高纯度CD3~-CD56~+CD16~+NK细胞体外扩增技术的研究

本研究探索高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞体外扩增技术。应用免疫磁珠分选法(MACS)分离出高纯度的CD3-CD56+CD16+NK细胞,置于含10%人AB血清的造血干细胞培养基(SCGM)中,加入细胞因子IL-2、IL-15、SCF组成不同培养体系进行体外扩增。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8试剂盒检测对K562细胞的杀伤率等方法比较不同培养体系对NK细胞增殖前后的数量、纯度及杀伤活性的影响;并采取相同方法对IL-2的浓度与NK细胞增殖效率及杀伤活性之间的关系进行探讨。结果发现,经免疫磁珠分选法所得的高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞扩增18天后,IL-2/IL-15/SCF组扩增倍数显著高于其他组(p0.05);含细胞因子组的NK细胞对K562细胞的杀伤活性显著提高,尤其是IL-2/IL-15组和IL-2/IL-15/SCF组在效靶比10∶1时杀伤活性均高达90%以上。低、中、高浓度IL-2组扩增倍数之间比较差异无显著性(p0.05),而在对K562细胞杀伤率的比较上,高浓度组明显高于低、中浓度组(p0.05)。结论:在10%人AB血清的SCGM中加入IL-2/SCF/IL-15细胞因子组合,可使经MACS纯化的NK细胞在体外高效地活化及增殖;本培养体系中IL-2浓度较低(1 000U/ml)时,NK细胞的扩增效率及对K562细胞的杀伤率与IL-2的浓度高低无相关性;而高浓度的IL-2(≥1 000U/ml)可进一步激活纯化后NK细胞的体外杀伤活性。     

CD16CD56NK细胞在重症肌无力发病机制中的作用

目的:研究重症肌无力(MG)患者外周血CD16+CD56+ NK细胞的水平,及其在MG发病机制中的作用.方法:应用流式细胞仪检测16例MG患者与20名正常对照外周血CD16+CD56+NK细胞的百分率.结果:MG组外周血CD16+CD56+NK细胞百分率(13.81±5.59)%明显高于对照组的(7.23±1.95)%,P <0.05.结论:NK细胞在MG发病中起重要作用,既可通过分泌IFN2γ等细胞因子途径促进MG的发病,也可通过细胞毒作用发挥免疫效应.     

脐血细胞成分及CD34CD38细胞含量分析

自20世纪80年代末起，采用脐血输注治疗再生障碍性贫血、恶性肿瘤等疾病取得疗效［1，2］。国内外学者近年来开始对脐血造血干/祖细胞等有效成分进行分析，由于研究方法、条件不同，所得结果差异较大。笔者采用全自动血细胞分析仪系统检测脐血细胞成分，并与相同条件下的成人外周血作比较;同时以流式细胞术为基础，建立了CD34CD38细胞的检测方法，分析脐血的细胞学组成和CD34CD38细胞的含量特点。     

外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率对血小板减少性疾病鉴别诊断的价值

目的探讨外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率对不同血小板减少性疾病鉴别诊断的价值。方法应用流式细胞术检N28例正常对照者、47例特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者、16例再生障碍性贫血（AA）患者、18例骨髓增生异常综合征（MDS）患者、13例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者、37例急性非淋巴细胞白血病（ANLL）患者、11例慢性粒细胞白血病（CML）患者、6例慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者和12例自身免疫性溶血性贫血（AIHA）患者外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率。结果ITP组外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率低于正常对照组（P〈0．05）;AA组低于正常对照组（P〈0．05）,高于MDS（P〈0．05）;白血病组较正常对照组明显降低（P〈0．05）,ALL组、ANLL组、CML组、CLL组之间无明显差异,白血病患者外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率随病情发展、复发而降低,病情控制缓解而上升;AIHA组与正常对照组相比无明显差异。结论外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率的检测对鉴别血小板减少性疾病有重要意义,对患者的疗效及预后判断有一定的参考价值。     

一例成年男性CD19与CD16＋56双阳性淋巴细胞的报道

我们曾在2006年检测到一例门诊患者部分淋巴细胞CD19与CD16＋56双阳性,报道如下。 一、材料和方法 1．研究对象患者,男,50岁,到浙江医院门诊做体检,包括生化检删、血常规、淋巴细胞分群、特种蛋白检测等。该患者血常规结果显示,     

对脐血CD34~ CD38~-细胞的研究揭示脐血移植成人的可能性

通过在生长因子依赖的长期培养体系中加入转化生长因子β1(TGF-β1)的反义核酸或抗TGF-β1抗体以阻断TGF-β1的抑制作用,比较了脐血和骨髓的CD34~ CD38~-及CD34~ CD38~ 亚群在长期培养中的增殖反应以及产生早期造血前体细胞的能力。结果显示:脐血中CD34~ CD38~-细胞占CD34~ 的比例为4％,比骨髓多4倍;和成人骨髓移植平均所需的骨髓标本相比,一份常规脐血标本含有的CD34~ CD38~-细胞所产生的CFU-GEMM和骨髓相当,CFU-GM为骨髓的2倍,BFU-E为骨髓的3倍;由脐血产生的集落明显大于由骨髓产生的集落。提示脐血更富含造血干细胞并具有较高的增殖潜能。脐血中晚期祖细胞量低于骨髓。以上研究结果提示脐血可用于成人进行造血细胞移植。     

人类脐血CD34^＋细胞的研究进展

本文综述了近年来对脐血ＣＤ３４＾＋细胞（即造血干／祖细胞）的研究进展，表明虽脐血ＣＤ３４＾＋细胞水平低于正常成人骨髓，但其干细胞比例较高且造血功能较强，有利于移植后长期造血的重建。     

白血病患儿外周血T细胞亚群检测的临床意义

本研究观察急性白血病患儿外周血T细胞在不同病程阶段的变化,了解白血病患儿的免疫状况。应用流式细胞术检测42例急性白血病患儿,另选取50例正常儿童（对照组）外周血CD4^＋、CD8^＋、CD4^＋/CD8^＋比值、CD3^＋以及NK细胞在不同病程阶段的动态变化。结果表明：急性淋巴细胞白血病（ALL）与急性髓系白血病（AML）初诊患儿的CD3^＋,CD4^＋、CD8^＋细胞比例和CD4^＋/CD8^＋比值均值显著低于对照组（P〈0.05）,初诊时急性白血病患儿的NK细胞值显著低于对照组（P〈0.05）;ALL与AML患儿完全缓解期（CR）3、6和12个月时的NK细胞水平虽然缓慢上升,但与对照组比较仍具有统计学差异（P〈0.05）。结论：急性白血病患儿在病情发生以及治疗过程中细胞免疫功能存在紊乱,经治疗获CR后患儿病情好转,细胞免疫渐渐恢复,但恢复速率慢,该结果为患儿后续使用免疫调节剂治疗提供依据。     

哮喘患儿外周血CD56,CD25检测的临床意义

目的：探讨哮喘息儿外周血分化群（CD）56、CD25水平检测的临床意义。方法：应用流式细胞仪（FCM）检测哮喘患儿外周血单个核细胞中CD56 、CD25 细胞数。结果：缓解期组CD56十细胞数百分比[（12.0±3．1）％］及CD25 细胞数百分比[（4．1±2．2）％]与正常对照组比较均无显著性差异（P＞0．05）；哮喘发作组CD56 细胞数百分比[（9、4±2．2）％]低于正常对照组[（11．9±3．2）％]及缓解期组（P＜0．01）；哮喘发作组CD25 细胞数百分比[（7.2±2．1）％]高于正常对照组[（4．1±1．8）％]及缓解期组（P＜0．01）。结论：CD56 、CD25 细胞数与小儿哮喘的发病过程有一定关系。     

抗CD3单抗包被技术培养脐血来源CD3AK细胞实验研究

目的 探索CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3AK细胞)更为合适的培养方法,为临床治疗提供有效的免疫效应细胞.方法 以脐血为细胞培养来源,经包被技术和传统培养两种方法分别获得CD3AK细胞(A组及B组),经细胞因子体外诱导获得CIK细胞(C组),对3组细胞的增殖数量、对K562/A02细胞株杀伤活性进行比较分析.结果 培养第4天3组细胞均开始增殖,A组CD3AK细胞增殖速度较其他两组快,在增殖数量方面A组在第7、10、13天分别是C组的4.01、5.85、2.88倍,两组比较差异有统计学意义(P<0.01);是B组数量的1.73、1.85、1.45倍,两组比较差异有统计学意义(P<0.05).在对K562/A02细胞株杀伤活性方面,3组之间比较均无统计学意义(P>0.05).结论 抗CD3单抗包被技术获得的CD3AK细胞增殖速度快,更容易获得临床需要的治疗量.     

脐血CD4+CD25+CD127low调节T细胞及淋巴细胞亚群分析

目的 检测新生儿脐带血淋巴细胞亚群和调节性T细胞比率,了解脐带血免疫学的特征.方法 使用Sysmex XE2100血细胞分析仪分别计数脐带血、新生儿母亲及对照组外周血淋巴细胞;采用流式细胞术分别检测其CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD3- CD16+56+ NK细胞、CD3+ CD4+细胞、CD3+ CD8+细胞占淋巴细胞百分比,以及CD4+ CD25+CD127low调节性T细胞占CD4+细胞的百分比.结果 脐带血、新生儿母亲及对照组淋巴细胞计数分别为(3.68±1.07)×109/L,(1.42±0.44)×109/L和(2.06±0.88)×109/L;B淋巴细胞为:15.71％±3.89％,11.13％±3.79％和9.69％±2.22％;CD4+T细胞为:50.27％±9.08％,37.25％±7.13％和34.65％±7.17％;调节性T细胞为:6.94％±1.09％,5.09％±0.95％和4.8％1±0.99％.上述检测结果脐带血均显著高于母亲及对照组,P＜0.01,母亲与对照组差异无统计学显著性意义P＞0.05.三组间CD3+T细胞(69.64％±9.97％,74.83％±5.91％和69.41％±5.42％)和NK(11.36％±7.93％,10.48％±6.78％和16.31％±4.69％)细胞无显著性差异,P＞0.05.脐带血中CD8+T细胞低于母亲及对照组(19.38％±6.62％,32.39％±2.08％和31.16％±1.87％),P＜0.01.结论 脐血中高水平的CD4+ CD25+ CD127low调节性T细胞和低水平的CD8+T细胞有助于保持脐带血的低免疫状态.     

混合脐血血浆对脐血CD34^＋细胞体外扩增的作用

采用两步法分离出脐血CD34~ 细胞,比较研究了混合脐血血浆联合IL-3,IL-6,GM-CSF,Epo 4种中、晚期造血因子和单纯的4种造血因子情况下脐血CD34~ 细胞的体外扩增。结果表明,混合脐血血浆联合造血因子对粒-巨噬细胞集落形成单位(granulocyte-macrophage colony-forming unit,CFU-GM),红系爆式集落形成单位(burst-forming unit of erythriod,BFU-E),混合集落形成单位(minxed colony-forming unit,CFU-mix)3种集落的扩增效果明显优于单纯的4种造血因子联合组,差异具有统计学意义(P<0.01),但单纯混合脐血血浆扩增效果较差。脐血造血细胞扩增对子成人脐血移植有重要意义。上述结果提示,混合脐血血浆的扩增成功,可代替或弥补早期造血生长因子的作用,用于脐血造血细胞的体外扩增。     

脐血CD3AK细胞治疗恶性肿瘤的观察与护理

目的研究用脐血单个核细胞制备CD3AK细胞的抗肿瘤作用,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标及临床应用中的护理规范.方法分离脐血单个核细胞,用IL-2+CD3Ab诱导CD3AK细胞;测定肿瘤患者用CD3AK细胞治疗前后外周血单核细胞(PBMC)的自然杀伤(NK)活性,静脉滴注过程中严密观察患者体温和脉搏等反应.结果肿瘤患者输注CD3AK细胞一个疗程后,其PBMC的NK杀伤活性由63%升高到81%,平均升高28%,发热反应不到3%,大多在38 ℃以下,未经处理自行消退.结论 (1)CD3AK细胞输注能明显提高肿瘤患者PBMC的NK活性;(2)CD3AK细胞输注安全有效,无明显副作用;(3)肿瘤患者PBMC的NK活性测定可望成为肿瘤生物治疗近期疗效的一个参数.     

人外周血Vα24 NKT细胞和CD3+CD56+CIK 细胞生物学特性的比较研究

目的进一步认识Vα24 NKT细胞和CIK细胞在生物学特性的差异。方法从人外周血单个核细胞扩增NKT细胞和CIK细胞;经免疫磁珠纯化获得高纯度的TCRVα24 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞。运用流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的表型、细胞因子和细胞坏死相关因子的表达情况,并用DIOC18染色及流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的细胞杀伤活性。结果经纯化TCRVα24 Vβ11 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞的纯度均达到>90%;纯化后的Vα24 NKT细胞多数为CD4 和DN NKT细胞,高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56;而纯化后的CIK细胞则以CD8 T细胞为主,高表达CD3、CD56,低表达CD161,几乎不表达TCRVα24和Vβ11。在抗原刺激下,CD3 CD56 CIK细胞的IFN-γ、TNF-α、Perforin、FasL、TRAIL表达水平均高于NKT细胞,但CD3 CD56 CIK细胞几乎不分泌IL-4,而NKT细胞则分泌高水平的IL-4;CD3 CD56 CIK细胞对肿瘤细胞株K562、U937、Jurkat的杀伤率均远远高于NKT细胞。结论TCRVα24 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞是两类完全不同的细胞群,在抗肿瘤免疫和免疫调节中可能起着不同的作用。     

脐血CD34+细胞与单个核细胞的体外扩增特性研究

目的　探讨CD34+ 富集细胞和单个核细胞 (MNC)的体外扩增特性。方法　利用Min iMACS系统富集CD34+ 细胞 ,在相同条件下与同批MNC进行对照培养 ;观察了再次富选和MNC培养上清 (MNC SN)对CD34+ 富集细胞扩增的影响 ;并尝试了MNCCD34- 细胞的培养。结果　虽然CD34+ 富集细胞具有很高的扩增潜力 ,但在培养过程中 ,其集落密度和CD34 + 细胞含量却始终呈下降趋势 ,而MNC在培养中却出现了一个上升的趋势 ,集落密度和CD34+ 细胞含量分别由第 0天的 (4 12± 16 7) 10 5细胞和 (1.12± 0 .4 2 ) %增至第 7天的 (116 2± 5 6 6 ) 10 5细胞和 (4 .17± 1.4 4 ) % ;再次富选可以使培养过的CD34+ 富集细胞的总细胞和CD34+ 细胞扩增能力大大提高 ;MNCCD34- 细胞具有集落形成和转化为CD34+ 细胞的能力 ;MNC SN对CD34+ 富集细胞的集落形成有促进作用 ,而同时又对CD34+ 细胞有促分化作用。结论　CD34+ 富集细胞在体外大量扩增的同时存在大量分化 ,其在培养过程中产生的CD34-细胞对CD34+ 细胞的扩增有抑制作用 ;脐血MNC中大量的CD34- 细胞含有造血干 祖细胞 ,其分泌的细胞因子有促进CD34+ 细胞向较为成熟的集落形成祖细胞分化的作用。     

脐血及白血病缓解期骨髓中CD34+细胞筛选及体外扩增

脐血及白血病缓解期骨髓中ＣＤ３４＋细胞筛选及体外扩增姜容韩明哲赵英新韩俊领冯四洲李成文严文伟造血干细胞体外扩增对于造血干细胞移植、基因治疗等研究有着重要的意义。脐血干细胞的有效扩增可望将脐血用于成人移植［１］，可使骨髓移植患者在移植后快速渡过造血危相...     

脐血CD34+细胞的分离与纯化

脐血造血干细胞的分离是进行干细胞移植、体外扩增培养的关键.研究采用明胶自然沉降法、Fi-coll分层法分离脐血MNC后,用MACS分离纯化CD34+细胞,计数并用流式细胞仪进行纯度分析.结果显示每份脐血的采集量平均为95±52 ml,3 g/dl明胶自然沉降法所获MNC密度平均为(5.76±0.67)×107/ml;CD34+细胞密度平均为(5.53±1.16)×105/ml,较Ficoll分层法高(P＜0.01).因此,3 g/dl明胶自然沉降法是一种较理想的分离MNC的方法,用明胶沉降法和MACS相结合是分离脐血CD34+细胞的理想方法.