β-淀粉样蛋白对星形胶质细胞分泌组织蛋白酶B作用的研究

目的研究β-淀粉样蛋白(Aβ)对星形胶质细胞活性、形态学以及分泌组织蛋白酶B(CB)的影响。方法体外培养星形胶质细胞,采用免疫细胞化学方法对星形胶质细胞进行鉴定;观察加入不同浓度溶解状态的Aβ1-40后细胞形态学改变,采用四唑盐法检测细胞活性,Western blot法测定细胞上清CB表达水平。结果将不同浓度新鲜Aβ1-40加于星形胶质细胞分别培养24 h,各浓度Aβ1-40对星形胶质细胞活性均无明显影响(P0.05);随时间延长,经40～60μmol/LAβ1-40处理的星形胶质细胞逐渐出现肿胀、坏死;经15、20、25μmol/L Aβ1-40诱导的星形胶质细胞上清中检测到CB表达,随Aβ1-40浓度增高可见蛋白质显影增强且带形清晰。结论 Aβ1-40可激活星形胶质细胞并诱导其释放CB,提示Aβ激活的星形胶质细胞及其释放的CB可能在AD发病中起着一定作用。     

基质细胞衍生因子-1对阿尔茨海默病脑内可溶性Aβ清除作用的研究

目的通过对APP/PS1双转基因小鼠侧脑室持续注射基质细胞衍生因子-1(SDF-1),以观察SDF-1对脑内可溶性β淀粉样蛋白(Aβ)的影响及其可能的机制。方法将28周龄的野生型(wild type,WT)小鼠和APP/PS1转基因小鼠分为对照组和SDF-1α干预组,分别予以侧脑室注射SDF-1α和PBS,1周1次,连续注射4周和8周。采用ELISA法检测小鼠脑内可溶性Aβ的水平,采用Wsetern blot方法检测小鼠脑内小胶质细胞标志物Iba-1的水平。结果 SDF-1α侧脑室注射后APP/PS1小鼠脑内可溶性Aβ-40和Aβ-42水平与对照组相比明显减少,APP/PS1小鼠及WT小鼠脑内Iba-1水平较对照组增加。结论 SDF-1α侧脑室注射可能减少APP/PS1小鼠脑内可溶性Aβ的水平,其作用的机制可能是SDF-1α增加了脑内小胶质细胞由外周向中枢的募集,从而促进Aβ的吞噬清除。动员与趋化骨髓来源的小胶质细胞可能成为治疗AD的新靶点。     

腺苷A2b受体在大鼠脑缺血再灌注后的表达特点

目的探讨缺血/再灌注(I/R)后脑内腺苷A2b受体(A2bR)表达水平和分布的特点。方法 SD大鼠建立大脑中动脉缺血模型,免疫荧光法检测I/R后A2bR在脑内表达的部位及细胞类型,Western blot检测A2bR表达的相对水平。结果 Western blot结果显示大鼠缺血侧皮质、纹状体及海马区域A2bR表达均较对侧(非缺血侧)显著增高(P 0. 05)。免疫荧光结果显示I/R后腺苷A2bR在神经元、血管内皮细胞和星形胶质细胞表达显著激活。结论 I/R可诱导腺苷A2bR在缺血侧皮质、纹状体及海马区域的神经元、血管内皮细胞和星形胶质细胞表达。     

高血压脑出血血肿周围组织血-脑屏障变化的动态观察

目的动态观察高血压脑出血血肿周围组织血-脑屏障的变化.方法对6例高血压脑出血患者实施立体定向血肿碎吸术,术中取血肿周围少许脑组织进行超微病理观察.结果血-脑屏障的损伤与出血时间的长短呈正比.脑出血后24 h,可见星形胶质细胞肿胀,部分细胞崩解、坏死.毛细血管周围细胞足突肿胀,血-脑屏障损坏.72 h,部分星形胶质细胞高度肿胀,细胞器溶解.毛细血管内皮细胞胞核增大,胞质突入管腔,内皮细胞间紧密连接消失.4～7 d,星形细胞高度肿胀,胞质内充满水肿液,细胞器消失,细胞变性.毛细血管星形细胞足突明显肿胀,血管周围可见微小出血灶.结论血-脑屏障的变化与患者的预后有密切关系.     

高血压脑出血血肿周围组织血-脑屏障变化的动态观察

目的动态观察高血压脑出血血肿周围组织血-脑屏障的变化.方法对6例高血压脑出血患者实施立体定向血肿碎吸术,术中取血肿周围少许脑组织进行超微病理观察.结果血-脑屏障的损伤与出血时间的长短呈正比.脑出血后24h,可见星形胶质细胞肿胀,部分细胞崩解、坏死.毛细血管周围细胞足突肿胀,血-脑屏障损坏.72h,部分星形胶质细胞高度肿胀,细胞器溶解.毛细血管内皮细胞胞核增大,胞质突入管腔,内皮细胞间紧密连接消失.4～7d,星形细胞高度肿胀,胞质内充满水肿液,细胞器消失,细胞变性.毛细血管星形细胞足突明显肿胀,血管周围可见微小出血灶.结论血-脑屏障的变化与患者的预后有密切关系.     

乳铁蛋白对APP/PS1转基因小鼠神经病理的抑制作用

目的 探究乳铁蛋白(lactoferrin,Lf)对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠神经病理的抑制作用。方法选用6个月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠作为AD动物模型,将16只小鼠随机分为对照组和Lf组。各组对应给予生理盐水或人Lf(2mg·kg~(-1)),鼻饲3个月。免疫荧光激光共聚焦技术检测β?淀粉样蛋白(β?amyloid,Aβ)神经斑与星形胶质细胞和小胶质细胞的共定位;尼氏染色检测神经元的功能状态;Western blot检测神经核抗原(NeuN)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)和线粒体转录因子A(TFAM)的表达水平。结果 与对照组比较,鼻饲Lf组小鼠脑内Aβ阳性染色减弱,Aβ神经斑周围的星形胶质细胞的激活状态受抑制而小胶质细胞数量减少不明显,海马神经元的尼氏染色增强,GPX4、TFAM和NeuN等蛋白的表达上调。结论 人Lf可通过抑制神经炎症和氧化应激,从而有效保护APP/PS1小鼠的神经元,减缓APP/PS1转基因小鼠病理生理进程。     

Aβ1—40海马注射对大鼠脑内一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨一氧化氮合酶(NOS)在β淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性及阿尔茨海默病(AD)病理机制中的作用.方法应用免疫组化方法,观察大鼠海马齿状回Aβ1-40注射后神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达变化.结果正常大鼠海马齿状回区含nNOS神经元计数为8.96±0.35个/视野;生理盐水注射后局部含nNOS神经元无明显变化(8.97±0.29个/视野);Aβ1-40注射后,注射区周围含nNOS神经元数目显著减少(2.98±0.24个/视野).正常及生理盐水注射组脑内未见iNOS表达;Aβ1-40注射后2d、10d和30d,注射区持续出现大量含iNOS的胶质细胞(主要为星形胶质细胞),反应面积分别为0.905±0.082、0.962±0.161、0.935±0.125mm2.结论Aβ1-40海马注射可损伤局部含nNOS神经元及诱导胶质细胞iNOS表达,NOS在Aβ神经毒性和AD发病中有重要作用.     

颞叶癫痫主穹窿蛋白表达及其作用研究

目的 探讨主穹窿蛋白(major vault protein,MVP)在颞叶癫痫大鼠模型脑组织的表达及其与难治性癫癎耐药是否相关.方法 用氯化锂-匹鲁卡品制作颞叶癫癎模型,并将它分为药物有效组和耐药组;用免疫组化和Western blot法检测MVP表达.结果 MVP主要表达在海马和皮质区的小胶质细胞,血管内皮细胞,血管周围的星形胶质细胞也有表达,神经元中少见表达;耐药组MVP表达较药物有效组和对照组明显增高,具有统计学意义(P<0.05).结论 耐药大鼠模型中MVP过量表达,提示MVP可能与难治性癫癎的耐药性有关.     

脑缺血对阿尔茨海默病模型大鼠认知功能的影响及其机制探讨

目的 探讨脑缺血对阿尔茨海默病(AD)病程进展的影响及其机制.方法 采用大鼠海马注射凝聚态β-淀粉样蛋白(Aβ)1-40建立AD模型,再于海马内注射ET-1建立脑缺血条件,观察脑缺血后AD样大鼠认知功能以及海马内Aβ沉积、神经元丢失和异常磷酸化tau表达的变化;采用免疫组化、原位杂交和RT-PCR法检测海马内星形胶质细胞数量和IL-1、TNF-α表达的变化.结果 脑缺血后AD样大鼠的认知功能明显下降,海马内Aβ沉积增加,神经元丢失增加,异常磷酸化tau表达增加.星形胶质细胞的数量以及IL-1和TNF-α的表达显著增加(均P＜0.01).结论 脑缺血加重了AD样大鼠的认知功能障碍和海马病理损伤,显著增加的星形胶质细胞及IL-1和TNF-α的表达参与了这一过程.防治脑缺血和抗炎治疗可能成为减缓AD进展的新途径.     

黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞对

背景：实验室前期研究表明黄芩苷可以提高体外培养的神经干细胞分化为神经元的比例。但考虑到体内实验中血脑屏障的存在,黄芩苷能否通过血脑屏障主要细胞成分而发挥诱导神经干细胞定向分化为神经元的能力还不清楚。 目的：分别将大鼠脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞与神经干细胞共培养,观察在模拟体内复杂微环境条件下,黄芩苷能否定向诱导神经干细胞向神经元分化并促进分化神经元的成熟。 设计、时间及地点：细胞水平的体外对照观察,于2007-09/2008-03在天津中医药大学中医药研究院中药药理学重点实验室和南开大学医学院完成。 材料：取孕14 d SD大鼠,用以分离培养神经干细胞。 方法：利用Transwell装置,分别将脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经干细胞共培养。用含有10 μmol/L黄芩苷的培养基作用7 d,并设置空白对照组。以β-tubulinⅢ标记未成熟神经元,MAP-2标记成熟神经元,胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞。 主要观察指标：应用细胞免疫荧光化学染色检测神经干细胞分化后β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例,以实时荧光定量反转录-聚合酶链反应技术检测黄芩苷对脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子 mRNA表达的影响。 结果：与脑微血管内皮细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加β-tubulinⅢ阳性细胞比例（P < 0.05）。与星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷对β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例均无明显影响（P > 0.05）。与脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加MAP-2阳性细胞比例（P < 0.01）。黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞48 h,可以显著上调血小板衍生生长因子基因表达（P < 0.01）;作用72 h可显著上调星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子基因表达（P < 0.01）。 结论：黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞可诱导神经干细胞向神经元分化,黄芩苷同时作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元定向分化并促进其成熟,可能与黄芩苷调控脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长因子分泌,改善微环境有关。     

高血压脑出血血肿周围组织血—脑屏障变化的动脉观察

目的 动态观察高血压脑出血血肿周围组织血-脑屏障的变化。方法 对6例高血压脑出血患者实施立体定向血肿碎吸术,术中取血肿周围少许脑组织进行超微病理观察。结果 血-脑屏障的损伤与出血时间的长短呈正比。脑出血后24h,可见星形胶质细胞肿胀,部分细胞崩解、坏死。毛细血管周围细胞足突肿胀,血-脑屏障损坏。72h,部分星形胶质细胞高度肿胀,细胞器溶解。毛细血管内皮细胞胞核增大,胞质突入管腔,内皮细胞间紧密连接消失。4-7d,星形细胞高度肿胀,胞质内充满水肿液,细胞器消失,细胞变性。毛细血管星形细胞足突明显肿胀,血管周围可见微小出血灶。结论 血-脑屏障的变化与患者的预后有密切关系。     

谷胱甘肽S-转移酶π、DNA拓扑异构酶Ⅱ及P-糖蛋白在难治性癫癎患者脑内的表达

目的探讨谷胱甘肽S-转移酶π(GST-π)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)及P-糖蛋白(P-gp)在难治性癫癎(RE)患者脑内的表达及意义。方法32例RE患者手术切除标本,采用免疫组化方法检测GST-π、TopoⅡ及P-gp表达。8例脑血管畸形患者作为对照。结果对照组正常脑组织内星形胶质细胞及血管内皮细胞中有少量GST-π表达(2·2),癫癎组GST-π表达明显增强(10·9,P<0·05)。TopoⅡ在对照组中无表达,癫癎组2例标本有少量表达(0·4,P>0·05)。对照组中P-gp只在脑内血管内皮细胞中少量表达,癫癎组P-gp则在星形胶质细胞及血管内皮细胞中大量表达(12·9,P<0·01)。结论GST-π、P-gp在RE患者脑内表达可能与患者对抗癫癎药耐药有关。     

谷胱甘肽S-转移酶π、DNA拓扑异构酶Ⅱ及P-糖蛋白在难治性癫痫患者脑内的表达

目的 探讨谷胱甘肽S-转移酶π（GST-π）、DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）及P-糖蛋白（P-gp）在难治性癫痫（RE）患者脑内的表达及意义。方法 32例RE患者手术切除标本，采用免疫组化方法检测GST-π、TopoⅡ及P-gp表达。8例脑血管畸形患者作为对照。结果 对照组正常脑组织内星形胶质细胞及血管内皮细胞中有少量GST-π表达（2．2），癫痫组GST-π表达明显增强（10．9，P〈0．05）。TopoⅡ在对照组中无表达，癫痫组2例标本有少量表达（0．4，P〉0．05）。对照组中P-gp只在脑内血管内皮细胞中少量表达，癫痫组P-gp则在星形胶质细胞及血管内皮细胞中大量表达（12．9，P〈0．01）。结论 GST-π、P-gp在RE患者脑内表达可能与患者对抗癫痫药耐药有关。     

Aβ1-40对PC12细胞突触素表达的影响

目的探讨β-淀粉样蛋白(Aβ1-40)诱导PC12细胞凋亡,对突触素的表达影响。方法星形胶质细胞诱导PC12细胞分化为神经元样细胞。PC12细胞随机分为7组:Aβ1-40(0h)组～Aβ1-40(24h)组和对照组。应用MTT法检测细胞生存率,吖啶橙染色、流式细胞仪观察PC12细胞凋亡情况,应用免疫荧光技术检测突触素的表达变化。结果 Aβ1-40作用PC12细胞6h时,细胞生存率明显下降,细胞出现凋亡特征改变,细胞凋亡率最高,与对照组、其他各时间点比较,差异有统计学意义(P<0.05);Aβ1-40作用PC12细胞4h时,突触素明显减少,与对照组、其他各时间点相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在Aβ1-40诱导大量PC12细胞明显出现凋亡特征之前,Aβ已经引起PC12细胞突触素明显减低,β-淀粉样蛋白(Aβ)可能引起PC12细胞早期神经突触损伤。     

药物难治性癫痫患者脑内多药耐药相关蛋白1表达的研究

目的 研究药物难治性癫痫患者脑内皮层多药耐药相关蛋白1（multidrug resistant-associated protein 1，MRP1）表达的情况。方法 选择12例药物难治性癫痫患者癫痫切除灶与12例正常对照脑组织标本．用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组化及免疫蛋白印记（Western blot）方法，分析比较MRP1基因在各组的表达。结果 药物难治性癫痫患者组脑内MRP1的表达显著高于正常对照组（P〈0．01）。在癫痫病灶内广泛分布的MRP1免疫阳性细胞主要为毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞。结论 脑内高表达的MRP1参与了难治性癫痫的耐药机制。     

水蛭提取液对凝血酶引起的体外星形胶质细胞毒性损害的保护作用研究

目的 探讨凝血酶对培养的大鼠脑星形胶质细胞毒性损害及水蛭提取液对其的保护作用. 方法 建立体外实验即大鼠脑星形胶质细胞培养实验模型,相差显微镜观察细胞生长状况.MTT法筛选水蛭提取液的有效浓度.星形胶质细胞分为水蛭提取液治疗组与凝血酶对照组,测定培养上清液酸脱氢酶(LDH)活性(细胞死亡的标志).免疫组化法观察它们的HSP70和TGFβ-1的表达. 结果 (1)一定浓度范同(1～100 U/mL)的凝血酶对星形胶质细胞有毒性作用,且随凝血酶剂量的增大,它对星形胶质细胞的毒性作用相应增加(F=118.65,P=0.000).(2)一定浓度范围内(0.25～4 mg/μL)的水蛭提取液能明显减轻10 U/mL凝血酶对星形胶质细胞的毒性作用(F=156.08,P=0.000),且随水蛭提取液浓度的增大,保护作用增强,还可促进星形胶质细胞HSP70和TGFβ-1的表达. 结论 水蛭提取液能促进星形胶质细胞增生,增强它们的HSP70和TGFβ-1表达,从而明显抑制凝血酶对星形胶质细胞的毒性作用.     

脑白质低灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43的表达变化

目的研究慢性脑白质缺血后星形胶质细胞和缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)的变化。方法原代培养星形胶质细胞,建立体外慢性缺氧模型;双侧颈总动脉狭窄法,建立慢性低灌注脑白质损伤小鼠模型;免疫荧光共染观察星形胶质细胞活化与Cx43表达。Western蛋白定量分析髓鞘相关指标髓鞘相关糖蛋白MAG,星形胶质细胞标记物GFAP和Cx43的表达。结果与对照组相比,细胞慢性缺氧7d后,星形胶质细胞明显增生活化,伴随Cx43表达水平明显上调。Western blot发现,在慢性脑白质缺血过程中,MAG的表达逐渐降低,GFAP持续增高,Cx43表达明显上调。免疫荧光共标记可见,星形胶质细胞中Cx43表达上调,主要分布于胼胝体中央区。结论慢性脑白质缺血损伤过程伴随星形胶质细胞Cx43表达增加,Cx43可能成为临床治疗血管性认知障碍的新靶点。     

PINK1介导缺氧损伤时星形胶质细胞对神经元的保护作用

目的探究星形胶质细胞内PTEN诱导假定激酶1(PINK1)缺失对缺血时神经保护作用的影响及其作用机制。方法离体培养原代星形胶质细胞,使用小干扰RNA(si RNA)沉默PINK1表达,氧糖剥夺(OGD)建立细胞缺氧模型,分为4组:PINK1沉默组(si RNA+转染剂)、空质粒组(空质粒+转染剂)、转染剂组(只加转染剂)和对照组(星形胶质细胞),各组均与神经元共培养;另设立神经元单独培养组。免疫荧光染色观察神经元凋亡情况。定量PCR及ELISA检测星形胶质细胞促红细胞生成素(EPO)及血管内皮生长因子(VEGF)表达量;Western blot检测星形胶质细胞内缺血诱导因子(HIF)及核因子κB(NF-κB)通路相关蛋白水平。结果 OGD损伤后神经元凋亡率较高,与星形胶质细胞共培养后神经元凋亡率显著降低(P0.05)。PINK1基因沉默后共培养神经元凋亡增加,星形胶质细胞EPO及VEGF分泌量减少、胞内EPO及VEGF转录水平降低(P0.05);HIF-1、HIF-2与NF-κB通路活化水平均显著降低(P0.05)。结论星形胶质细胞对OGD损伤神经元有保护作用,其作用通过EPO及VEGF实现;PINK1基因沉默后星形胶质细胞对缺血神经元保护作用减弱,可能与NF-κB通路活化水平降低、HIF激活受损进而下调EPO和VEGF表达量有关。     

尼古丁上调星形胶质细胞内源性Cryab抑制Aβ聚集的研究

目的研究尼古丁激活星形胶质细胞α7胆碱能受体(α7 nicotinic receptors,7 n AChRs)上调内源性B-晶状体蛋白(αB-crystallin,Cryab)并抑制β淀粉样蛋白(Amyloid,Aβ)集聚的现象及其机制。方法分离24 h内新生乳鼠大脑皮质培养原代星形胶质细胞并鉴定;体外制备Aβ_(1-42)寡聚体;将细胞分为对照组、尼古丁组、α7n AChRs阻断剂(methyllycaconitine,MLA)组、Aβ_(1-42)组、尼古丁+Aβ_(1-42)组、PI3K信号通路阻断剂LY294002+尼古丁+Aβ_(1-42)组。用蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞内Cryab、P-Akt(ser473)、Aβ寡聚体的表达水平。结果尼古丁可以显著上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白(P0.05);尼古丁能够显著上调磷酸化Akt蛋白水平(P0.05);在细胞裂解液及培养基中,尼古丁显著增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用(P0.01)。结论尼古丁通过激活星形胶质细胞α7 nAChRs上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚;PI3K/Akt信号通路可能参与尼古丁激活星形胶质细胞α7 n AChRs上调内源性Cryab蛋白抑制Aβ集聚的过程。为进一步研究尼古丁抑制Aβ集聚的可能机制提供了实验基础。     

星形胶质细胞与Aβ1-40诱导凋亡的PC12细胞共育条件培养液对神经干细胞分化的影响机制

目的 将星形胶质细胞与β-淀粉样蛋白(Aβ1-40)诱导凋亡的PCI2细胞共育,观察星形胶质细胞条件培养液(ACM)对胚胎大鼠皮层神经干细胞(NSCs)体外定向分化为神经元的比例影响及机制,探讨神经营养素家族蛋白[包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)]是否参与此过程. 方法 PC12细胞分别经10 μg/mLAβ1-40诱导不同时间(0、4、6、12、24h)后分为两部分,第一部分应用流式细胞技术检测不同时间点PC12细胞凋亡率;第二部分分别与星形胶质细胞共育2 d,将收集的ACM分为两部分.一部分应用ELISA法检测ACM中BDNF、NGF、NT-3蛋白含量,另一部分以1;3比例同DMEM/F12堵养基混合,对NSCs进行体外诱导分化,应用激光共聚焦显微镜、NSE免疫荧光技术鉴定和计数神经元分化比例. 结果 在Aβ1-40作用6 h时间点,PC12细胞凋亡率达高峰,与其共育的ACM中BDNF蛋白总量明显增高,诱导的NSCs神经元分化比例明显升高,与其他组比较,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 星形胶质细胞与Aβ1-40诱导凋亡的PCI2细胞共育后.ACM提高了NSCs向神经元的分化比例,ACM中BDNF可能参与了这一过程.