TLRs在大鼠穿透角膜移植术后排斥反应中的作用

目的动态检测大鼠角膜组织TLR2、TLR3、TLR4mRNA的表达,研究TLR2、TLR3、TLR4在穿透角膜移植术后免疫排斥反应中的作用。方法采用SPF级雌性SD大鼠108只为受体,SPF级Wistar大鼠36只为供体,另取SPF级雌性SD大鼠6只12只眼为正常对照组。受体大鼠分为3组：自体角膜移植组（A）、同种异体角膜移植组（B）和同种异体角膜移植后糖皮质激素应用组（C）,A、B、C组各36只大鼠接受穿透角膜移植术,术后裂隙灯下观察角膜透明度、新生血管情况并采用排斥反应指数（RI）进行评分。分别于术后第5、7、9天获取角膜标本行组织病理学检查和荧光实时定量PCR（real-timePCR）检测,动态观察角膜组织中TLR2、TLR3、TLR4mRNA的表达。结果术后随时间变化,A、B、C组大鼠角膜植片均出现不同程度的水肿、混浊、新生血管生长。B组大鼠角膜RI平均在术后7d符合排斥反应的诊断标准并经病理学检查证实。A组和C组大鼠角膜的RI计分未达到排斥反应诊断标准。正常大鼠角膜可见TLR2、TLR3、TLR4mRNA表达;术后9dB组大鼠角膜TLR2mRNA的表达较A组显著增加,差异有统计学意义（P〈0.05）;TLR3mRNA和TLR4mRNA在B组各时间点间表达的差异倍数比较均无统计学意义（P=0.30;P=0.32）,但组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 TLR2可能作为天然免疫识别受体识别移植抗原,参与角膜移植术后的免疫排斥反应。     

糖皮质激素对角膜移植术后大鼠角膜TLR2表达的影响

目的检测大鼠角膜组织TLR2mRNA的表达,研究糖皮质激素对穿透角膜移植术后角膜TLR2表达的影响及对术后排斥反应的作用。方法实验动物分正常对照组（N）、同种同体角膜移植组（A）、同种异体角膜移植组（B）和同种异体角膜移植激素（典必殊滴眼液点术眼,每日2次）抗排斥组（C）,A、B、C3组大鼠给予穿透角膜移植术,术后裂隙灯下观察角膜透明度、新生血管并用排斥反应指数评价;分别于术后第5、7、9天取材,行组织病理学检查和实时荧光定量PCR检测,动态观察角膜组织中TLR2mRNA的表达。结果术后随时间变化角膜植片均出现不同程度的水肿、混浊、新生血管生长。B组大鼠平均在穿透角膜移植术后7d发生排斥反应并获病理学支持;A组和C组大鼠术后排斥反应指数计分未达到诊断标准。术后3组手术干预组角膜TLR2mRNA的表达均增加,同种异体角膜移植组角膜TLR2mRNA的表达较同种同体角膜移植组显著增加,激素抗排斥组角膜TLR2mRNA表达明显降低（P〈0.05）。结论糖皮质激素可能通过抑制角膜TLR2的表达及其介导的信号转导,抑制排斥反应,对移植物起保护作用。     

白细胞介素-33在大鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用

目的 探讨白细胞介素(interleukin,IL)-33在大鼠角膜组织中的表达及其在角膜移植术后免疫排斥反应中的作用.方法 以SD大鼠为供体,Wistar大鼠为受体建立同种异体大鼠穿透性角膜移植模型,随机分为4组,取Wistar鼠4只(8眼)为正常对照组(A组),另取24只Wistar鼠作为自体角膜移植组(B组),最后取24只SD鼠和48只Wistar鼠行SD-Wistar鼠之间同种异体角膜移植(C组、D组),术后D组每日滴典必殊眼液(每日2次),共2周.参照Larkin法对各组角膜植片进行临床评估;分别于术后第5天、第14天取材,行实时荧光定量PCR、组织病理学观察,检测各组角膜组织内IL-33 mRNA的表达水平.结果 C组角膜植片的存活时间为(10.13±0.44)d,D组为(18.00±0.66)d,两组间差异有统计学意义(P=0.000).IL-33 mRNA在A组和B组角膜组织中均有表达,C组角膜组织中IL-33 mRNA表达水平明显升高,而在D组中表达显著降低(P＜0.05).结论 IL-33可能参与大鼠角膜移植术后免疫排斥反应.     

角膜基质细胞Toll样受体4对茄病镰刀菌炎性反应的实验研究

目的 检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)的表达分布状况,探讨TLR4与炎性因子分泌的关系.方法 对小鼠角膜基质细胞进行原代培养和鉴定;制备茄病镰刀菌液;MTT法观察菌液刺激对角膜基质细胞生长作用的影响;免疫组化、RT-PCR测定刺激后不同时间点角膜基质细胞TLR4的表达;ELISA检测封闭TLR4对菌液诱导的角膜基质细胞分泌TNF-α、IL-8的影响.结果 采用消化法1～2 d培养出小鼠角膜基质细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色阳性;菌液刺激48h后,MTT法显示刺激组较对照组OD值明显下降;正常角膜基质细胞TLR4在蛋白及mRNA水平呈弱表达,刺激6h可达到高峰,12h开始逐渐降低;菌液可上调角膜基质细胞TNF-α、IL-8的释放,刺激3h、6h、12 h的TNF-α、IL-8的浓度与TLR4 mRNA的表达呈明显的正相关(P＜0.05);预先封闭TLR4,可明显降低TNF-αt、IL-8的释放.各时间组间的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 角膜可能通过TLR4识别真菌感染,TLR4在角膜对真菌的免疫炎性防御反应中起到重要作用.     

不同浓度肽聚糖对角膜上皮细胞Toll样受体(TLR)2和TLR4表达的影响

目的 研究不同浓度肽聚糖对角膜上皮细胞Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)2和TLR4表达的影响.方法 原代培养C57小鼠角膜上皮细胞,随机分为对照组(无肽聚糖刺激)及按照肽聚糖刺激浓度分为10 mg·L-1组、30 mg·L-1组、80 mg·L-1组(作用时间均为12 h);按照肽聚糖刺激时间分为12 h组、24 h组、36 h组(作用浓度均为30mg·L-1),应用实时荧光定量PCR与流式细胞术检测各组TLR2、TLR4 mRNA和蛋白的表达量.结果 与对照组(1.00±0.14、1.00±0..01)相比,10 mg·L-1组(4.35±0.46、3.53±0.50)、30 mg· L-1组(8.06±0.72、5.31±0.34)、80 mg· L-1组(2.93±0.46、2.23±0.04)的TLR2、TLR4 mRNA表达增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);与对照组(1.00±0.14、1.00±0.01)相比,12h组(2.94±0.46、2.23±0.50) TLR2、TLR4 mRNA表达增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).与对照组相比,各浓度组和12 h组角膜上皮细胞TLR2、TLR4蛋白表达均增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 肽聚糖可以刺激小鼠角膜上皮细胞TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达增加,提示感染性角膜炎的发生、发展可能与角膜上皮细胞TLR2、TLR4识别病原体并参与炎症反应有关.     

糖尿病大鼠神经干细胞视网膜下移植后TLR4、NF-κB的表达

目的 观察糖尿病大鼠视网膜下移植大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)后转录因子(NF-KB)、Toll样受体4(TLR4)的表达.方法 大鼠糖尿病成模后,A组视网膜下移植大鼠NSCs,B组视网膜下填充DMEM,C组不做手术处理.NSCs移植组术后1、2、4周分别取双眼颞上视网膜做对照检测.Western blot法检测TLR4和NF-κB的蛋白表达.结果 A组糖尿病大鼠TLR4、NF-κB持续表达阳性,B组仅术后3 d、1周TLR4表达阳性,术后1周NF.KB表达阳性,C组TLR4和NF-KB表达为阴性.各组TLR4、NF-KB表达差异有统计学意义(P<0.05).结论 糖尿病大鼠NSCs视网膜下移植后TLR4、NF-KB可持续表达.     

茄病镰刀菌对体外培养小鼠角膜基质细胞TLR4表达的影响

目的通过检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4（TLR4）的表达分布,探讨TLR4在角膜真菌感染中的作用。方法体外培养小鼠角膜基质细胞,采用茄病镰刀菌液（孢子密度为1×10^6CFU／mL）来刺激传3代的小鼠角膜基质细胞,于刺激0h（即未刺激）以及3、6、12h后应用免疫细胞化学染色、RT—PCR法测定各组细胞TLR4蛋白及mRNA的表达,ELISA法测定各组细胞上清液中肿瘤坏死因子α（TNF—α）的分泌水平。结果培养的角膜基质细胞1周后融合,波形蛋白荧光染色阳性。TLR4蛋白及mRNA在未刺激角膜基质细胞呈微弱表达,3h较前明显升高,6h达到高峰,12h开始减弱,但与0h相比,差异均有统计学意义（蛋白：t3h=0．031,t6h=0．097,t12h=0．069,P〈0．05;mRNA：t3h=0．367,t6h=0．422,t12h=0．078,P〈0．05）。TNF-α分泌量随着刺激时间的延长呈上升趋势,6h达到高峰,然后逐渐下降,3、6、12h组与0h组比较差异均有统计学意义（t3h=21．152,t6h=40．854,t12h=27．713,P〈0．05）。TLR4 mRNA及蛋白的表达与TNF-α的分泌间均呈正相关（r=0．729,0．751,P〈0．05）。结论TLR4可能在角膜识别真菌感染、介导炎性防御反应过程中起到重要的作用。     

重组腺病毒载体RNA干扰阻断ICOS共刺激通路抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应的研究

目的观察携带有报告基因绿色荧光蛋白且表达ICOS-siRNA的重组腺病毒载体Ad-siICOS-EGFP阻断ICOS共刺激通路对角膜移植急性免疫排斥反应的抑制作用。方法取Wistar大鼠(供体)及SD大鼠(受体),建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型,将SD大鼠随机分为A、B、C、D4组,每组各20只:A组为单纯角膜移植对照组;B组为Ad-siICOS-EGFP注射组,术后即刻于球结膜下注射Ad-siICOS-EGFP;C组为Ad-EGFP注射组,术后即刻于球结膜下注射Ad-EGFP;D组为生理盐水注射组,术后即刻于球结膜下注射生理盐水;每眼选择角膜缘1200位、600位两个注射点,每个注射点注射剂量为15μL。术后每天在裂隙灯显微镜下观察排斥反应指数的变化并记录植片的存活时间。各组分别于术后5d随机取10只大鼠,麻醉后取角膜,部分植片行RT-PCR检测,部分角膜冰冻切片行共聚焦显微镜观察。各组其余大鼠进行角膜植片存活时间统计。结果 A组、B组、C组、D组角膜植片平均存活时间分别为(9.800±0.632)d、(14.700±1.418)d、(10.000±1.054)d、(10.100±0.876)d,其中B组存活时间最长,与其余各组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05);A组、C组、D组各组间差异均无统计学意义(均为P>0.05)。B组及C组角膜植片共聚焦显微镜下可见GFP绿色荧光表达,表达位于角膜植片上皮层及整个角膜基质层;A组、D组角膜植片未见绿色荧光表达。A组、B组、C组、D组植片组织ICOS的PCR产物凝胶电泳条带灰度值比值分别为1.004±0.164、0.621±0.096、0.929±0.134、0.918±0.120,其中B组最低,与其余各组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05);A组、C组、D组各组间差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论 Ad-siICOS-EGFP可以有效地抑制大鼠植片组织ICOSmRNA及蛋白的表达,从而阻断ICOS共刺激通路;移植术后即刻受体鼠球结膜下注射Ad-siICOS-EGFP,可以抑制大鼠角膜移植急性免疫排斥反应,延长角膜植片存活时间。     

TLR2/MyD88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用

目的 探讨Toll样受体2(Toll like receptor,TLR2)/MyD88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用.方法 取14只SD大鼠为供体,28只Wistar大鼠为受体,建立28个同种异体穿透性角膜移植模型.建模后分为同种异体角膜移植组14只(6只用于术后观察排斥情况),同种异体角膜移植TLR2单克隆抗体组14只(6只用于术后观察排斥情况).另选16只Wistar大鼠,分为同种自体角膜移植组8只,正常对照组8只.3个手术组大鼠分别行穿透性角膜移植术.术后TLR2单克隆抗体组给予0.5 g·L-1TLR2单克隆抗体,分别于术后0d、2d、4d、6d、8d分5次经球结膜下注射给药.正常对照组、同种自体角膜移植组及同种异体角膜移植组给等量生理盐水.术后每天于裂隙灯下观察角膜透明度、新生血管,并用排斥反应指数评分.第9天取材,行HE、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测.结果 术后随时间变化各手术组角膜植片均出现不同程度的水肿、混浊和新生血管生长,以同种异体角膜移植组最为明显.HE染色结果显示在同种异体角膜移植组,角膜基质层出现水肿、大量炎症细胞浸润和新生血管,而在同种自体角膜移植组和TLR2单克隆抗体组中炎症反应较轻.免疫组织化学检测结果:TLR2和MyD88分子在正常对照组、同种自体角膜移植组及TLR2单克隆抗体组的角膜上皮中均有微量表达,同种异体角膜移植组角膜上皮、基质细胞中TLR2和MyD88分子的表达明显增多,尤以基质层明显.实时荧光定量PCR结果显示同种异体角膜移植组角膜组织TLR2 mRNA、MyD88 mRNA的表达较同种自体角膜移植组(P =0.000、0.004)和正常对照组(P=0.000、0.000)显著增加,两者的表达亦较TLR2单克隆抗体组显著增加(P =0.000、0.003).结论 TLR2单克隆抗体抑制TLR2及其下游信号分子MyD88的表达;TLR2/MyD88信号系统参与了角膜移植术后排斥反应,影响了角膜植片的转归.     

白细胞介素-34在大鼠角膜移植排斥反应中的作用机制

目的　探讨白细胞介素-34（interleukin-34,IL-34）在大鼠角膜移植术后的表达情况以及在免疫排斥反应中的作用。方法　以SD大鼠为供体、Wistar大鼠为受体建立角膜移植实验模型。Wistar大鼠60只按照随机数字表法随机分为3组,B组为自体角膜移植组,C、D组行同种异体角膜移植术。另取10只为正常对照组（A组）。术后B、C组术眼滴泰利必妥眼液,D组术眼滴典必殊眼液。术后各组分别取10只大鼠判断四组角膜植片的存活情况并作生存分析。其余大鼠于术后14 d取术眼角膜植片,行组织病理学、免疫组织化学及RT-PCR检测。结果　生存分析结果提示,A组和B组角膜不发生排斥反应,D组角膜存活时间为（26.00±0.97）d,远高于C组（10.00±1.55）d（P<0.001）。HE染色结果显示,C组角膜组织各层有大量炎性细胞浸润以及新生血管形成,D组仅有少量炎性细胞、新生血管。免疫组织化学结果提示,IL-34蛋白在C组的表达量（0.089 4±0.005 6）明显高于A组（0.037 7±0.002 3）、B组（0.068 4±0.004 4）和D组（0.044 5±0.004 5）的表达量（F=145.21,P＜0.01）,且主要集中在上皮层和基质层。RT-PCR结果提示,IL-34、IL-1β、TNF-α、IL-17A的mRNA 在C组角膜组织中表达水平明显高于A组、B组和D组（均为P<0.05）。结论　IL-34参与了大鼠角膜移植术后的排斥反应,而典必殊可能通过抑制IL-34的表达及相关的信号通路,延缓排斥反应的进展。     

大鼠烟曲霉菌性角膜炎初期核苷酸结合寡聚域样受体在角膜中的表达及其免疫防御作用

背景核苷酸结合寡聚域（NOD）样受体（NLRs）在天然免疫过程中发挥重要作用,但其在真菌性角膜炎发生和发展过程中的作用研究少见。目的研究NOD,在大鼠烟曲霉菌性角膜炎（AFK）角膜组织中的表达及作用。方法72只成年清洁级Wistar大鼠按照随机数字表法随机分为正常对照组、单纯角膜上皮损伤组和AFK模型组,均以右眼作为实验眼。正常对照组12只大鼠中选取6只仅刮取角膜上皮用于逆转录PCR（RT—PCR）实验,另6只大鼠制备角膜标本用于组织病理学检查、免疫组织化学和免疫荧光染色实验。单纯角膜上皮损伤组共30只大鼠,仅刮除中央角膜上皮,AFK模型组大鼠共30只,刮除角膜上皮后接种烟曲霉菌标准株。分别于实验后4、8、16、24h选取各组6只大鼠刮取角膜上皮,采用RT—PCR法检测角膜中NOD2mRNA的表达,其他6只于实验后24h制备角膜标本,采用免疫组织化学法和免疫荧光染色法检测角膜中NOD2蛋白的表达,并将各组检测结果进行比较。实验后4、8、16、24h分别摘除各组大鼠右眼眼球,制作角膜标本进行常规组织病理学检查。结果裂隙灯显微镜下观察各组大鼠各时间点的角膜情况,均造模成功。RT—PCR结果显示,正常对照组角膜仅有微量NOD2mRNA的表达,单纯角膜上皮损伤组和AFK模型组大鼠角膜中NOD2mRNA的相对表达量明显增加,且在实验4、8、16、24h,AFK模型组大鼠角膜中NOD2mRNA的相对表达量均明显高于单纯角膜上皮损伤组,差异均有统计学意义（t=-0．409、-0．439、-0．534、-0．618,均P=0．000）。大鼠角膜组织病理学检查显示,正常对照组大鼠角膜结构完整;单纯角膜上皮损伤组可见到少部分角膜上皮缺损、前弹力层皱褶及角膜轻度水肿,有少量中性粒细胞浸润;AFK模型组大鼠可见角膜溃疡,角膜水肿增厚,浅基质层可见大量中性粒细胞浸润。     

抗树突状细胞单克隆抗体对大鼠角膜移植术后植片内IFN-γmRNA表达和血清IL-2水平的影响

目的用抗树突状细胞单克隆抗体（anti—dendritic cell monoclonal antibody，DC—McAb）抑制树突状细胞（dendritic cell，DC），观察其对大鼠角膜移植排斥反应及植片内IFN-γ mRNA的表达、血清IL-2水平的影响。方法以Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，分A：对照组：A0：阳性对照组；B：腹腔给药组；C：结膜下给药组；D：保留受体上皮瓣组。A、A0、B、C组予常规穿透角膜移植术．D组保留受体上皮瓣。每组术前3d及术日，术后第1、第2、第3、第5、第7、第9、第11天给药，A组：腹腔注射灭菌注射用水0．5ml，A0组：腹腔注射小鼠抗大鼠IgG 0．1ml＋灭菌注射用水0．4m1．B、D组：DC—McAb 0．1ml＋灭菌注射用水0．4ml，C组：结膜下注射DC—McAb 0．05ml。术后裂隙灯显微镜观察排斥反应情况，记录各组角膜发生排斥反应的时间。A、B、C、D组分别于术后第3、第7、第14和第21天采血清．ELISA法测IL-2水平。A、B组术后第7天取角膜植片，RT—PCR法检测IFN-γmRNA的表达情况。结果A组术后（7．63±0．74）d出现排斥反应，A0组（7．50±0．54）d，与A组相比差异无显著性（P〉0．05）；B组（17．11±1．17）d、C组（13．86±0．69）d、D组（17．88±0．84）d，与A组相比差异有显著性（P〈0．01）；C组与B、D组相比，差异有显著性（P〈0．01）；B组与D组相比，差异无显著性（P〉0．05）。A组角膜植片IFN-γmRNA可检测到有较高表达，B组的表达量很少或检测不到，两组之间的差异较为明显。正常SD大鼠血清IL-2浓度为（35．18±2．59）pg／ml，移植术后3d略有升高，7d时明显升高，14d时IL-2的水平达高峰，21d时下降，B、C、D组升高幅度与A组相比明显减少（P〈0．05），C组与B、D组相比升高幅度较大（P〈0．05），B、D两组之间无明显差异（P〉0．05）。结论抗树突状细胞单克隆抗体可抑制大鼠角膜移植排斥反应，延?     

腹腔巨噬细胞核因子转位在小鼠内毒素诱导葡萄膜炎发病中的作用

目的观察野生型C3H/HeN小鼠和Toll样受体4(TLR4)基因缺陷型C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬细胞在脂多糖(LPS)刺激下激活状态的差异,从体外途径探讨TLR4传导信号在前葡萄膜炎发病中的可能作用机制。设计实验研究。研究对象健康成年C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠。方法常规提取两种小鼠腹腔巨噬细胞体外培养,按处理因素不同随机分六组:C3H/HeN小鼠LPS组、正常对照组、抗TLR4单克隆抗体加LPS组、抗TLR4单克隆抗体组;C3H/HeJ小鼠LPS组、正常对照组。各组在不同处理后1h、3h、6h、12h、24h五个时间点通过免疫荧光组织化学染色进行观察。主要指标TLR4传导途径中关键分子TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、核因子-κB(NF-κB)免疫荧光强度及表达位置差异。结果所有组TLR4均表达于细胞膜,MyD88表达于细胞质和细胞核。C3H/HeN小鼠LPS组和C3H/HeJ小鼠LPS组TLR4荧光强度比较,差异有统计学意义;余各组TLR4荧光强度两两比较,差异无统计学意义。C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞LPS组随LPS刺激时间的延长,各观察时间点MyD88荧光强度逐渐减弱,总体差异有统计学意义;余各组各时间点MyD88荧光强度无明显变化。C3H/HeN小鼠正常对照组、抗TLR4单克隆抗体组,C3H/HeJ小鼠正常对照组腹腔巨噬细胞各时间点NF-κB均表达于胞质,C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞LPS刺激1h后NF-κB表达于胞核,3h依旧表达于胞核,此后无法检测到NF-κB的表达。C3H/HeN小鼠抗TLR4单克隆抗体加LPS组、C3H/HeJ小鼠LPS组巨噬细胞经LPS刺激1h后NF-κB转移至胞膜,直至24h一直表达于胞膜。结论腹腔巨噬细胞TLR4传导途径中核因子的转位可能与前葡萄膜炎的发病有关,特异性阻断该途径或许为前葡萄膜炎的治疗提供新思路。     

抗树突状细胞单克隆抗体对大鼠角膜移植术后植片内IFN-γ mRNA表达和血清IL-2水平的影响

目的 用抗树突状细胞单克隆抗体(anti-dendriticcell monoclonal antibody,DC-McAb)抑制树突状细胞(den-dritic eell,DC),观察其对大鼠角膜移植排斥反应及植片内IFN-γ mRNA的表达、血清IL-2水平的影响.方法 以Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体,分A:对照组:AO:阳性对照组;B:腹腔给药组;C:结膜下给药组;D:保留受体上皮辨组.A、AO、B、C组予常规穿透角膜移植术,D组保留受体上皮瓣.每组术前3 d及术日,术后第1、第2、第3、第5、第7、第9、第11天给药,A组:腹腔注射灭菌注射用水0.5 ml,AO组:腹腔注射小鼠抗大鼠IgG 0.1 ml+灭菌注射用水0.4 ml,B、D组:DC-McAb 0.1 ml+灭菌注射用水0.4 m1.C组:结膜下注射DC-McAb 0.05 ml.术后裂隙灯显微镜观察排斥反应情况,记录各组角膜发生排斥反应的时间.A、B、C、D组分别于术后第3、第7、第14和第21天采血清,ELISA法测IL-2水平.A、B组术后第7天取角膜植片,RT-PCR法检测IFN-γmRNA的表达情况.结果 A组术后(7.63±0.74)d出现排斥反应,A0组(7.50±0.54)d,与A组相比差异无显著性(P＞0.05);B组(17.11±1.17)d、C组(13.86±0.69)d、D组(17.88±0.84)d,与A组相比差异有显著性(P＜0.01);C组与B、D组相比,差异有显著性(P＜0.01);B组与D组相比,差异无显著性(P＜0.05).A组角膜植片IFN一γmRNA可检测到有较高表达,B组的表达量很少或检测不到,两组之间的差异较为明显.正常SD大鼠血清IL-2浓度为(35.18±2.59)pg/ml,移植术后3 d略有升高,7 d时明显升高,14 d时IL-2的水平达高峰,21 d时下降,B、C、D组升高幅度与A组相比明显减少(P＜0.05),C组与B、D组相比升高幅度较大(P＜0.05),B、D两组之间无明显差异(P＞0.05).结论 抗树突状细胞单克隆抗体可抑制大鼠角膜移植排斥反应,延长角膜植片存活时间.     

细菌脂多糖及糖皮质激素对角膜基质成纤维细胞Toll样受体表达的影响

目的 通过研究细菌脂多糖（LPS）对人角膜基质成纤维细胞（HCF）Toll样受体（TLR）表达的影响,以及糖皮质激素对这种影响的调控作用,探讨TLR及糖皮质激素在角膜细菌感染中的可能作用.方法 选取人供体角膜细胞,对其进行分离、培养和鉴定,通过RT-PCR及quantitative Real-time PCR检测角膜基质成纤维细胞中TLR在mRNA水平的表达;并在细胞培养液中加入3种浓度LPS（1、10、100 ng/ml）共培养,检测TLR的表达.在此基础上,选择在10 ng/ml LPS的细胞培养液中加入糖皮质激素氢化可的松（1、10、100 μg/ml）进行干预,并通过Real-time PCR检测此种情况下HCF中TLR的表达.再通过免疫荧光组化来检测TLR2、TLR4在蛋白水平的表达.各组数据的差异性采用Student t检验和非参数秩和检验,Real-time PCR的倍数间的比较采用非参数统计.结果 TLR1-10 mRNA在HCF中均有表达,且表达量各不相同,其中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR10呈高表达.LPS能增加HCF中TLR mRNA的表达,且当LPS为10 ng/ml时,TLR的表达量最高.加入氢化可的松干预后,随着激素浓度的增加,HCF中TLR mRNA的表达却随激素浓度的增高而下降.免疫荧光组化结果显示,在10 ng/ml LPS刺激、10 ng/ml LPS＋10 μg/ml氢化可的松共同刺激以及正常条件培养3种情况下,TLR2、TLR4在HCF内均有表达,且强度不同,趋势与分子水平的表达一致.结论 TLR1～10 mRNA在HCF中均有表达.LPS能改变角膜基质成纤维细胞TLR mRNA的表达,提示该细胞表达的TLR与角膜抵御细菌的固有免疫密切相关;糖皮质激素可以调控LPS刺激的HCF TLR的表达,即对LPS刺激的HCF TLR的表达表现出抑制;提示当细菌的侵袭突破角膜上皮到达基质时,糖皮质激素起到了免疫抑制的作用.     

DATS对缝线诱导的大鼠角膜新生血管的影响及机制研究

目的：探讨二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide，DATS)抑制缝线诱导的大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)的生长情况，检测大鼠新生血管化角膜中VEGF、p-AKT 的表达量，初步探讨其抑制CNV的可能机制。

方法：缝线法诱导大鼠CNV模型，随机分为A组：含DMSO的生理盐水对照组(10只)； B组：25μmol/L DATS治疗组(10只)； C组：50μmol/L DATS治疗组(10只)； D组：100μmol/L DATS治疗组(10只)； E组：200μmol/L DATS治疗组(10只)。缝线后第7d裂隙灯下观察各组CNV的生长情况并计算面积。缝线后第14d取各组大鼠角膜组织行HE 染色，光镜下观察各组角膜病理组织形态，并采用RT-PCR 法检测VEGF mRNA 的表达情况，Western-blot 法检测VEGF、p-AKT蛋白表达情况。

结果：C、D、E组的CNV面积分别与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。HE切片显示，与A组相比，B、C、D组角膜水肿、新生血管、炎症细胞浸润情况逐渐减轻。与A组相比，B、C、D、E组的VEGF mRNA 的表达水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与A组相比，C、D、E组的VEGF、p-AKT蛋白的表达逐渐下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：DATS 能够抑制缝线诱导的大鼠CNV的形成，其机制可能与抑制VEGF的表达及使得p-AKT的失活有关。     

绿色荧光蛋白在大鼠角膜移植术后植片中的表达

目的研究穿透角膜移植术（PKP）后重组腺相关病毒（rAAV）载体介导的绿色荧光蛋白（GFP）在大鼠植片中的转染及表达情况。方法建立32只大鼠穿透角膜移植的动物模型,SD大鼠作为受体,Wistar大鼠作为供体,供体植片置于含1010μg/mL（病毒基因组数/mL）rAAV-GFP的DMEM/F121：1混合培养液中培养30min。按照不同的观察时间点用抽签法将角膜移植术后的大鼠随机分成4组,每组8只。手术后隔日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片的存活情况。于角膜移植术后1、2、4、12周取各组眼球在共焦显微镜下观察角膜组织中GFP的表达情况,Infinity-capt软件测量角膜植片内皮层中荧光的表达强度。结果各组中选取的受体角膜植片无水肿、混浊、新生血管及其他并发症发生。GFP基因表达阳性的角膜内皮细胞呈绿色荧光。各组角膜内皮细胞绿色荧光强度与背景亮度比值,A组：91.83±10.83;B组：128.67±4.32;C组：117.33±3.01;D组：118.50±3.02,转染后1周即有明显表达,4周及12周组较1周组强（P〈0.01）,2周组强度最高（P〈0.01）。结论通过共培养的方法,rAAV-GFP能够有效地转染到角膜内皮细胞中。PKP后GFP基因能够持续、高效、稳定地在移植片的角膜内皮细胞中表达。     

高糖对人角膜上皮细胞创伤修复中Cyclin D1 蛋白表达的影响

目的： 研究高糖环境对人角膜上皮细胞损伤修复的影响,初步探讨Cyclin D1蛋白在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中表达的意义。

方法： 模拟糖尿病角膜病变的高糖微环境,人角膜上皮细胞经复苏、培养传代后,分别设置等体积蒸馏水的DMEM完全培养基的正常对照组和含25mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基高糖处理组的两组细胞,细胞长满后进行划伤刺激,倒置相差显微镜下观察比较各组细胞生长状况及其变化,于不同时间点(0、12、24、48和72h)利用Western blot检测分析高糖培养的角膜上皮细胞中Cyclin D1蛋白的表达,qRT-PCR检测Cyclin D1 mRNA水平相对表达情况。

结果： 体外高糖处理条件下,人角膜上皮细胞划伤后修复速度减慢,漂浮细胞增多,细胞重新贴壁少,细胞间距增加,随着高糖处理时间的延长,细胞状态变差,生长速度慢; 正常组细胞损伤修复较快, 细胞密度增大,且形态规则,细胞膜光滑。Western blot 检测划伤刺激上调Cyclin D1的表达,但随着时间延长上调作用呈逐渐减弱,两组Cyclin D1最高表达量均出现在12h。高糖处理组Cyclin D1表达量低于正常对照组。qRT-PCR结果显示：高糖处理后,Cyclin D1 mRNA表达呈上调趋势,但随着高糖处理时间延长,上调作用减弱,且在48h处mRNA水平恢复至与对照组同一水平。

结论： 在角膜上皮细胞创伤愈合过程中,高糖呈负性调节,抑制Cyclin D1蛋白的表达,且与角膜上皮细胞增殖能力下降及凋亡相关。     

持续性角膜上皮缺损对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的建立持续性角膜上皮缺损模型,观察不同时相的角膜上皮缺损对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响。方法取健康雄性Wistar大鼠40只,随机平均分为8组,按每天处死1组大鼠的先后顺序分别命名为缺损组(A、B、C、D、E、F、G)和空白对照组。对全部缺损组大鼠建立持续性角膜上皮缺损模型,每天对缺损组大鼠左眼行角膜上皮刮除术,第1次术后1d处死缺损组A组大鼠,然后对剩余缺损组大鼠左眼行角膜上皮刮除术;第2次术后1d处死缺损组B组大鼠,然后对剩余缺损组大鼠左眼行角膜上皮刮除术,依此类推连续7d,并在无菌条件下获取各组骨髓间充质干细胞,流式细胞技术检测各组细胞周期。结果骨髓间充质干细胞细胞周期检测结果显示:B、D组S期细胞百分数分别为16.76%±4.49%、17.95%±2.77%,明显高于其他缺损组和对照组(均为P<0.05),B、D组G1期细胞百分数分别为72.26%±8.81%、71.33%±5.30%,均低于其他缺损组和对照组(均为P<0.05);但B、D组S期细胞及G1期细胞百分数差异无统计学意义(均为P>0.05),A、C、E、F、G组及对照组间的S期细胞及G1期细胞百分数差异亦无统计学意义(均为P>0.05)。结论持续性角膜上皮缺损模型,在缺损持续的第3天和第5天骨髓间充质干细胞的增殖能力明显提高。     

人角膜上皮细胞Toll样受体介导的炎性细胞因子的表达

目的探讨人角膜上皮组织和细胞系(THCE)对Toll样受体(TLR)2和TLR4的表达及后者介导THCE对烟曲霉菌(AF)抗原炎性反应的影响。方法用免疫印迹(Western blot)和免疫细胞化学方法检测人角膜上皮组织和细胞系THCE的TLR2和TLR4蛋白质表达与分布;采用自制的AF菌丝体片段(5×106／ml)和培养上清提取物(牛血清白蛋白当量浓度为10μg／ml)抗原,刺激培养的THCE细胞,于刺激1、2、4及8 h收集培养上清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测白细胞介素(IL)8和肿瘤坏死因子(TNF)α的水平。于刺激后30 min、1及2 h收集细胞,Western blot检测IκBα的表达变化以评价核转录因子κB的活化;采用抗体封闭实验分析封闭TLR2和TLR4对THCE细胞表达IL-8和TNF-α的影响。结果Western blot和免疫细胞化学结果显示人角膜上皮组织和THCE细胞均表达TLR2和TLR4蛋白质;AF菌丝体或培养上清抗原刺激THCE细胞后,培养上清液中IL-8和TNF-α于1 h后开始升高,至8 h分别达到(64．71±5．15)pg／ml和(32．46±3．28)pg／ml(菌丝体刺激组)及(94．94±11．92)pg／ml和(48．70±3．32)pg／ml(上清刺激组),分别为对照组THCE细胞培养上清中IL-8和TNF-α浓度的3．0倍和2．5倍及4．5倍和3．5倍(均P<0．01);同时Western blot检测AF菌丝体和AF上清刺激30 min后THCE细胞的IκBα表达(平均灰度值)分别由对照组的51．57±5．58和49．23±3．49下降为10．31±1．30和8．15±2．37(均P<0．01),2 h后恢复至对照组水平。在AF菌丝体刺激组,单纯封闭TLR2或TLR4部分抑制THCE细胞IL-8和TNF-α的分泌(均P<0．05),同时封闭两种受体则明显抑制了IL-8和TNF-α分泌(均P<0．01);AF上清抗原刺激组,单纯封闭TLR4和联合封闭两个受体均可明显抑制IL-8和TNF-α的分泌(均P<0．01),而单纯封闭TLR2未明显抑制二者的分泌(均P>0．05)。结论AF可能经过TLR-NF-κB信号转导通路诱导人角膜上皮细胞表达IL-B和TNF-α等炎性细胞因子。TLR2和TLR4可能介导人眼角膜上皮细胞对AF菌丝体的识别,而对AF上清抗原的识别则可能主要由TLR4介导。