浅谈原核基因工程细胞内不溶性表达产物的下游处理

基因工程或基因重组技术,是将不同生物的基因在体外人工剪切,组合并和载体(质粒、噬菌体、病毒)DNA连接,然后转入微生物或细胞内进行扩增,并使转入的基因在细胞内表达,产生所需要的蛋白质.     

基因探针

遗传标志物或探针是DNA的延伸,其碱基系列因人而异。在上述区域中,DNA是多形性的。目前已发现1,000多个多形性区域,分布在人体基因组内。多形性区域与缺陷基因无关,似乎对机体也没有影响,但能够起到标志的作用。当一种特定的变异靠近染色体上的缺陷基因,势必随着基因遗传时,就发生上述现象。当碱基系列中发生的变异可使限制酶将DNA切割成较小的断片时,研究人员就容易检出这种多态现象。某些人的变异区内可能缺乏酶辨认的特定系列。所以,由酶产生的DNA片断在不同的个体中有不同的长度,即产生了所谓限制性断片长度的多态现象。遗憾的是,新的囊性纤维变性的标志距离缺陷基因太远,以致不能成为出生前诊断的可靠试验。发生不确切的情况是:由于DNA通过细胞分裂时导致性细胞产生,同源的染色     

CO_2激光及α—干扰素局部治疗尖锐湿疣88例疗效观察

<正> 尖锐湿疣是人类乳头瘤病毒所引起的一种性传播镁病,该病毒属DNA病毒,经分子生物学研究,该病毒有40种以上抗原型,当人体免疫功能降低或身体衰弱时易患本病;我院于1990年开始应用Co_2激光及α—干扰     

DNA重组技术在实验动物科学中的应用

DNA重组技术是基因工程的核心，指在体外条件下，将不同生物的基因进行人工。剪切“组合”和“拼接”，使遗传物质重新掏建，然后通过载体如细菌质粒、噬菌体和病毒等转入受体细胞内进行无性繁殖，并使所需要的基因在受体细胞内表达，产生人类所需要的基因或产物，或创建新的生物类型。     

重新定义病毒学

人类巨细胞病毒(HCMV)是一种具有200多个基因的DNA疱疹病毒,属于一类较大的病毒。病毒DNA本身具有传染性,其附加蛋白被病毒带入宿主细胞内可增加感染的机率。拥有84个已知基因的单纯疱疹病毒(HSV)是一种相似的病毒。HCMV进入宿主细胞后,可产生大量的具有感染性的子代并清除一部分不利于表达的基因。据Bresnahan和Shenk报道,HCMV颗粒不仅包含有DNA,而且还有四     

寻找细胞的致癌基因

不管病毒的癌基因源自何处,在寻找人体细胞中有致癌可能的DNA序列时,病毒的癌基因已成为有价值的研究工具。通过DNA杂     

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究 Ⅰ.具有复制能力野生型反转录病毒检测

目的：检测反转录病毒介导的脑肿瘤基因治疗过程中具有复制能力野生型反转录病毒（RCR）。方法：RCR检测主要方法有：DNA聚合酶链式反应（PCR），反转录PCR（RT／PCR），Southern杂交以及neo基因和lacZ基因的补救分析。结果：建立了RCR的检测系统，从DNA水平、RNA水平和病毒活体水平对产HSV－TK病毒包装细胞（TK／VPC），C6转TK基因细胞和实验动物血液可能存在的RCR野生型病毒进行检测，结果均没有检测到野生型反转录病毒。结论：采用的反转录病毒基因转移系统没有产生野生型病毒，为临床试验的安全进行提供了保证。     

结肠癌基因治疗新技术

Glaxo Wellcome公司应用一种实验型基因治疗技术使植入小鼠体内的结肠癌自己毁灭,他们希望在未来18个月内开始人体试验。该公司研究人员首先将病毒注射入小鼠体内,此病毒将一个特殊基因偷带入小鼠细胞内。这个基因产生硝基还原酶。第二步给小鼠注射一种“前期药物”(prodrug)—CB 1954。这种化合物是无害的,只有当它遇到硝基还原酶时才     

医学论文中转化、转导、转染和感染的辨析

转化、转导、转染和感染是分子生物学实验中基因转移相关的名词,在医学论文中经常使用。它们词形相近、词意容易混淆,医学论文中时常用错。“转化”指通过含外源基因的重组质粒载体将外源基因直接导入原核细胞（如细菌）;“转导”指通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞;“转染”指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞;“感染”在基因转移实验中强调重组病毒载体入侵受体细胞的过程。在使用这4个名词时,应仔细分析基因转移实验的4要素——转移物、载体、介导方法、受体细胞类型,而正确区分载体和受体细胞类型是辨析的关键点。当载体是重组质粒时,如受体细胞是原核细胞应使用“转化”,如受体细胞是真核细胞则使用“转染”;当载体是重组病毒时,如强调转移物进入受体细胞应使用“转导”,如强调重组病毒我体进入受体细胞的过程则使用“感染”。     

对药物过敏的认识误区

<正>现代药物种类越来越多,而治病用药就可能发生药物过敏反应。然而在长期临床实践中发现,许多患者对药物过敏的认识存在许多误区,其中最常见的主要有以下几个方面:这药以前用过不会有事很多患者在注射青霉素等药物时,不愿作过敏试验,他们认为这药以前用过,不会过敏。殊不知药物过敏反应是药物第一次进入肌体后,剌激免疫系统才会产生相应抗体(或致敏淋巴细胞),当这种药物再次进入人体时才会引发变态反应,也就是说一般是2次以上用药才会发生过敏。摄入药物的     

乙型肝炎病毒S基因多样性的研究进展

乙型肝炎病毒 (HBV)属于嗜杆DNA病毒科。在感染的肝细胞中 ,HBV主要以RNA为中间体逆转录复制 ,复制时利用的是病毒本身的DNA聚合酶 ,此酶缺乏校对修复活性 ,发生变异后难以修正 ,所以造成复制过程中的反转录失真。HBV基因的突变率较一般DNA病毒为高。据估计 ,嗜杆DNA病毒的突变率接近于 2× 10 - 4·位 - 1·年 - 1[1] ,这比RNA病毒的突变率低 1～ 2个数量级 ,但却比一般的DNA病毒高出 4个数量级[2 ] 。S基因编码的HBsAg可以诱导保护性抗体的产生 ,是乙型肝炎疫苗的主要成分 ,也是诊断HBV感染的主要依据之一 ,所以S基因变异…     

基于基因的艾滋病疫苗的研究

T淋巴细胞应答在控制人免疫缺陷病毒或猴免疫缺陷病毒(SIV)感染中有重要作用。通常采用恒河猴感染SIV或嵌合SHIV病毒为实验模型,接种DNA疫苗来诱导T淋巴细胞应答及检验疫苗保护效应。在灵长类动物上,DNA疫苗的免疫原性取决于基因表达水平、SIV蛋白中抗原的选择、融合蛋白的使用、接种途径及佐剂的添加。最近研究表明,用DNA致敏,用表达相应SIV抗原的减毒重组病毒载体进行强化,可以提高特异免疫原性,防止致病病毒的攻击。目前,DNA疫苗作为基于基因的获得性免疫缺陷综合征疫苗已进入治疗性或预防性的临床试验阶段。     

基因治疗基因转移方法

基因转移是指用适当手段将外源基因导入体外或体内受体细胞中的分子生物学技术。常用方法可概括为物理、化学和生物三大类，前两类是非病毒的方法，生物方法主要指病毒介导的基因转移，包括RNA病毒、DNA病毒两类，物理化学法携带的遗传物质在细胞内易受DNA酶降解，而且不容易稳定地存在细胞基因组中，但是这些方法不存在野生型病毒污染．比较安全．病毒方法的特点是基因转移效率较高，但是安全性问题需要重视。理想的基因转移方法应符合以下要求，(1)高效的转移率；(2)外源基因定向导入受体细胞，且能转导非分裂相的细胞；(3)能稳定地、定点整合到宿主染色体上．最好是同源重组；(4)较高的安全性．对人体不构成较严正重的危害；(5)容易操作．易推广应用。     

支气管哮喘的现代治疗

首先从病因学上看 一些哮喘由一些外源因子如粉尘、花粉等引起，或进食鱼虾等蛋白类食物，在体内产生抗原，当过敏原再次进入人体就会产生过敏性哮喘。现代医学对外源引起的哮喘发病机制研究较多，认为与遗传、基因等方面有很大关系，这类患者发现有一定免疫缺陷，嗜酸性粒细胞（EOS）、肥大细胞、T细胞都参与了发病过程。当患者肺、支气管感染、吸入刺激性气体或寒冷空气也能诱发哮喘，也有因精神紧张诱发哮喘发作。近几年，人们通过实验室检验，病毒、肺炎衣原体也被证实参与了哮喘的发病过程。     

基因重组修饰痘苗病毒表达SARS病毒S蛋白产生针对S蛋白受体结合区的保护性抗体

ChenZ等人在美国病毒学杂志上报道了基因重组修饰痘苗病毒 (modifiedvacciniavirusAnkara ,MVA)表达SARS病毒S蛋白引起针对S蛋白受体结合区的保护性抗体的研究。MVA因为不含病毒基因组中的宿主基因而不能在人体内和绝大多数哺乳动物细胞中复制 ,但MVADNA基因表达没有受影响 ,能够在人体细胞内能合成早期和晚期基因。MVA已经针对天花作了上亿次应用于大规模的疫苗试验和临床试验 ,在使用过程中没有发现副作用 ,即使在高危病人或实验免疫缺陷的猴子中。在该研究中 ,作者将全长SARS -CoV包膜S蛋白基因转入了MVA缺失III区基因。…     

对药物过敏的误解

治病用药就可能发生药物过敏反应。然而,在长期的临床实践中发现,许多患者对药物过敏的认识存在误区,最常见的主要有以下几个方面。1.用过的药不会引起过敏很多患者在注射青霉素时,不愿作过敏试验,他们认为这药以前用过,不会过敏。殊不知,这药物过敏反应是药物在第一次进入机体后刺激免疫系统产生相应抗体(或致敏淋巴细胞),当这种药物再次进入人体时才会引发变态反应,即是两次以上用药才会发生过敏。摄入药物的次数越多,产生过敏的可能性越大。再者,所用药物的厂家不同、同一厂家所生产的药物批次不同(药物内所含杂质不同),这些也能成为引发…     

美宣布:抗艾滋病亚种病毒疫苗正式投入临床试验

20 0 2年 1 1月 1 3日美国国家卫生研究院已正式开始就一种新型艾滋病病毒疫苗进行人体临床试验。这种新疫苗是基于多个亚种病毒而设计 ,由美国国家卫生研究院下属的戴尔 -贝蒂·邦珀斯疫苗研究中心的科学家们开发成功 ,包含从A、B、C 3种艾滋病亚种病毒菌株中提取出的多个基因 ,是迄今第一个进入临床试验阶段的多基因、多亚种艾滋病病毒疫苗。科学家们希望借助它能找到对付艾滋病病毒的常规手段。新疫苗主要通过刺激机体产生免疫反应来抗艾滋病病毒。如果初步试验证明这种疫苗确实能激发免疫反应 ,并且安全可靠 ,研究人员准备在疫苗中增…     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

基因工程乙肝疫苗的研制——II.MT-5细胞中重组DNA的分析

采用Biotin-11-dUTP标记乙型肝炎病毒的DNA。利用这种生物素探针对MT-5细胞中的重组DNA进行分析。DNA杂交结果不但确证重组的HBsAg基因转化进入细胞中,而且揭示重组DNA是以游离状态存在,似乎没有整合和重排现象;重组DNA的量在不同亚细胞株中有所不同,HBsAg的表达量与重组DNA拷贝数有正相关关系。     

人凋亡相关因子基因RNA干扰慢病毒载体的构建与包装

目的:构建人凋亡相关因子(Fas)基因短发夹RNA慢病毒载体,实现沉默人脐带间充质干细胞Fas基因的表达.方法:根据Fas基因mRNA序列,设计4组靶向Fas基因的短发夹RNA序列,合成、退火形成双链DNA片段,与经过DNA内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞,对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序及比对分析.通过转染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定.结果:经酶切及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,通过荧光显微镜观察证明病毒转入293T细胞,感染效率 > 90%,并获得高滴度的慢病毒载体,病毒滴度为3×108TU/ml.结论:成功构建人Fas基因RNA干扰慢病毒载体,为下一步转染脐带间充质干细胞提供理论参考.