鸡柔嫩艾美尔球虫第二代裂殖子表面抗原MZ5-7基因的克隆、表位分析及原核表达

用RTPCR的方法,从感染柔嫩艾美尔球虫(Eimeriatenella)第5天的鸡盲肠分离的第二代裂殖子中克隆出MZ57基因,并进行抗原表位分析和原核表达,结果表明,MZ57基因ORF为945bp,与GenBank里已知序列(登录号为L08257)比较核甘酸和氨基酸同源性均为99.9%。应用DNAStar软件对该基因的抗原表位进行了分析,发现其B细胞表位广泛分布在80～300区域,其中80～130区域、190～220区域和300～320区域更为突出,而T细胞基序则集中在123～190区域和220～300区域。根据MZ57基因序列重新设计一对引物,PCR方法扩增出不含信号肽长度为885bp的基因序列,克隆到pET28b获得重组质粒pET28bMZ亚,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达,表达的融合蛋白约36.5kDa10poundnote,符合目的蛋白大小;同时应用Westernblot方法与抗第二代裂殖子和子孢子的2种高免血清反应,结果表明抗裂殖子和子孢子血清均能识别MZP(裂殖子蛋白,MZP,merozoiteprotein)。     

宿主日龄对艾美耳球虫（Eimeria）早熟虫株感染力及雏鸡球虫免疫力的影响

用1000个柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)早熟株孢子化卵囊,1000个毒害艾美耳球虫(E.necatrix)早熟株孢子化卵囊和500个巨型艾美耳球虫(E.maxima)早熟株卵囊分别接种1,7和25日龄雏鸡,接种后14天分别用相应的200,200和100个亲本毒株孢子化卵囊进行攻虫.初次接种和攻虫后分别检查卵囊总产量.结果表明,3种早熟虫株的卵囊都能够成功的感染1日龄和7日龄雏鸡.初次接种后雏鸡都产生了不同程度的球虫免疫力.本研究证实,艾美耳球虫早熟株卵囊能够诱导初生和幼龄雏鸡产生球虫免疫力.     

5株柔嫩艾美耳球虫对4种抗球虫药的抗药性

试验选择260只19日龄雏鸡,随机分成26组,每组10只,研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)南京株、凤阳株、扬州株、宣城株和蒙城株对地克珠利(Diclazuril)、马杜霉素(Maduramicin)、氯羟吡啶(Clopidol)、氯苯胍(Robenidine)的抗药性。每株球虫均设4个感染用药组、1个感染不用药组,另外设1个不感染不用药组。以POAA、RLS、ROP、ACI作为指标,判定5株球虫对4种药物的抗药性。结果表明凤阳株、扬州株和蒙城株分别仅对马杜霉素、氯苯胍、地克珠利敏感,南京株和宣城株对该4种药物均已产生不同程度的抗药性。提示目前在凤阳、扬州和蒙城地区可分别合理地使用马杜霉素、氯苯胍和地克珠利,对其它药物须减少或暂停使用。     

三株柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）的繁殖力和免疫原？…

分别用柔蒋美耳球虫早熟弱毒株、鸡胚适应株和强毒株孢子化卵囊１０００个／只，给１０日龄无早雏鸡免疫接种，逐日粪便并进行克粪便卵囊计数，结果发现产毒株和鸡胚适应株的潜隐期均有不同程度缩短，繁殖力亦有不同程度的下降，同时进行了柔嫩艾美耳球虫不同株球虫的免疫原性比较，分别用三株卵囊免疫雏鸡，免疫剂理为１０００个／只，免疫后１４ｄ各用１０００个／只强毒株卵囊攻虫，逐日进行Ｏ．Ｐ．Ｇ．计数，发现各组免疫鸡攻虫     

中药多糖对柔嫩艾美尔球虫感染鸡细胞因子水平的影响

本文选用天然免疫活性多糖．香菇（Lentinus edodes）、银耳（Tremella fuifformisBerk）和黄芪（Astragalus membranaceus Bge）多糖,研究其对柔嫩艾美尔球虫感染鸡细胞因子IFN-γ和IL-2水平的影响。选择180只雏鸡并将其随机分为9组：3个多糖提取物添加组（LenE、TreE和AstE）,3个添加提取物并免疫接种疫苗组（LenE＋V、TreE＋V和AstE＋V）,1个球虫免疫组和2个对照组（球虫感染组和非感染组）。检测球虫感染后第7、14天鸡血清IFN-γ效价和脾淋巴细胞IL-2的水平。结果显示,球虫感染后第7、14天,添加多糖提取物并疫苗免疫组的血清IFN-γ效价显著高于单纯疫苗组（P〈0．01）。然而,单纯提取物添加组与单纯疫苗组之间没有显著差异。3种多糖提取物相比,感染第7天后,AstE组的IFN-γ效价最高,而TreE＋V组的IFN-γ的效价显著高于LenE＋v组和AstE＋v组。脾脏细胞IL-2产量与血清IFN-γ效价的表现基本一致。感染后第7天,提取物加疫苗免疫组的平均IL．2水平显著（P〈0．01）高于单纯疫苗组,提取物添加组的平均IL-2水平与单纯疫苗组之间没有显著差异。感染第14天后,多糖提取物添加组及多糖提取物加疫苗组的平均IL-2水平都与单纯疫苗组没有显著差异。IL-2产量在不同多糖提取物添加组间没有显著差异。本实验结果表明,多糖提取物抗球虫作用可能与刺激免疫细胞分泌IFN-γ和IL-2等细胞因子、提高T-细胞免疫应答有关;中药免疫活性多糖对球虫感染鸡有很好的免疫保护作用,当多糖与疫苗一起使用时,效果尤为明显。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中挥发性脂肪酸的影响

挥发性脂肪酸是维持肠道内正常微生态环境的重要因素。本文对鸡感染柔嫩艾美耳球虫以及鸡同时感染柔嫩艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌａ）和肠炎沙门氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）时盲肠中挥发性脂肪酸（ＶＦＡ）的变化情况进行了研究。鸡在感染球虫后第７ｄ时盲肠中的乙酸、丁酸的含量和ＶＦＡ总量呈显著下降（Ｐ＜０．０５）,但丙酸的下降不显著;在第１０ｄ、１４ｄ时各ＶＦＡ含量亦有所下降,但差异不显著。结果表明：球虫感染时肠炎沙门氏菌感染的增强与ＶＦＡ含量的下降有关。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中一些兼性厌氧共生菌的影响

兼性厌氧菌是鸡盲肠中共生微生物菌群的重要组成部分。本文对鸡感染柔嫩艾美耳球虫后盲肠中一些兼性厌氧微生物的变化情况进行了研究。结果表明 :鸡在感染球虫后第 7、 1 0、 1 4天时盲肠中肠杆菌的数量显著升高 ( P<0 .0 5) ;消化链球菌的数量显著减少 ( P<0 .0 5) ;在球虫感染后的第 7天时 ,盲肠中链球菌数量呈显著下降 ( P<0 .0 5) ,而在第 1 0、 1 4天时则无明显变化     

福建三株柔嫩艾美耳球虫的分离、鉴定及致病性的初步研究

采用单卵囊分离技术,从福建省莆田市、福清市和连江县等三地鸡场的病鸡盲肠内容物样品中,分离获得3株柔嫩艾美耳球虫Eimeria tenella,代号分别为PT0705、FQ0709和LJ0711.为比较这3株柔嫩艾美耳球虫的致病性,分别用1×104、5×104和10×104个孢子化卵囊的剂量感染14日龄和21日龄健康无球虫雏鸡,通过临床表现、死亡率、增重、病变计分等指标进行统计和分析,确定PT0705为毒性最强虫株.     

柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）BJ株TA4基因的克隆的序列分析

对柔嫩艾美耳球虫（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）ＢＪ株ＴＡ４基因进行了克隆和测序分析。经纯化的Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａＢＪ株７ｈ孢子化卵囊的总ＲＮＡ为模板，根据国外报道的序列设计一对引物，用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出ＢＪ虫株的ＴＡ４基因。用常规基因克隆方法把ＢＪ株ＴＡ４基因插入ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体，选取正方向插入的一个阳性克隆进行酶切分析及插入片段的全序列测序分析。结果表明：该序列全长１２２７个核苷酸，有一个含２３０     

宿主日龄对艾美耳球虫 (Eimeria)早熟虫株感染力及雏鸡球虫免疫力的影响(英文)

用 10 0 0个柔嫩艾美耳球虫 (E .tenella)早熟株孢子化卵囊 ,10 0 0个毒害艾美耳球虫 (E .neca trix)早熟株孢子化卵囊和 5 0 0个巨型艾美耳球虫 (E .maxima)早熟株卵囊分别接种 1,7和 2 5日龄雏鸡 ,接种后 14天分别用相应的 2 0 0 ,2 0 0和 10 0个亲本毒株孢子化卵囊进行攻虫。初次接种和攻虫后分别检查卵囊总产量。结果表明 ,3种早熟虫株的卵囊都能够成功的感染 1日龄和 7日龄雏鸡。初次接种后雏鸡都产生了不同程度的球虫免疫力。本研究证实 ,艾美耳球虫早熟株卵囊能够诱导初生和幼龄雏鸡产生球虫免疫力     

柔嫩艾美耳球虫田间分离株对马杜霉素耐药性检测

以对马杜霉素完全敏感和柔嫩艾美耳球虫豪顿株为参照 ,检测柔嫩艾美耳球虫 2个河北分离株(HBZ、HBH)、 2个山东分离株 (SDZ、SDT)对马杜霉素的耐药程度。按每羽 5× 1 0 4个孢子化卵囊的剂量接种 7日龄试验鸡只 ,接种后第 7天剖杀所有试验鸡 ,观察盲肠病变 ,计算平均增重、盲肠内容物卵囊数、粪便中卵囊排出量和抗球虫指数 (ACI)。以ACI值作为判定耐药程度的标准 ,ACI≥ 1 80判为敏感 ,1 6 0≤ACI<1 80判为部分耐药 ,ACI<1 6 0判为耐药。结果是柔嫩艾美耳球虫豪顿株的ACI为 1 98 3,柔嫩艾美耳球虫河北分离株HBZ、HBH组的ACI分别是 1 4 7 5、 1 5 3 7,山东分离株SDZ、SDT组的ACI分别是1 2 7 2、 1 30 0。试验证明柔嫩艾美耳球虫 2个河北分离株 (HBZ、HBH)、 2个山东分离株 (SDZ、SDT)对马杜霉素具有耐药性     

柔嫩艾美耳球虫山西分离株的分离与致病性观察

运用单卵囊分离技术,从山西省某鸡场鸡球虫感染粪便样品中获得l株纯种球虫,鉴定为柔嫩艾美耳球虫并命名为Eimeria tenella SX010323,并对其致病性进行了研究。（1）该球虫卵囊寄生于盲肠、为宽卵圆形,卵囊壁光滑、褐色,无卵膜孔,有极粒,无内、外残体。孢子囊呈长卵圆形,有斯氏体。卵囊大小范围为（16．80～28．80）μm×（14．40～25．20）μm,平均大小为（21．54±0．24）μm×（17．85±0．24）μm,形状指数为1．21±0．05。子孢子,大小范围为（10．20～12．75）μm×（4．40—7．25）μm,平均大小为（11．54±0．24）μm×（6．27±0．43）μm。潜隐期为141h,最短孢子化时间为19h;（2）63只11日龄的海兰白公雏随机分为7组,分别口服感染此新鲜卵囊1×10^3、5×10^3、1×10^4、2×10^4、5×10^4、1．0×10^5个,并设立不感染对照组。结果表明：所有感染组增重均低于对照组（P〈O．05）,各感染组间随着感染剂量的增加,增重和增重率显著降低,血便率和盲肠病变记分增加（P〈0．05）;（3）将4℃分别保存17、13、10、4、1个月和新鲜孢子化的虫株卵囊,以1．5×10^4个／只的剂量感染11日龄雏鸡,每组10只。结果表明：保存1个月和4个月活力较高,保存10个月活力开始下降,保存13、17个月活力下降较大。     

柔嫩艾美耳球虫卵囊cDNA文库的初建

利用Trizol一步法从柔嫩艾美耳球虫孢子化10h卵囊提取总RNA。利用poly(A)QuikmRNAIsolationkit分离纯化了mRNA。采用cDNASynthesisKit合成cDNA,以XR-λZAP为载体,构建了cDNA表达文库,经蓝白斑筛选,其重组率为98%,滴度为0·9×106pfu/mL,扩增后滴度为1×109pfu/mL。随机取10个克隆,提取λDNA后,经PCR鉴定,插入片段长度大于0·4Kb。该cDNA表达文库的构建为下一步功能基因的筛选等奠定了良好基础。     

艾美耳球虫子孢子从宿主细胞中逸出机制的初步研究

艾美耳球虫是一类重要的肠道病原,其裂殖生殖阶段的虫体逸出过程是造成畜禽肠道破坏的主要原因之一,但此逸出过程的机制仍鲜有报道。本研究以乙醇作为诱导剂研究柔嫩艾美耳球虫M2e株子孢子从宿主细胞中逸出的机制。结果显示,乙醇可诱导子孢子从MDBK细胞中逸出,此逸出过程依赖于虫体的运动能力;同时,乙醇可激发子孢子逸出相关的微线体蛋白2（Mic2）的分泌释放。进一步实验证实,螯合虫体内部钙离子明显阻断了子孢子逸出及Mic2蛋白的释放。本研究初步证实了与柔嫩艾美耳球虫逸出相关的蛋白和离子,为深入解析球虫致病的分子机制、研发新型抗球虫药物提供了新的研究方向。     

柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)BJ株TA4基因的克隆和序列分析

对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)BJ株TA4基因进行了克隆和测序分析。以纯化的E.tenellaBJ株7h孢子化卵囊的总RNA为模板,根据国外报道的序列设计一对引物,用RT-PCR方法扩增出BJ虫株的TA4基因。用常规基因克隆方法把BJ株TA4基因插入pGEM-T克隆载体,选取正方向插入的一个阳性克隆进行酶切分析及插入片段的全序列测序分析。结果表明:该序列全长1227个核苷酸,有一个含230个密码子的开放性读框,可编码分子量约为25kDa的多肽。其后紧随533bp的3'端非编码序列。TA4-BJ与国外株TA4比较,同源性99%,突变的4个核苷酸中,2个为有义突变,使其推测氨基酸Asp变为Gly,Phe变为Leu     

鸡柔嫩艾美耳球虫江苏分离株5401基因的克隆、序列分析及原核表达

分别以孢子化卵囊及第2代裂殖子为材料,应用RT-PCR技术克隆了柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）江苏分离株5401基因。测序结果表明该序列全长为864bp,序列本身是一个开放阅读框,将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较,第174位和第287位发生突变,碱基分别由T突变为C,由C突变为T。第1个为无义突变,第2个突变引起第96位氨基酸由A变为V。其核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将所获5401基因克隆到pGEX-4T-2获得重组质粒pGEX-4T-2-5401,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达。用大鼠抗柔嫩艾美耳球虫子孢子高免血清对原核表达产物进行Western Blotting检测,结果表明有2条融合蛋白,大小分别为90kDa和80kDa左右。     

鸡柔嫩艾美耳球虫发育相关基因的cDNA阵列检测及分析

为从分子水平上了解球虫发育的相关信息,本文以柔嫩艾美耳球虫的4个发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)为试材,分别与本实验室制备的柔嫩艾美耳球虫cDNA阵列进行杂交。经过分析,在4个不同发育阶段共有484个基因特异表达,其中仅79个为功能注释基因,其余为功能未知基因。在子孢子阶段筛选到了以下重要基因:1.糖代谢相关基因如糖原磷酸化酶、葡萄糖酸透性酶和丙酮酸激酶;2.入侵宿主细胞相关基因如微线蛋白2(MIC2)、黏液素和类黏液素蛋白。信号转导相关基因如磷脂酰激醇4激酶在未孢子化卵囊阶段特异低丰度表达,但是根据4个发育阶段杂交数据的趋势线,这些基因在子孢子和裂殖子阶段应高丰度表达。本研究为研制新的抗球虫药物提供了实验依据。     

鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag10在毕赤酵母中的表达及鉴定

sag基因家族是制备基因工程疫苗重要的候选基因。本研究通过在毕赤酵母Pichiapastoris中表达柔嫩艾美耳球虫Eimeriatenella表面抗原基因sag10,来探讨sag10表达后的生物学活性。本文首先提取柔嫩艾美耳球虫北京株第2代裂殖子总RNA,根据GenBank报道序列(AJ586552)设计引物,应用RT-PCR技术扩增得到鸡球虫表面抗原sag10基因。然后将sag10与真核表达载体pPIC9K连接,构建了pDQ052分泌型真核表达质粒,并转化毕赤酵母GS115,利用G418抗性筛选多拷贝重组菌株,进行优化表达。SDS-PAGE和Westernblot检测表达结果,在43kDa处有明显的免疫印迹条带,表明目的蛋白得到表达,而且能被特异性抗体所识别,说明表达的SAG10蛋白具有生物学活性。