肾上腺素诱导的血管平滑肌细胞C1~-电流及其与Ca2+运动的关系

为观察肾上腺素对主动脉平滑肌细胞C1-电流的影响及其与Ca2+内流的关系,采用膜片钳单离子通道(细胞贴附式)技术和Fura-2荧光法测定细胞内游离Ca2+浓度变化.结果发现,10 μmol/L肾上腺素可引起氯通道开放概率由对照组的0.061±0.0042增加到0.690±0.011;平均开放时间由1.08±0.23 ms延长到6.44±0.57 ms.此Cl-电流可被硝苯地平和EGTA抑制.肾上腺素可引起平滑肌细胞内游离Ca2+浓度由静息时77±13 nmol/L快速升高达峰值随后维持在高水平的内流平台相,达216±27 nmol/L.Cl-通道阻断剂尼氟灭酸在一定范围内呈浓度依赖性抑制肾上腺素诱发的Cl-电流及Ca2+内流,8 μmol/L 尼氟灭酸对细胞内游离Ca2+浓度的抑制率达27%±8%.结果表明,Cl-通道开放在调节平滑肌细胞Ca2+内流中起重要作用.     

β_1肾上腺素受体激动对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的观察β_1肾上腺素受体(β_1-AR)激动对血管平滑肌细胞(VSMC)迁移的影响。方法选择原代培养的Wistar大鼠胸主动脉VSMC并分7组:5%FBS组(对照组)、去甲肾上腺素(NE)刺激组(A组)、NE+β_1-AR阻断剂组(B组)、异丙肾上腺素(ISO)刺激组(C组)、ISO+β_1-AR阻断剂组(D组)、NE+蛋白激酶A阻断剂组(E组),NE+蛋白激酶抑制剂组(F组)。各组不同条件持续培养24 h后,以细胞划片法观察各组VSMC迁移距离的变化。另选VSMC加入10~(-4)～10~(-7)mol/L浓度NE刺激,观察其对细胞迁移效率的影响。结果与对照组比较,A组、C组VSMC迁移距离明显缩短,差异有统计学意义(P<0.01)。B组、D组迁移距离与对照组比较,差异无统计学意义。随着NE浓度增加,VSMC迁移距离逐渐缩短,NE对于VSMC迁移的抑制效应呈剂量依赖性。F组VSMC相对迁移距离与A组比较,差异无统计学意义。结论β_1-AR激动可抑制VSMC迁移,此过程不依赖蛋白激酶A的激活。     

β_2-肾上腺素受体亚型激动对于血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究β2-肾上腺素受体亚型(beta2-adrenergic receptor,β2-AR)激动对于血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的调控效应。方法应用携带重组β2-AR片段的腺病毒感染VSMC制备受体过表达模型。分别应用Zinterol(ZIN)以及异丙基肾上腺素(ISO)刺激生理状态和β2-AR过表达的平滑肌细胞后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和细胞计数法检测吸光度(A,曾称光密度OD)值和细胞数目的改变。结果ZIN刺激1天时A值开始下降(P<0.05),3天时抑制作用达高峰,抑制率为(32.00±1.62)%。细胞计数法测得ZIN激动3天时细胞数为对照组的(69.29±9.26)%。应用CGP20712A阻断β1-AR激活后,非选择性-βAR激动剂ISO刺激细胞后得到结果相似。特异性β2-AR拮抗剂ICI 118,551可逆转此抑制效应。ISO刺激过表达的β2-AR 3天时MTT检测结果相似。结论β2-AR亚型激动可抑制VSMC的增殖。     

氧化型脂蛋白诱导血管平滑肌细胞表达单核细胞趋化蛋白-1

为了解脂蛋白对平滑肌细胞的单核细胞趋化蛋白-1mRNA和蛋白表达的影响，在牛主动脉平滑肌细胞培养基中分别加入低密度脂蛋白、氧化型低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和氧化型极低密度脂蛋白，培养24h，用异硫氰酸胍法提取细胞的总RNA，用γ-32P末端标记的单核细胞趋化蛋白-1的寡核苷酸探针进行狭缝杂交分析，检测平滑肌细胞的单核细胞趋化蛋白-1mRNA的表达。同时用夹心酶联免疫吸附试验检测条件培养基中单核细胞趋化蛋白-1的蛋白含量。结果发现。培养的牛主动脉平滑肌细胞能表达单核细胞趋化蛋白-1mRNA及蛋白，氧化型低密度脂蛋白和氧化型极低密度脂蛋白使其单核细胞趋化蛋白-1mRNA的表达明显增强，同时也使其条件培养基中单核细胞趋化蛋白-1的蛋白水平增加，而低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白仅使平滑肌细胞中单核细胞趋化蛋白-1mRNA和蛋白的表达轻度增加。提示氧化型低密度脂蛋白和氧化型极低密度脂蛋白能诱导平滑肌细胞表达高水平的单核细胞趋化蛋白-1。     

分化型血管平滑肌细胞的原代培养

目的 建立大鼠主动脉分化表型血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)原代培养,为研究VSMC表型转化的分子机制提供体外研究模型.方法 无菌条件下分离大鼠胸主动脉中膜,组织贴壁法在Ⅳ型胶原蛋白包被培养瓶内培养大鼠胸主动脉VSMC,消化、过滤、离心,收集从组织块分离的单个细胞后,接种于含0.2%小牛血清、胰岛素样生长因子Ⅰ、DMEM培养液的层粘连蛋白包被的培养板上,培养1天后将培养液更换为不合血清及生长因子的DMEM.结果 根据细胞形态观察、免疫组织化学鉴定、兴奋剂刺激引发的收缩反应、分化型VSMC标志基因的检测,证实为分化型VSMC,分化状态可持续1周以上.结论 在组织贴壁法基础上,改变培养环境,可使VSMC较长时间保持于分化状态,是研究VSMC表型转化的分子机制良好的体外研究模型.     

原发性高血压患者血压参数与血管平滑肌细胞钙激活钾通道活性的相关性研究

目的:探讨原发性高血压患者血压参数与血管平滑肌细胞钙激活钾通道(KCa)活性的相关性。方法:切取21例原发性高血压患者(高血压组)及18例非高血压者(血压正常组)的肠系膜动脉小分支节段,用酶消化法获取血管平滑肌细胞,以膜片钳技术检测KCa通道的活性,通过Pclamp专用软件实时采样记录其平均开放时间(To),平均关闭时间(Tc),平均开放概率(Po)等。采用美国Meditech公司的ABPM-04动态血压监护仪,记录24h平均收缩压、24h平均舒张压、24h平均脉压、白昼血压、夜间血压、脉压变异性。结果:①两组血压参数:高血压组24h平均收缩压与平均舒张压、白昼平均收缩压与平均舒张压、夜间平均收缩压与平均舒张压、24h平均脉压、脉压变异性均显著高于血压正常组;②两组KCa通道活性变化:两组于细胞内面向外膜片下,不同浓度Ca2+较Ca2+浓度为0时Po、To增加,Tc缩短,有显著性差异;③高血压组血管平滑肌KCa活性与血压参数的相关性:24h平均舒张压、白昼及夜间平均舒张压、24h平均脉压升高时,Po显著增加,To显著延长,Tc显著缩短。但24h平均收缩压、白昼及夜间平均收缩压、脉压变异性变化与Po、To、Tc关系不明显。结论:原发性高血压患者肠系膜动脉平滑肌KCa通道活性明显高于非高血压者,但对Ca2+的敏感性降低。原发性高血压患者舒张压、     

动脉粥样硬化兔血管平滑肌大电导钙激活钾通道的活性探讨

目的研究动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)时血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Musele Cell,VSMC)大电导钙激活钾通道(Large conductance of calcium-activated potassium channel,BKca)的活性变化。方法3月龄新西兰兔随机分为实验组(AS组)和对照组(N组),每组10只。AS组喂高脂饲料以建立AS模型,对照组喂普通饲料,两组均喂养8周．采用单通道膜片钳技术测定VSMC的BKca的电流。结果随着电压和Ca~(2 )浓度的增加,AS组和对照组的通道开放概率(Po)逐渐增大。AS组的Po较对照组明显增大(P＜0．001)。在Ca~(2 )浓度为10~(-6)M时,AS组和对照组的Po分别增加(68．9±34．4)倍和(126．4±70．6)倍,差别有显著性意义(P＜0．05)。结论AS组VSMC的BKca活性增强。AS组VSMC的BKca的Ca~(2 )敏感性降低。     

胃动素对大鼠近端结肠平滑肌细胞钙钾电流的影响

目的 研究胃动素对大鼠近端结肠平滑肌细胞(PCSM)膜电压依赖性钾通道及L型钙通道电流的影响,以探讨其增强结肠运动的机制.方法 采用酶解法分离大鼠PCSM,采用全细胞模式膜片钳技术测定PCSM电压依赖性钾离子通道快速激活型钾电流及延迟整流型钾电流和L型钙电流,组间比较采用配对t检验.结果 胃动素对快速激活型钾电流及延迟整流型钾电流无明显作用.(0.5～10.0)×10-5 mmol/L胃动素浓度依赖性地激活L型钙电流,6×10-5 mmol/L胃动素在-10、0及10 mV刺激电压下,使最大电流密度分别增加154.61％、62.69％及21.02％,激活动力学曲线明显左移,半数激活电压由给药前的(2.740±1.211) mV降至(-25.290±0.614)mV(t=8.534,P=0.007),斜率因子则无明显差异.结论 胃动素通过促进钙离子内流来增强结肠平滑肌的收缩幅度,但不能通过平滑肌细胞的平衡电位及动作电位频率的变化来改变结肠平滑肌的收缩频率.     

血管紧张素-(1-7)对大鼠血压和血管平滑肌细胞增殖的作用

目的　探讨血管紧张素 (1 7) [Ang (1 7) ]对大鼠血压和血管平滑肌细胞增殖的作用。方法　多导生理记录仪检测血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )和Ang (1 7)所致的大鼠血压变化 ,免疫细胞化学染色和Westernblot方法检测血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖细胞核抗原 (PCNA)蛋白表达。结果　 10 - 7mol kgAngⅡ快速静脉注射射致大鼠收缩期血压(SBP)和舒张期血压 (DBP)明显升高 (P <0 .0 1) ;而同等浓度的Ang (1 7)引起大鼠SBP明显下降 (P <0 .0 1) ,DBP有下降趋势 ,但与用药前相比差异无显著性意义。免疫细胞化学染色显示PCNA主要在VSMC核内分布 ,AngⅡ刺激VSMC后PCNA蛋白表达明显增高 (P <0 .0 5 ) ,Ang (1 7)刺激后PCNA蛋白表达明显减少 (P <0 .0 1)。结论　Ang (1 7)具有舒张血管和抑制VSMC增殖的作用     

动脉粥样硬化兔主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道变化及意义

目的　探讨动脉粥样硬化 (atherosclerosis,AS)兔主动脉平滑肌细胞钙激活钾 (Calcium activatedpotassium ,KCa)通道变化及意义。方法　 2 0只健康新西兰白兔随机分为AS组和对照组 ,每组 10只。用酶消化法获取单个主动脉平滑肌细胞 ,通过膜片钳记录技术检测AS兔主动脉平滑肌细胞KCa通道的活性 ,并在浴液中分别加入不同浓度的Ca2 + ,实时采样记录通道的开放概率 (Po)、平均开放时间 (To)、平均关闭时间 (Tc)和电流幅值 (Am) ,以加钙前作为对照组观察上述参数的变化。结果　AS组KCa通道的活性明显高于对照组。结论　AS血管平滑肌细胞KCa通道的活性明显增加 ,可能是AS血管发生代偿性扩张的机制之一。     

氯通道参与脑血管平滑肌细胞Ca2+池操纵性Ca2+内流

研究Cl-通道在牛脑血管平滑肌细胞Ca2+池操纵性Ca2+内流中的作用.采用培养的脑血管平滑肌细胞,在生物荧光双波长影像分析系统用Fura-2/Am荧光探针测定单个细胞内游离Ca2+浓度.结果发现① Cl-通道阻断剂DIDS(0.75 μmol/L)能降低内皮素1(10-7 mol/L)刺激引起的脑血管平滑肌细胞Ca2+内流,抑制率为29.6%±3.9%,随后加入Cl-通道阻断剂NPPB(10 μmol/L)能继续降低平台相,抑制率为44.9%±8.7%;交换加药顺序,NPPB能降低内皮素1刺激引起的Ca2+内流,DIDS能进一步降低Ca2+内流.②DIDS(0.75 μmol/L)能降低三磷酸腺苷(10 μmol/L)刺激引起的脑血管平滑肌细胞Ca2+内流,抑制率为26.7%±10.5%,随后加入NPPB(10 μmol/L)能继续降低平台相,抑制率为54.3%±9.6%;交换加药顺序,NPPB能降低三磷酸腺苷刺激引起的Ca2+内流,DIDS能进一步降低Ca2+内流.③DIDS(0.75 μmol/L)能降低环匹阿尼酸(10 μmol/L)刺激引起的脑血管平滑肌细胞Ca2+内流,抑制率为26.5%±5.0%,随后加入NPPB(10 μmol/L)能继续降低平台相,抑制率为46.1%±4.2%;交换加药顺序,NPPB能降低环匹阿尼酸刺激引起的Ca2+内流,DIDS能进一步降低Ca2+内流.提示对DIDS、NPPB敏感的非同一性Cl-通道参与内皮素1、三磷酸腺苷、环匹阿尼酸触发的脑血管平滑肌细胞 Ca2+池操纵性Ca2+内流.     

主动脉平滑肌钙激活钾通道的增龄变化

目的研究不同月龄大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的活性,探讨老化过程中血管平滑肌细胞钙激活钾通道的变化。方法取三组Wistar大鼠(分别为1月龄、6月龄、20月龄各20只)主动脉用酶消化法获得单个平滑肌细胞。以膜片钳技术检测细胞钙激活钾通道的活性,记录不同钳制电压下单通道电流的平均开放时间、平均关闭时间、平均开放概率、电流幅值,并绘制成电流—电压关系曲线。对比各月龄组Wistar大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道活性。结果(1)各月龄组大鼠主动脉平滑肌细胞随着膜电位从+10 mV向+60 mV方向去极化,钙激活钾通道的电流强度逐渐加大,但加大幅度随月龄增加而降低。1月龄、6月龄和20月龄大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的电导值分别为192±47 ps、177±56 ps和163±35 ps,但差异无统计学意义(P>0.05)。(2)在内面向外式膜片上,20月龄和1月龄大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道平均开放概率分别为0.009±0.001和0.015±0.004,两组比较具有显著性差异(P<0.01)。20月龄和1月龄大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道平均关闭时间分别为2 260±653和2 512±185*,两组比较具有显著性差异(P<0.01)。(3)在同样的对称性高钾浴液中,加入不同浓度钙后,发现钙对各月龄组大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道均有明显的激活作用,表现为平均开放概率逐渐加大,平均关闭时间逐渐缩短。但对各月龄相同钙浓度间比较发现,6月龄组平均开放概率比1月龄加大,而20月龄组平均开放概率和平均开放时间比6月龄和1月龄组均显著降低。结论大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的活性随着年龄增大而下降。     

肺动脉平滑肌细胞与低氧性肺血管重塑形成机制

低氧条件下肺血管收缩、重塑,继而导致肺血管的持续对抗,其中以中膜增厚为主的肺血管重塑是导致低氧性肺动脉高压持续不可逆性病理改变的重要因素.肺动脉平滑肌细胞是肺动脉中膜的主要构成部分,慢性缺氧条件下由于各种活性介质及细胞生长因子稳态的失衡,肺动脉平滑肌细胞聚集、增殖、肥大及分泌胞外基质;另外,肺动脉平滑肌细胞通过各种信号通路与内膜的内皮细胞及外膜的成纤维细胞相互作用,在低氧性肺血管重塑过程中起着至关重要的作用,本文将对肺动脉平滑肌细胞与低氧性肺血管重塑形成机制的最新研究概况作一综述.     

Cl-通道在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用

为探讨Cl-通道在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用 ,采用细胞计数和氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入实验 ,并结合fura 2荧光测定细胞浆Ca2 + 浓度等技术 ,研究了Cl-通道阻断剂对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响。结果发现 ,Cl-通道阻断剂 4,4-二异硫氰酸二丙乙烯 2 ,2 -二磺酸 (DIDS ,0 .0 1μmol/L～ 0 .1mmol/L)可抑制 5 %小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖 ,其作用具有时效性和量效性 ,其它Cl-通道阻断剂如茚满羟基丙酸 (IAA 94,0 .1μmol/L～ 1mmol/L)、5 硝基 2 (3 苯丙氨基 )苯甲酸 (NPPB ,0 .1μmol/L～ 1mmol/L)、4 乙酰氨基 4 异硫氰酸 2 ,2 二磺酸 (SITS ,0 .1μmol/L～ 1mmol/L)、二苯丙氨基 2 ,2 二羧酸 (DPC ,0 .1μmol/L～ 1mmol/L)和速尿 (10 μmol/L～ 1mmol/L)等均无此作用 ,且DIDS对电压依赖性钙通道没有直接的影响。结果提示小牛血清可以开放DIDS敏感的Cl-通道 ,且该通道可能在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖的调控上起着一定的作用。     

Cl-通道在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用

为探讨Cl^-通道在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用,采用细胞计数和氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入实验,并结合fura-2荧光测定细胞浆Ca^2 浓度等技术,研究了Cl^－通道阻断剂对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响。结果发现,Cl^-通道阻断剂4,4－二异硫氰酸二乙丙烯2,2－二磺酸（DIDS,0．01μmol/L－0．1mmol/L)可抑制5％小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖,其作用具有时效性和量效性,其它Cl^-通道阻断剂如茚满羟基丙酸（IAA－94,0．1μmol/L-1mmol/L)、二苯丙氨基－2,2－二羧酸（DPC,0．1μmol/L-1mmol/L)和速尿（10μmol/L-mmol/L)等均无此作用,且DIDS对电压依赖性钙通道没有直接的影响。结果提示小牛血清可以开放DIDS敏感的Cl^-通道,且该通道可能在小牛血清引起的小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖的调控上起着一定的作用。     

川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖及表达c-myc基因的影响

为观察川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖的影响,在建立凝血酶诱导的体外培养的兔主动脉血管平滑肌细胞增殖模型后,应用免疫细胞化学方法观察川芎嗪对血管平滑肌细胞表达ｃ－ｍｙｃ基因蛋白的影响;并用流式细胞术观察了血管平滑肌细胞增殖周期的变化。结果发现,川芎嗪能够显著抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞ｃ－ｍｙｃ基因蛋白表达增加,使血管平滑肌处于ＧＩ期的细胞数显著增多,Ｓ期和Ｇ２＋Ｍ期的细胞数显著减少。结果提示,川芎嗪对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖有显著抑制作用,其机制与抑制ｃ－ｍｙｃ基因表达有关。     

辛伐他汀对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的观察辛伐他汀对血管平滑肌细胞增殖、迁移及血管内皮生长因子表达的影响。方法体外培养大鼠原代血管平滑肌细胞,体内建立大鼠动脉粥样硬化血管损伤模型,分为正常对照组、动脉粥样硬化损伤组、低剂量和高剂量辛伐他汀组。4周后处死动物,酶法测定血脂水平,检测胸主动脉和左颈总动脉内膜/(内膜 中膜)比值,免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应法检测血管内皮生长因子的表达。结果辛伐他汀对血管平滑肌细胞的增殖和迁移无双向调节作用。小剂量辛伐他汀对血管平滑肌细胞的增殖和迁移无促进作用,大剂量辛伐他汀抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移,且随着时间延长和浓度增加其抑制作用增强,这种作用不依赖辛伐他汀的调脂性。辛伐他汀能减少血管平滑肌细胞血管内皮生长因子的表达,且高浓度的辛伐他汀显著减少血管内皮生长因子的表达。结论辛伐他汀可能通过减少血管平滑肌细胞血管内皮生长因子的表达来抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。     

人类巨细胞病毒在脐动脉血管平滑肌细胞中的增殖

目的 研究人类巨细胞病毒对血管平滑肌细胞的感染性,为人类巨细胞病毒致动脉粥样硬化及移植物血管病机制研究建立细胞模型.方法 自脐动脉分离血管平滑肌细胞,以1 个感染复数(MOI)的人类巨细胞病毒感染该细胞,观察细胞病变效应,以RT-PCR技术检测人类巨细胞病毒 IE基因在平滑肌细胞内的表达,同时以电镜技术检测平滑肌细胞内的病毒颗粒.结果 人类巨细胞病毒感染脐动脉血管平滑肌细胞后第3天即可出现细胞病变,至第8天已出现明显的细胞病变效应,以RT-PCR技术可从感染人类巨细胞病毒 AD169株的平滑肌细胞内扩增出预期的产物,经测序验证为人类巨细胞病毒 IE基因,以电镜技术可从感染人类巨细胞病毒 AD169株的血管平滑肌细胞中观察到病毒颗粒.结论 人类巨细胞病毒 AD169株可以感染人血管平滑肌细胞,并复制出子代病毒颗粒.为人类巨细胞病毒致动脉粥样硬化及移植物血管病的机制研究提供了较好的实验依据及细胞模型.