人早孕绒毛组织的体外原代培养和人滋养细胞株的建立

目的:建立快速、有效的绒毛滋养细胞体外原代培养的方法以及建立人滋养细胞株和初步评价。方法:采用胰酶和胶原酶I混合消化法消化绒毛组织,用胰蛋白酶消化传代体外培养,通过光镜、透射电镜和免疫荧光激光共聚焦方法对培养出的细胞进行形态和骨架评价。结果:显微镜下可见细胞呈多边形,细胞平铺生长,有细胞融合后形成的合体滋养层细胞;透射电镜下可见细胞表面的微绒毛丰富;胞质丰富,内质网扩张明显,有丰富的糖原颗粒、髓样小体和明显的脂滴,以及细胞间紧密的桥粒样结构连接;直接免疫荧光双标记染色检测到角蛋白18和波形蛋白均为阳性。结论:采用胰酶和胶原酶I混合消化法可获得较纯的滋养细胞,通过光镜、透射电镜和免疫荧光激光共聚焦检测细胞外形和骨架,确定该体外传至56代的细胞株为滋养细胞株。     

人早孕期绒毛和绒毛外细胞滋养细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立人早孕期绒毛细胞滋养细胞(villous cytotrophoblasts,VCT)及绒毛外细胞滋养细胞(extravillous cytotrophoblasts,EVCT)的分离、培养方法。 方法:利用不同的胰酶消化条件,收集人早孕期绒毛组织的VCT及EVCT并分别培养。倒置显微镜、扫描电镜观察VCT及EVCT的形态学特征;免疫细胞化学鉴定细胞来源及纯度。 结果:胰酶短期、温和消化获得的EVCT,可生长于Matrigel包被的培养器皿上,并表达特异性标志物c-crbB-2;延长消化时间、增加胰酶浓度获得的VCT,种植于塑料或玻璃培养器皿上可聚集并融合形成合体滋养细胞。VCT不表达c-crbB-2。结论:采用不同的胰酶消化及体外培养条件,可简单、快捷地分别获得高纯度人早孕期VCT及EVCT。     

抗子宫内膜抗体对人早孕绒毛滋养细胞凋亡及FasL蛋白表达的影响

目的:探讨体外培养人早孕绒毛滋养层细胞在游离抗子宫内膜抗体(Em-Ab)环境中,细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)及凋亡相关因子配体(factor associated suicide ligend,FasL)的表达。方法:培养经胰蛋白酶/DNA酶Ⅰ联合消化,通过Percoll细胞分离液纯化得到绒毛滋养细胞。用TUNEL法测定EmAb(+)血清处理组和EmAb(-)血清处理组绒毛滋养细胞培养0、48、72、96h时的细胞凋亡指数,同时用免疫细胞化学法测定FasL蛋白的表达。结果:EmAb(+)血清处理组于培养72、96h时间点测得的AI明显高于EmAb(-)血清处理组(P<0.01);FasL蛋白表达明显低于EmAb(-)血清处理组;而培养48h AI及FasL蛋白表达无显著差异。结论:绒毛滋养细胞在EmAb(+)环境下AI增加,FasL蛋白表达减少。     

瘦素协同纤连蛋白对早孕绒毛细胞滋养细胞浸润特性的影响

目的:探讨瘦素(leptin)、纤连蛋白(FN)对细胞滋养细胞浸润能力的影响及其协同作用。方法:①取孕6-8周的人工流产妊娠绒毛,分离、培养细胞滋养细胞并经光镜、电镜、免疫细胞化学鉴定。②用RT-PCR方法检测细胞滋养细胞中瘦素的表达。③应用体外培养侵袭模型检测瘦素、FN及二者协同时对细胞滋养细胞浸润能力的影响。结果:①分离、纯化所得细胞滋养细胞有瘦素mRNA表达。②瘦素组、FN组和瘦素与FN协同组浸润穿过matrigel的滋养细胞数均显著多于对照组(P<0.01),其中瘦素与FN协同组滋养细胞浸润能力最强。结论:①瘦素能增强细胞滋养细胞的侵袭能力。②FN对细胞滋养细胞的浸润具有趋化作用。③瘦素与FN对细胞滋养细胞的浸润有正协同作用。     

米非司酮对人早孕蜕膜和绒毛超微结构的影响

从超微结构水平，研究早孕妇女口服米非司酮（２５ｍｇ，Ｂｉｄ×２天）４８ｈ后，蜕膜和绒毛的超微结构改变，结果表明：蜕膜中大蜕膜细胞皱缩，粗面内质网和线粒体肿胀，蜕膜颗粒细胞中高电子密度颗粒减少或消失，同时伴随着周围网状纤维的溶解；而绒毛功能活跃的合体滋养细胞则表现不同程度的退行性改变。表明米非司酮阻断孕激素作用，对蜕膜的影响是直接的，而绒毛则主要是受继发性血供不足的影响。蜕膜中颗粒细胞及基质中网状纤维是米非司酮抗早孕重要的作用部位。     

炔诺酮对人早孕蜕膜和绒毛超微结构的影响

用炔诺酮（５ｍｇｑ８ｈ×５天）抗早孕后作人工流产，对蜕膜和绒毛的超微结构进行观察。结果显示绝大部分蜕膜和绒毛滋养细胞均发生不同程度的退变和坏死。蜕膜组织中大蜕膜细胞和绒毛合体滋养细胞变性坏死较重，而蜕膜颗粒细胞和细胞滋养细胞仅轻度变性。细胞退变的超微结构特征皆以线粒体肿胀和粗面内质网扩张为先导，继之，线粒体固缩伴高电子密度颗粒沉积，内质网不规则扩张，直至细胞全面崩解。本文就炔诺酮通过引起子宫局部缺血而导致蜕膜和绒毛滋养层细胞变性坏死的可能性进行了讨论。     

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯可抑制人原代培养早孕绒毛滋养细胞浸润能力

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯[di-(2-ethylexyl)phthalate,DEHP]对人原代培养早孕绒毛滋养细胞浸润能力及基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP)-1和TIMP-2表达的影响,探讨DEHP对妊娠的影响及其毒性机制。方法2006年12月于北京军区总医院采用不同浓度DEHP预处理人原代培养早孕绒毛滋养细胞,采用Transwell体外浸润实验检测滋养细胞浸润能力的改变。RT-PCR法检测滋养层细胞侵袭性相关基因MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达,Western blot法检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白表达水平。结果DEHP作用后,滋养细胞浸润能力明显下降。当DEEP为50、100μmol/L时,MMP-2、MMP-9、TIMP-1的mRNA表达量分别为0.35±0.07、0.26±0.03、0.97±0.18和0.30±0.10、0.20±0.05、1.02±0.20,与DEEP为0时MMP-2、MMP-9、TIMP-1的mRNA的表达量(0.77±0.15、0.45±0.04、0.80±0.20)比较P<0.05;当DEEP为50、100μmol/L时,MMP-2、MMP-9、TIMP-1的蛋白表达量分别为0.35±0.03、0.23±0.05、0.69±0.08和0.24±0.02、0.17±0.02、0.86±0.10,与DEEP为0时MMP-2、MMP-9、TIMP-1的mR-NA的表达量(0.69±0.04、0.57±0.03、0.24±0.12)比较P<0.05。可见DEHP剂量≥50μmol/L时,滋养细胞MMP-2和MMP-9表达下降、TIMP-1表达增加,且呈剂量依赖性。结论DEHP可通过抑制MMP-2、MMP-9的表达并促进TIMP-1表达,影响滋养细胞浸润能力。     

胎盘滋养细胞离子通道及其与子痫前期关系的研究进展

胎盘构成了母胎间物质交换的主要屏障。研究发现,在人类胎盘有氯离子通道、钙离子通道、钠离子通道和钾离子通道等的存在,这些通道与胎盘生理功能的调控密切相关,但其机制尚不清楚。目前离子通道功能改变与子痫前期关系的研究正在逐步开展。作者简要总结了胎盘离子通道研究的新进展,并讨论了离子通道与子痫前期可能的关系。     

人早孕滋养细胞条件培养液对蜕膜白细胞的趋化作用

目的:探讨人早孕滋养细胞在蜕膜白细胞选择性募集中的可能机制。方法:分离纯化人早孕滋养细胞进行原代培养,制备滋养细胞条件培养液(CM),分离蜕膜白细胞进行Transwell趋化实验,流式细胞术分析CM对蜕膜各型免疫细胞的趋化效应。结果:4倍稀释的CM即显示对蜕膜白细胞的显著趋化活性(P<0.05),而且二者之间呈显著直线正相关性(P<0.01);4倍稀释的CM即显示对CD56+CD16-和CD56+CD16+NK细胞、单核细胞、T细胞的显著趋化活性(P<0.05),趋化效率随CM浓度增高而上升;2倍稀释的CM显示对γδT细胞的趋化效应(P<0.05);CM对NKT细胞不表现趋化效应;经CM趋化前后的蜕膜白细胞构成比例相似(P>0.05)。结论:人早孕滋养细胞可能分泌多种趋化因子和细胞因子,募集和黏附到达蜕膜的母体免疫细胞,缔造母胎免疫耐受。     

人卵巢癌细胞系HO—8910的建立及其生物学特性

以分化差的卵巢乳头关浆液性囊腺癌患者腹水为材料，建立了体外培养的人卵巢癌细胞系ＨＯ－８９１０。细胞已传代１３０次，生长良好；组织学和超微结构均显示该细胞具有恶性上皮细胞特征；染色体数目分布在４５－３００之间，众数为５４（４２％），流式细胞仪检测ＤＮＡ指为１．４５，均呈超二倍体；该细胞能分泌性激素，并有激素受体存在；裸鼠移植瘤与患者原始肿瘤病理形态基本一致；细胞经液氮冻存后复苏良好。该细胞系的建立为     

人子宫颈癌裸鼠移植瘤株与细胞系的建立及其生物学特性

目的：建立人宫颈癌裸鼠体内瘤株及其相应的体外细胞系。方法：把人宫颈高分化鳞癌手术切除标本移植于裸鼠皮下，生长后行鼠间连续传代。取移植瘤行体外培养，建立相应的体外细胞系。对体内瘤株和体外细胞系进行相关的生物学检测，并行体外细胞系克隆和无血清培养。结果：历时１７个月建成人宫颈高分化鳞癌裸鼠移植瘤株ＨＣＣ－９４Ｖ，瘤株生长稳定，已传２６代，移植成瘤率为９２．９％。光镜、电镜下的形态学特征与患者肿瘤组织一致，染色体多为异倍体；多种肿瘤标记物呈高表达，癌基因蛋白产物呈低表达；人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）１６型呈阳性、１８型呈阴性，与患者肿瘤组织的检测结果一致。体外培养维持传代１６个月，建成人宫颈癌细胞系ＨＣＣ－９４，生长稳定，已传１３１代。电镜下显示典型的桥粒和张力原纤维结构，以及人类肿瘤异常染色体特征。细胞的肿瘤标记物及癌基因蛋白产物呈高表达。ＨＰＶ１６及１８型呈阴性。细胞裸鼠移植致瘤，其组织病理形态学与患者肿瘤组织一致，且ＨＰＶ１６呈阳性。细胞系克隆出了３个亚株，无血清培养成功。结论：ＨＣＣ－９４Ｖ和ＨＣＣ－９４是一株新的宫颈癌裸鼠移植瘤株和细胞系，为宫颈癌的进一步研究提供了理想的材料和模型。     

Establishment and Characterization of a New HPV-Negative Squamous Cell Carcinoma Cell Line (Yumoto) from the Human Uterine Cervix

A new cell line, Yumoto, derived from a squamous cell carcinoma of the uterine cervix, was established from serially transplanted tumor tissues in nude mice. Monolayer cultured cells were polygonal and formed pavement-like sheet. They showed a piling-up tendency and were devoid of contact inhibition. Electron micrographs demonstrated the presence of microvilli on the cell surface, abundant tonofilaments in the cytoplasm, and the connection with desmosomes. These electron micrographical characteristics of Yumoto cells were consistent with those of squamous cell origin. Yumoto cells were highly tumorigenic in BALB/c nude mice and produced a well-differentiated squamous cell carcinoma of keratinizing type which closely resembled to the original tumor tissues in nude mice. The presence of HPV DNA was examined using polymerase chain reaction and Southern blot analysis, but no known types of HPV DNA could be detected. Exons 2 through 11 of the p53 gene were analyzed by direct DNA sequencing, revealing a homozygous mutation at codon 281 in exon 8, GAC to CAC (Asp→His). Furthermore, physical p53-gene deletion was demonstrated by dual-color fluorescencein situhybridization. This cell line is useful for studying the carcinogenesis of cervical carcinoma and for investigating the biological characteristics of a HPV-negative and mutated p53 squamous cell carcinoma of the uterine cervix.     

人卵巢癌细胞系具有不同转移潜能亚系的分离及体内和体外鉴定

目的:克隆具有不同转移潜能的癌细胞亚系,并对其侵袭转移能力进行体内外鉴定。方法:应用有限稀释法对卵巢癌细胞系SKOV3进行单细胞克隆,共分离出14个克隆亚系,根据细胞电泳率,流式细胞仪检测所得细胞周期,筛选出3个电泳率差异较大的克隆亚系(S1、S6和S14)。并应用体内外试验检测各亚系的生物学特性及其侵袭转移能力。结果:S1为高转移亚系,体外生长快,侵袭人工基底膜细胞数及软琼脂集落形成数显著多于其他二者,裸鼠体内100%成瘤,70%转移;而S14为不转移亚系,体外生长慢,侵袭人工基底膜细胞数及软琼脂集落形成数显著少于其他二者,裸鼠体内仅20%成瘤,无1例发生转移。结论:该系统为来自同一肿瘤母系,遗传背景完全相同,却具有不同转移潜能的异质性克隆,为肿瘤转移机制的研究和克隆肿瘤转移相关基因提供了良好模型。     

Placental protein 10 (PP10) in the serum of patients with trophoblastic and nontrophoblastic gynaecological tumours

Summary Serum levels of placental protein 10 (PP10) were measured by radioimmunoassay in patients with trophoblastic (n=23) and non-trophoblastic (n=122) gynaecological tumours before, during and after treatment. Elevated levels (>2.0 g/l) were found in 96% of patients with an untreated trophoblastic tumour, and in 22%, 20% and 12% of patients with endornetrial, cervical and ovarian carcinoma, respectively. After treatment the levels fell in patients with trophoblastic disease. Although PP10 may be tumour-associated in such cases, it is premature to assume any significance for PP10 as a tumour marker in clinical practice, because changes in serum hCG levels are much more informative.     

人子宫在位及异位内膜细胞的体外培养及生物学特性比较

１６例人子宫内膜及２０例子宫内膜异位组织进行了体外分离培养,并比较了两种组织中上皮细胞及间质细胞的形态学特点及分泌功能。结果显示：两种组织的两类细胞在细胞角蛋白、波形蛋白和ＰＲＬ免疫细胞化学染色均有相似的阳性反应特点;并且也分别分泌相似量的ＣＡ １２５和ＰＲＬ,但是异位内膜间质细胞分泌的ＩＬ ６量明显高于正常内膜的间质细胞（Ｐ＜ ０．０１）。作者认为这种体外培养方法,对子宫内膜异位症细胞的生物学特性,以及进一步揭示子宫内膜异位症发病机制的实验室研究,可提供有价值的细胞模型     

抗苗勒氏管激素(AMH)对离体人卵巢黄素化颗粒细胞干细胞因子(SCF)表达负调控的研究

目的:研究人卵巢黄素化颗粒细胞中抗苗勒氏管激素(AMH)对干细胞因子(SCF)表达的影响。方法:收集15例年龄<35岁因男方因素行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者的卵巢颗粒细胞,经原代培养,加入不同浓度基因重组人抗苗勒氏管激素(rhAMH),分别于培养的第4日与第6日采用实时定量PCR(RT-PCR)和免疫组织化学检测空白对照组与各实验组SCFmRNA及蛋白的表达。结果:RT-PCR和免疫组织化学均证实人卵巢黄素化颗粒细胞在不同浓度rhAMH干预后,SCFmRNA及蛋白的表达显著减少(P<0.05),其中15 ng/ml rhAMH抑制作用最明显;实验组第4日与第6日颗粒细胞表达SCFmRNA及蛋白无明显差异(P>0.05)。结论:AMH可有效抑制人卵巢黄素化颗粒细胞SCF mRNA及蛋白的表达。     

小鼠雄激素受体真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆小鼠雄激素受体(androgen receptor,AR)基因的cDNA,构建AR真核表达载体,并在睾丸支持细胞TM4中进行表达和鉴定。方法:应用RT-PCR法从小鼠睾丸中扩增AR,将测序正确的PCR产物克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体中,再将载体以脂质体方式转染至TM4细胞系中,通过G418筛选稳定转染AR的TM4细胞株,以RT-PCR法和Western blotting法检测转染前后AR在TM4细胞系中的表达情况。结果:RT-PCR法和Western blotting法检测的结果显示,转染pcDNA3.1(-)/AR质粒的细胞中AR基因的表达水平显著高于转染pcDNA3.1(-)质粒的对照组。结论:成功构建了小鼠AR真核表达载体pcDNA3.1(-)/AR和稳定转染的TM4细胞系,为进一步研究AR在睾丸支持细胞中的作用及其分子机制建立了细胞模型。