation of colorectal adenocarcinoma. However, CD expression was not closely related to survival.     

不同转移潜能肝癌细胞株中CD标志物的表达差异及意义

目的探讨不同转移潜能的肝癌细胞株中几种CD标记物的表达差异及其意义,为进一步利用CD分子标志物分离多潜能肝癌干细胞奠定基础。方法常规培养三种不同转移潜能的肝癌细胞株HepG2、MHCC-97H、SK-HEP-1,胰酶消化获得单细胞悬液后,经流式抗体染色,通过流式细胞仪分析三种肝癌细胞株中CD133、CD90、CD44、CD34、CD24的表达差异及意义。结果 CD133+细胞在HepG2细胞株仅占0.1%,而在MHCC-97H、SK-HEP-1细胞中表达也较低;CD90+、CD44+、CD90+CD44+表达水平随细胞转移潜能的增加呈递增趋势(P<0.05)。CD44+CD24+在HepG2、MHCC-97H、SK-HEP-1细胞中的阳性表达率分别为0.05%、10.3%和0.3%(P<0.05);三者中均无CD34+和CD133+CD90+细胞表达。结论 CD90和CD44与肝癌细胞的转移潜能有一定的相关性,可能成为潜在的肝癌肿瘤干细胞标记物。     

Proteome of human colon cancer stem cells: a comparative analysis

AIM: To isolate and identify the biological characteristics of human colon cancer stem cells (SW1116 cells) and further study their proteome. METHODS: SW1116 cells were isolated and cultured with a serum-free medium (SFM). Sphere formation was assayed to observe the formation of colon cancer stem cell spheres. SW1116 cells were inoculated into a serum-containing medium for observing their differentiation characteristics. Proliferation curve and cross-resistance of SW1116 cells to different drugs were detect...     

Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis analysis of indomethacin-treated human colon cancer cells

AIM: To establish the two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) profiles of indomethacin (IN)-treated human colon cancer cell line HCT116, and to provide a new way to study its anti-tumor molecular mechanism through analyzing a variety of protein maps. METHODS: Two-DE profiles of HCT116 were established in IN-treated and untreated groups. Total proteins were separated by immobilized pH gradient-based 2-DE. The gels were stained by silver, scanned by ImageScanner, and analyzed with Image Master software. RESULTS: Clear background, well-resolved and reproducible 2-DE patterns of HCT116 cells were acquired in IN-treated and untreated group. The average deviation of spot position was 0.896±0.177 mm in IEF direction and 1.106±0.289 mm in SDS-PAGE direction respectively. In IN-treated group, 1169±36 spots were detected and 1 061±32 spots were matched, the average matching rate was 90.6% in three gels. In untreated group, 1 256±50 spots were detected and 1168±46 spots were matched, the average matching rate was 93.0% in three gels. Forty-five differential protein spots were displayed between IN-treated and untreated groups. Of which, 34 protein spots decreased and 9 showed higher expression in IN-treated group, and only two protein spots showed an expression in untreated cells. CONCLUSION: Two-DE profiles of IN-treated and untreated HCT116 cells were established. Apparent 45 different protein spots were detected in IN-treated and untreated HCT116 cells. The analysis on differential protein spots may serve as a new way to study the molecule mechanism of IN-treated colon cancer.