荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究

目的评价荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测恶性疟原虫的效果.方法以不同浓度梯度标准对照作为参照,对127份疟区血样进行检测,并将所得结果与镜检、常规PCR法比较.结果恶性疟原虫镜检、常规PCR、FQ-PCR检出的阳性率分别为33.1%、38.5%和40.9%;定量检测结果与镜检阳性率呈直线相关,相关系数为0.961.结论FQ-PCR检测方法有较高的灵敏度和特异度,用于恶性疟原虫的定性及定量检测有较好的应用前景和研究价值.     

荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究

目的 评价荧光定量聚合酶链式反应（FQ－PCR）检测恶性疟原虫的效果。方法 以不同浓度梯度标准对照作为参照,对127份疟区血样进行检测,并将所得结果与镜检、常规PCR法比较。结果 恶性疟原虫镜检、常规PCR、FQ－PCR检出的阳性率分别为33．1％、38．5％和40．9％;定量检测结果与镜检阳性率呈直线相关,相关系数为0．961。结论 FQ－PCR检测方法有较高的灵敏度和特异度,用于恶性疟原虫的定性及定量检测有较好的应用前景和研究价值。     

复式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫的研究

目的： 建立在同一次扩增中即可鉴别患者感染的疟原虫虫种的复式ＰＣＲ检测方法。方法： 根据恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）中度重复基因序列ｐＢＲＫ１－１４ 和间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）线粒体细胞色素Ｃ氧化酶基因ＣＯＩＩＩ合成引物,采用经优化的ＰＣＲ反应体系, 对疟原虫ＤＮＡ模板进行扩增。结果： Ｐ．ｆ．与Ｐ．ｖ．分别被扩增出２０６ 和３７０ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段,与人白细胞ＤＮＡ 无交叉;用该反应体系至少可检测出原虫血症为５×１０－ ７的Ｐ．ｆ．感染和１．０２×１０－ ６ Ｐ．ｖ．感染; 自云南疟疾流行区采集的７８３份滤纸干血滴样本中, 复式ＰＣＲ法阳性检出率为８５．８％ , 误诊率为０, 漏诊率为０．１％ , 而镜检法依次分别为８４．９％ 、３．１％ 和１．０％ , 两者符合率为９５．８％ 。结论： 本复式ＰＣＲ检测疟原虫较镜检敏感、特异, 适用于我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断、流行病学调查、药物的疗效考核和献血员的筛选等。     

多重PCR种特异性检测恶性疟原虫和间日疟原虫方法的建立

目的建立恶性疟原虫和间日疟原虫种特异性检测的多蕈PCR方法,用于疟疾的检测和诊断.方法根据疟原虫18S核糖体小亚基ssRNA的基因序列设计合成8对11条引物,通过对恶性疟、间日疟患者及健康对照者血样的DNA进行扩增,选择出敏感性和特异性最佳的引物用于建立多重PCR方法,并用梯度变化的方法分别对引物浓度、复性温度、延伸温度和循环次数等反应参数进行比较分析,优化PCR反应条件.利用优化后的多重PCR埘采自云南和上海的139份疟疾患者血样和32份非疟疾患者血样进行检测,以镜检方法为金标准,分析多重PCR方法检测患者血样的敏感性和特异性.结果从8对11条引物中优选出2对共3条引物用于建立多重PCR.利用这3条引物进行多重PCR,一次反应即可完成对恶性疟原虫和间日疟原虫的种特异性鉴定.对疟疾和非疟疾患者血样检测结果显示,该方法检测患者血样的敏感性为97.8%,特异性为100%.结论多重PCR方法敏感、特异、可进行批量检测,适用于对人群的疟疾监测和疑似疟疾病例的诊断,并能鉴定恶性疟原虫和间日疟原虫虫种.     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

荧光定量PCR用于按蚊体内疟原虫子孢子检测的研究

目的 建立一种用于按蚊体内疟原虫子孢子定量检测和虫种鉴别的荧光定量PCR方法。方法 采用针对4种人体疟原虫18S rRNA基因属特异性保守区的1对引物, 以疟原虫18S rRNA基因重组质粒与按蚊DNA的混合物为模板, 进行反应体系和反应条件优化, 验证方法的特异性, 并通过熔解曲线分析进行虫种鉴别。应用阴性按蚊DNA稀释的间日疟原虫18S rRNA基因重组质粒为模板制作标准曲线, 并分别以质粒DNA和实验室子孢子感染阳性的按蚊DNA为模板分析建立的荧光定量PCR方法的敏感性。在反应体系中加入不同部位、 不同用量按蚊DNA, 以探讨按蚊DNA对检测效果的影响。结果 该方法对按蚊、 人血DNA均无扩增, 对4种疟原虫DNA均有特异性扩增且扩增产物的熔解温度 （Tm） 易于区分, 三日疟原虫、 恶性疟原虫、 卵形疟原虫和间日疟原虫的Tm值分别为71.0、 72.7、 73.9 ℃和75.9 ℃。标准曲线中循环阈值（Ct值） 与模板浓度具有良好的相关性 （相关系数r = -0.99）。最低可以检出含50拷贝的质粒DNA或32倍稀释的子孢子阳性按蚊DNA样本。按蚊DNA对荧光定量PCR反应具有抑制作用。荧光定量PCR的Ct值在实验内和实验间均具有良好的重现性。结论 新建立的SYBR Green I染料荧光定量PCR方法具有较高的敏感性和特异性, 可用于按蚊体内疟原虫子孢子的检测, 并可同时对4种人体疟原虫进行鉴别。     

实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体的诊断价值

目的探讨实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体的诊断价值。方法对呼吸道感染的186例患者的痰液分别采用实时荧光定量PCR技术和基因测序检测,以评价实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体感染的准确性。结果实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的灵敏度为100.0%,特异度为93.1%,阳性预期值为80.8%,阴性预期值为100.0%,准确率为94.6%。结论实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体具有较高的可靠性,适用于临床快速诊断肺炎衣原体感染的相关疾病。     

PCR检测恶性疟原虫感染蚊方法的建立

目的 建立一种简便的可应用于现场蚊感染恶性疟原虫的PCR检测方法。方法 采用针对恶性疟原虫小亚单位核糖体DNA（SSUrDNA）的特异引物，利用PCR技术，从实验室感染及现场采集的感染恶性疟原虫的蚊基因组DNA中，扩增恶性疟原虫SSUrDNA片段，进行恶性疟原虫的检测。结果 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可检测出特异的约188bp大小的DNA片段，其基因序列与预计序列完全一致。估测每份蚊DNA样本中含有10个以上子孢子即可获得此片段，而对间日疟原虫及未感染蚊DNA不能扩增出此片段。结论 该PCR检测方法可应用于现场恶性疟原虫感染蚊的检测。     

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。     

多重PCR快速检测恶性疟和间日疟的研究

目的 建立一种简便快速、能同时检测恶性疟和间日疟的核酸检测方法。方法 针对两种疟原虫18S rRNA基因设计2对(3条引物),优化引物浓度与退火温度,建立可扩增出两种疟原虫基因片段的多重PCR。并进行最低检测限确定和临床标本检测,以镜检法为金标准分析灵敏度和特异度等指标。结果 该方法可扩增出431 bp(恶性疟原虫)和341 bp(间日疟原虫)基因片段,最低检测限为10²copies/反应,检测临床标本的结果与镜检法无差别(P＞0.05),敏感度为93.55%,特异度为70.83%,阳性预测值为89.23%,阴性预测值为80.95%。结论 所建立的多重PCR方法可快速检测疟疾感染并鉴别分型,灵敏度高,值得推广。     

复式PCR检测间日疟原虫和恶性疟原虫的现场应用

目的探讨复式PCR方法在疟疾诊断中的现场应用价值。方法根据疟原虫18 S rRNA基因序列,合成疟原虫属特异性上游引物和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物,优化PCR反应体系,建立在同一PCR反应体系中同时检测间日疟原虫、恶性疟原虫基因组特异性DNA片段的疟疾诊断方法,并评价其现场应用价值。结果间日疟原虫和恶性疟原虫基因组DNA经过复式PCR后,分别扩增出1 451 bp和833 bp的特异性条带,而伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及健康人血样均无扩增带出现,用该反应体系可检出原虫血症为1.1×10-6和5.6×10-7的间日疟原虫和恶性疟原虫感染。与镜检法相比,复式PCR检测119份现场样本,112份与镜检结果相同,阳性率为54%,漏诊率为0.8%,误诊率为0,而镜检法依次分别为53%、1.7%和3.4%。结论复式PCR方法检测疟原虫具有简便、快速、特异、敏感等优点,在疑似病例的鉴别诊断和分子流行病学调查中具有良好的应用价值。     

标签引物-套式/多重PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的研究

目的 建立简便、灵敏、低本底、可同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫的套式/多重聚合酶链反应（PCR）系统。 方法 应用标签引物扩增技术、Primer Premier 5.0软件、美国生物信息中心(NCBI-BLAST)网络资源和矩阵试验法优化套式/多重PCR，检测疟疾患者滤纸血样并与镜检结果进行比较。 结果 新建立的标签引物套式/多重PCR，检测模拟现场滤纸血样的敏感性为恶性疟原虫1～2个虫/μl血，间日疟原虫5～10个虫/μl血。检测71份现场采集的镜检疟原虫阳性滤纸血样（恶性疟24份和间日疟47份）的结果与镜检结果的符合率分别为87.5%和100%。 结论 通过标签引物扩增技术优化的套式/多重PCR系统，适用于检测现场采集的滤纸血样，其检出低原虫血症的敏感性和鉴定虫种的准确性均优于镜检法，是很有潜力的疟疾诊断技术。     

恶性疟原虫红内期不同发育阶段PfRON4基因转录水平分析

目的 分析恶性疟原虫棒状体颈部蛋白4基因（PfRON4）在红内期不同发育阶段的转录水平。 方法 用山梨醇结合等渗细胞分离液（Percoll）对实验室体外培养的恶性疟原虫进行均一化处理, 收集间隔为6 h不同发育阶段的疟原虫, 提取RNA。根据PfRON4基因及相关基因(PfAMA1和PfRhopH2)的序列设计特异性引物, 构建标准质粒并制作标准曲线, 对PfRON4及相关基因的mRNA进行定量检测分析。 结果 纯化并同步后的疟原虫生长发育较为同步均一, 用于定量分析的标准曲线相关性较好, PfRON4、PfAMA1和PfRhopH2的相关系数（r值）分别为-1.00、-0.98和-0.98。产物熔解曲线分析结果均显示为单一波峰。定量分析结果显示, 在恶性疟原虫红内期发育过程中, PfRON4基因的转录水平在裂殖子入侵红细胞后36～40 h（即成熟裂殖体阶段）达到高峰。 结论 恶性疟原虫PfRON4基因在成熟裂殖体阶段高表达。     

应用巢式PCR对恶性疟原虫培养中支原体污染的检测

目的应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体污染。方法根据支原体16s和23s保守序列设计PCR引物,应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体。结果体外培养的恶性疟原虫标本16份,PCR检测支原体均阳性,经测序比对后确认为口腔支原体。已知阴性对照无扩增带。结论应用巢式PCR能敏感和特异地检出恶性疟原虫体外培养中的支原体。     

SYBR GreenⅠ染料法定量PCR用于人体疟原虫定量检测及虫种鉴别的研究

目的建立一种可用于疟原虫检测并同时鉴别虫种的荧光定量PCR方法。方法根据人体疟原虫18SrRNA基因序列特征,在疟原虫种特异性区域两侧的属特异性保守区设计引物,对4种人体疟原虫进行PCR扩增,将得到的扩增产物采用TA克隆法插入pGEMT载体制备标准质粒,用于制备标准曲线进行定量分析,并进行熔解曲线分析,测定各虫种扩增产物的熔解温度。结果 4种人体疟原虫均能扩增得到特异性片断,荧光定量PCR方法中建立的标准曲线相关关系较好（相关系数r=-1.00）,熔解曲线分析结果显示,4种人体疟原虫的熔解温度相差较大,分别为三日疟原虫71.3℃、恶性疟原虫72.8℃、卵形疟原虫74.6℃和间日疟原虫75.8℃。结论建立的SYBR GreenI染料法荧光定量PCR技术可同时进行人体疟原虫的定量检测和虫种鉴别。     

环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫的研究

目的环介导等温扩增(LAMP)技术检测恶性疟原虫。方法酚氯仿法提取恶性疟原虫基因组DNA,设计四条扩增恶性疟原虫环子孢子蛋白基因的LAMP引物,以间日疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、人全血DNA为对照,进行LAMP反应。LAMP产物经显色、电泳鉴定。将原虫血症为1.5%的恶性疟原虫血样用正常人血按1∶10倍比稀释为1.5×10-3、1.5×10-4、1.5×10-5、1.5×10-6、1.5×10-7、1.5×10-86个浓度后进行LAMP,检测其敏感性。结果恶性疟原虫检测管经显色后呈绿色(阳性),对照组均呈棕色(阴性)。恶性疟原虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP可检测恶性疟原虫的敏感度为1.5个疟原虫/107RBC。结论检测恶性疟原虫的LAMP方法特异、敏感及简便。     

江苏省2010年输人性恶性疟病例分析

目的 通过对江苏省2010年输入性恶性疟病例的个案分析,研究其发病和流行特征,为进一步做好全省输入性恶性疟防控工作提供依据.方法 对江苏省网络直报的恶性疟疫情和流行病学调查资料进行分析.结果 2010年江苏省报告输入性恶性疟病例207例,比2009年(101例)上升104.95％.输入性恶性疟病例主要分布于出国务工人员较集中的苏中和苏北地区,扬州、泰州、南通和淮安4市共报告输入性恶性疟病例为109例,占全部病例的52.66％.207例输入性恶性疟病例均为从非洲或东南亚等疟疾高度流行区的回归人员.207例患者中21例为临床诊断病例,占10.14％,186例为发热患者血片镜检疟原虫阳性,占89.86％;207例患者中初发病例125例,占60.39％,再燃病例82例,占39.61％.结论 江苏省输入性恶性疟日趋增多,应加强重点地区劳务输出归国人员的疟疾防治管理工作.