沉默核干细胞因子基因对HL-60白血病细胞形态学和细胞化学影响的检测

目的探讨体外沉默白血病细胞核干细胞因子（Ns）基因转染后细胞形态学和细胞化学特征改变与细胞生物学行为的关系。方法体外合成Ns特异性短发夹状RNA（shRNA）转染HL-60白血病细胞,逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫印迹法评价Ns基因沉默和Ns蛋白合成抑制效果,倒置显微镜观察活体细胞形态,Wright—Giemsa染色观察细胞形态学改变,血液分析仪测定细胞大小、粒度和均-性变化,髓过氧化物酶（MPO）、α-乙酸萘酯酶（α—NAE）和过碘酸-雪夫反应（PAS）测定反映细胞化学特征变化。结果沉默Ns基因导致HL-60白血病细胞发生了形态学变化,细胞核和细胞质出现了进-步分化和成熟特征,Wright—Giemsa染色观察到细胞核碎裂现象,血液分析仪发现细胞变得大小不均并有较多核碎裂和无核的细胞碎片存在,细胞内定MPO、α—NAE酶活性和PAS反应增强。结论沉默Ns基因表达能促使HL-60细胞进-步分化、成熟,细胞形态学和细胞化学特征发生相应改变,这些形态学变化可以作为研究细胞生物学行为改变的依据之一。     

沉默核干因子基因表达对HL-60白血病细胞凋亡的影响

本研究探讨靶向沉默白血病细胞的核干因子（nucleostemin,NS）基因对HL-60白血病细胞凋亡的影响。用T7启动子介导体外合成两条短发夹状干扰RNA（NS-shRNA）,以其中沉默NS基因作用强的一条NS-shRNA转染HL-60细胞,同时以与NS基因序列无关小干扰RNA转染HL-60细胞作对照,应用RT-PCR检测被转染的HL-60细胞NS-mRNA抑制效果,倒置显微镜下观察活体细胞形态变化,Wright-Giemsa染色观察细胞胞体和细胞核形态学变化,以流式细胞仪（FCM）和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）测定凋亡细胞数并计算凋亡阳性率。结果表明：HL-60细胞被NS-shRNA转染48小时后NS-inRNA阻断率达到74．94％,凋亡率分别为（25．32±3．06）％和（27．3±3．21）％,对照组仅（3．12±0．38）％和（3．30±1．52）％,转染组与对照组比较差异显著（P〈0．01）。Wright-Giemsa染色显示细胞发生核碎裂并出现“凋亡小体”。结论：靶向沉默NS基因表达可诱发和促进HL-60白血病细胞发生凋亡,为NS基因作为恶性肿瘤治疗的候选靶基因奠定了理论基础。     

核干细胞因子基因沉默的HL-60细胞在裸鼠体内致瘤性变化

目的探讨核干细胞因子(NS)基因沉默的HL-60细胞在裸鼠体内致瘤性变化。方法体外合成两条短发夹状RNA(NS-shRNA),选择其中沉默NS基因作用强的一条,转染HL-60细胞后接种于裸鼠体内,另设阴性对照组和空白对照组。定期观察裸鼠成瘤情况,并取各组裸鼠的肿瘤组织进行病理切片及HE染色,免疫细胞化学染色法测定NS蛋白。结果 NS-shRNA转染HL-60细胞后接种于裸鼠体内长出肿瘤的时间长于对照组(18～19dvs.14～15d),瘤体肿块明显小于两对照组,肿瘤终体积小于两对照组[(1282.6±434.1)mm3vs.(2533.3±683.1)mm3,(2632.5±621.8)mm3],均存在统计学差异(P<0.05);阴性对照组、空白对照组两组间比较无统计学差异(P>0.05)。转染组结缔组织及血管比阴性对照、空白对照两组少,肿瘤组织中细胞排列松散,留有很多间隙;HL-60细胞大小不均一更明显,核碎裂和小核细胞增多,核染色质致密程度不均一,瘤巨细胞减少。结论 NS基因沉默的HL-60细胞的致瘤能力减弱,可能与NS基因沉默后HL-60细胞的生物学性状改变有关。     

核干细胞因子基因在急性白血病细胞表达的检测和意义

目的检测核干细胞因子(Nucleostemin,NS)基因在急性白血病细胞的表达情况,探讨NS基因与急性白血病发病机制之间的关系。方法从NS基因的3个变异体中筛选出共同序列设计特异性引物,应用逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)对白血病细胞系K562、HL60和急性粒细胞白血病(M1、M2a和M3),急性单核细胞白血病(M5a和M5b),急性淋巴细胞白血病(ALL)进行NS基因表达水平的检测,以健康人和良性贫血患者骨髓单个核细胞作为对照。PCR产物片段为418bp。结果K562、HL60明显高表达NS基因,它与内参相比灰度值分别为0·735±0·260、0·449±0·190;急性白血病病例有相似的结果。M1+M2a、M3、M5a、M5b、ALL的灰度值分别为0·687±0·210、0·408±0·160、0·866±0·270、0·448±0·190、0·403±0·190;对照组健康人和良性贫血不表达或极微弱表达NS基因;同一细胞类型白血病,细胞分化停滞在早期阶段的表达NS基因的水平明显高于细胞分化停滞在后期的白血病,如K562高于HL60;M1、M2a高于M3;M5a高于M5b(P<0·01)。结论NS基因在急性白血病细胞中呈高表达状态,这与白血病的发生、发展有一定关联;不同分化阶段的白血病细胞表达NS基因水平存在着差异。NS基因在急性白血病细胞的表达情况也显示了癌细胞和干细胞在某些方面的相似性,可能是一个潜在的基因治疗靶位。     

重组人白血病抑制因子对HL-60白血病细胞的抑制作用

白血病抑制因子(LIF)有抑制HL-60白血病细胞集落生成和诱导HL-60细胞分化的作用。当LIN浓度为2000U/ml时,HL-60集落数从对照的115±17下降到3±3。成熟细胞比例从对照的1.1±0.4上升到8.8±1.5。LIF还可与IL-6及SCF等因子有协同作用使上述作用进一步加强。LIF可能成为临床治疗某些白血病的有效药物。     

雷帕霉素对急性髓系白血病细胞系HL-60和HL-60/VCR生长的抑制作用

为了探讨mTOR抑制剂雷帕霉素对急性髓系白血病（acute myeloid leukemia;AML）细胞的增殖和药物敏感性的影响。以AML细胞株HL-60和多药耐药HL-60/VCR细胞系为研究对象,采用MTT法测定生长曲线和流式细胞术检测细胞周期;Western blot检测P糖蛋白（P-glycoprotein,Pgp）的表达。结果显示：与空白对照组细胞比较,雷帕霉素能抑制HL-60和HL-60/VCR细胞生长增殖（p〈0.05）,且随着浓度升高,增殖抑制率逐渐增高,24-72小时的细胞增殖抑制率随着时间的延长而有所增高（p〈0.05）,同时可阻滞细胞从G1期到S期的细胞周期转换。雷帕霉素抑制HL-60/VCR细胞的Pgp蛋白的表达。与柔红霉素单独应用相比,雷帕霉素50nmol/L、100nmol/L与柔红霉素联合应用使HL-60和HL-60/VCR细胞增殖抑制率明显增高（p〈0.05）,尤其是当先加雷帕霉素,而24小时后再加柔红霉素时。结论：mTOR抑制剂雷帕霉素对HL-60和多药耐药的HL-60/VCR细胞的生长均有抑制作用,除伴G0/G1期阻滞外,还增加细胞对柔红霉素的敏感性,这为临床难治性AML治疗提供新的治疗手段。     

槲皮素对HL-60细胞形态及血管内皮生长因子表达的影响

目的：探讨槲皮素对HL-60细胞的形态、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法：以HL-60细胞为研究对象，细胞形态学观察采用Wright染色法：膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)标记检测细胞凋亡率；VEGF表达采用ELISA法。结果：①经槲皮素处理后，HL-60细胞形态学上出现凋亡特征性改变。②槲皮素处理后HL-60细胞凋亡率明显增加。③槲皮素处理后HL-60细胞显著降低VEGF表达。结论：槲皮素在体外能抑制白血病细胞HL-60生长并诱导其凋亡；槲皮素可抑制白血病细胞分泌VEGF。     

Nucleostemin下调联合雷帕霉素对HL-60细胞自噬与凋亡影响的初步研究

目的：研究Nucleostemin(NS)下调联合雷帕霉素对HL-60细胞自噬和凋亡的影响并探讨其在HL-60细胞中的作用。方法：通过NS-RNAi-GV248重组慢病毒载体转染HL-60细胞后检测NS蛋白的表达。采用流式细胞术检测沉默NS和/或雷帕霉素处理24、48 h后HL-60细胞的凋亡变化;采用Western blot技术检测各组细胞中NS、LC3、p62、BCL-2、Bax蛋白的表达。结果：重组慢病毒载体成功下调HL-60细胞NS表达。经雷帕霉素处理后,细胞凋亡率均明显增加（P<0.05）,且48 h凋亡更明显。与NS敲低组、雷帕霉素组相比,NS下调联合雷帕霉素组处理48 h后,其凋亡明显增加（P<0.05）,LC3-II/LC3-I比值显著增加（P<0.05）,p62蛋白表达下降更显著（P<0.05）,并且BCL-2/Bax比值减低更明显（P<0.05）。结论：NS下调联合雷帕霉素可增强HL-60细胞的凋亡和自噬,并且其诱导HL-60细胞的凋亡可能与BCL-2、Bax蛋白的表达有关。     

NPM1基因沉默的HL-60及其耐药细胞株的建立

本研究旨在构建针对HL-60细胞及其耐药细胞株(HL-60/ADR)的NPM1-RNAi的细胞模型,为研究NPM1基因在白血病耐药过程中的作用奠定实验基础。通过针对NPM1基因的shRNA与线性化的pGCSIL-GFP载体进行连接转化,对获得的重组子(pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA)进行PCR和测序鉴定。采用慢病毒载体系统将pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体与pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA共转染293T细胞,包装成NPM1-RNAi-LV,将慢病毒载体感染HL-60及HL-60/ADR细胞。采用实时定量RT-PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平验证建立的细胞株的转染效率。结果表明,成功构建了重组真核表达载体pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA,并通过慢病毒载体系统包装成NPM-1-RNAi-LV;将NPM1-RNAi-LV转染至HL-60及HL-60/ADR细胞后,从mRNA水平上看,对细胞的NPM1 mRNA表达有显著抑制,达到90%以上(p<0.05);从蛋白水平上看,对细胞的NPM蛋白表达具有显著的抑制效果,表明转染后的HL-60及HL-60/ADR细胞的NPM1基因特异性沉默。NPM1基因沉默后,HL-60/ADR对阿霉素的耐药性有一定程度的下降。结论:成功构建了NPM1-RNAi的HL-60及HL-60/ADR细胞模型,为进一步研究NPM1基因在白血病耐药过程中的作用建立了良好的实验基础。     

鼠尾草酸联合三氧化二砷对HL-60细胞的影响

鼠尾草酸（Carnosic acid，CA）是迷迭香的天然药效成分。近年研究发现，2．5—10．0μmol／LCA显著提高1，25（OH）2D3和全反式维甲酸（ATRA）对白血病细胞HL-60和U937诱导分化能力，而CA本身诱导分化能力有限。CA增强1，25（OH）2D3诱导白血病细胞向单核系成熟分化的能力与促进1，25（OH）2D3受体的表达有关。     

不同剂量32P体外照射对HL-60细胞的影响

目的观察32P体外照射对HL-60细胞的增殖抑制和凋亡作用.方法通过光镜法、MTT、JAM及流式细胞法(FCM)分析3种不同剂量(0.02 mCi/mL,0.10 mCi/mL,0.50 mCi/mL)的32P分别处理HL-60细胞24、48、72 h后,对HL-60细胞增殖抑制和凋亡的影响.结果32P有明显抑制HL-60细胞增殖的能力,肿瘤细胞抑制率均随32P剂量的增加而增加,呈剂量依赖性(P＜0.01),随照射时间的延长,细胞增殖抑制率增加,呈照射时间依赖性(P＜0.05);光镜法显示实验组凋亡细胞和死亡细胞随照射剂量的增大而增多;JAM法分析细胞DNA的断裂程度,32P作用于HL-60细胞后随着辐射剂量的增加DNA断裂程度不断增加,实验组均高于正常对照组(P＜0.05,P＜0.01);流式细胞法检测不同剂量的32P处理HL-60细胞24、48、72 h后,除48 h的低剂量组外,其余实验组HL-60细胞凋亡率均明显高于正常对照组(P＜0.01,P＜0.05).结论32P在体外有明显的抑制HL-60细胞增殖和诱发细胞凋亡的作用,32P是一种很好的抗肿瘤放射性核素.     

次声对HL-60白血病细胞株生长的影响

目的：探讨次声治疗仪对HL-60人白血病细胞株生长的影响。方法：采用次声治疗仪发生的相同强度（档位3）不同作用时间的次声直接作用于离体培养的HL-60细胞（作用组），对照组细胞暴露在空气中，分别在实验处理的15min、30min、60min、90min和120min取样检测，以台盼蓝活细胞计数，MTT比色法及流式细胞仪技术，观察比较HL-60细胞的生长情况。结果i不同次声作用时间对HL-60细胞生长影响的差异不具显著性意义（p〉0．05）。结论：治疗剂量的次声处理对HL-60细胞的生长无明显影响。     

骨髓间充质干细胞对HL-60细胞增殖的影响

本研究探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对HL-60细胞增殖的影响及相关的分子机制。将单独培养的HL-60细胞作为对照组,与MSC共培养的HL-60细胞作为实验组。在不同时间计数两组HL-60细胞,描绘其时间-数量曲线;流式细胞仪检测2组HL-60细胞的细胞周期、凋亡细胞比例及Survivin和Bcl-2蛋白的表达。结果表明,实验组HL-60细胞的增殖明显受抑,在第5-7天差异显著(P<0.01),实验组HL-60细胞分布于G0/G1期的比例增加〔对照组(47.0±9.0)%vs实验组(70.0±16.0)%,P=0.003)〕,并且出现凋亡峰。实验组HL-60细胞Survivin和Bcl-2蛋白表达同时下调。Bcl-2表达率在对照组为(63.0±9.1)%,实验组为(50.0±14.1)%(P=0.045);Survivin表达率在对照组为(94.0±9.3)%,实验组为(77.0±11.8)%(P=0.006)。结论:骨髓MSC对HL-60细胞的增殖有抑制作用,并促进HL-60细胞凋亡。     

正常人骨髓基质细胞对HL-60和HL-60/VCR 细胞凋亡易感性的影响

为了观察正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对白血病敏感细胞HL-60和多药耐药细胞HL-60／VCR凋亡易感性的影响，先建立HL-60或HL-60／VCR细胞与HFCL细胞共培养体系；采用瑞氏-吉姆萨染色和吖啶橙／溴化乙啶(AO／EB)染色，分别在光镜和荧光显微镜下进行形态学观察；TUNEL检测晚期凋亡细胞，流式细胞术检测细胞周期、凋亡峰和annexin V阳性的早期凋亡细胞；Western blot检测Bcl-2、活化的胱冬蛋白酶(caspase)-3蛋白和P糖蛋白(Pgp)的表达变化。结果表明，经topotecan(TPT)处理后的HL-60和HL-60／VCR细胞，在光镜和荧光显微镜下均有典型的凋亡细胞形态学改变，这些改变具有时间和剂量依赖性；annexin V染色后能检测到早期凋亡细胞；细胞周期显示：G1期细胞比例增高，S期减低，并有明显凋亡峰；TUNEL能检测到许多阳性细胞；同时出现活化的caspase-3，伴有Bcl-2的表达下调，但与HFCL细胞共培养后，经TPT处理的HL-60和HL-60／VCR细胞中早期和晚期凋亡细胞有所减少，凋亡峰减低，而且活化的Caspase-3表达减弱，Bcl-2蛋白表达上调，且以直接接触组为甚。结论：正常骨髓成纤维样基质细胞HFCL能轻度降低白血病HL-60和HL-60／VCR细胞对TPT的凋亡易感性，并有caspase-3和Bcl-2重要信号传导分子的参与。     

应用人类全基因组芯片检测多药耐药白血病细胞株HL-60/VCR与敏感细胞株HL-60基因的表达差异

本研究利用基因芯片技术检测白血病多药耐药细胞株HL-60/VCR及其亲本细胞株差异基因表达谱,探讨急性白血病多药耐药机制.本试验提取白血病细胞株HL-60及其多药耐药细胞株HL-60/VCR的mRNA,在反转录及体外转录过程中分别用生物素进行标记,与Affymetrix公司人类全基因组芯片U133A杂交,用Affymetrix专用芯片扫描仪G2500A GeneArray Scanner及Microarray Suite、Micro DB^TM GeneChip LIMS、GeneChip DMT分析软件系统处理杂交信号获取结果.结果表明：白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60/VCR差异显示基因5 507条,其中耐药细胞株中上调表达基因3 100条,下调表达基因2 407条;差异极显著性基因1 040条,表达上调435条,下调605条,涉及与细胞生长活动及信号转导相关的基因.结论：多基因参与白血病细胞株的多药耐药机制,基因芯片技术是并行分析多个基因、探讨白血病多药耐药机制的有效方法.     

二烯丙基二硫对HL-60细胞血管内皮生长因子表达及分泌的影响

目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对白血病细胞株 HL-60的生长抑制作用和对 HL-60细胞血管内皮生长因子(VFGF)mRNA 的表达及 VEGF 蛋白分泌的影响。方法采用 MTT 法观察DADS 对体外培养的 HL-60细胞的生长抑制;应用 ELISA 法检测药物作用前后 HL-60细胞培养上清液中 VEGF 蛋白的含量;半定量 RT-PCR 法检测药物作用前后 HL-60细胞 VEGF mRNA 表达水平。结果DADS 对 HL-60细胞具有明显的生长抑制效应,0.625,1.250和2.500μg/ml DADS 作用 HL-60细胞24 h 的细胞生长抑制率分别为(8.19±3.34)%,(16.79±2.07)%,(21.30±2.72)%;作用48 h 的细胞生长抑制率分别为(11.93±3.93)%.(22.81±2.31)%,(30.74±2.03)%;作用72 h 的细胞生长抑制率分别为(16.68±2.37)%,(28.54±3.26)%,(36.59±2.37)%,其对 HL-60细胞的生长抑制率与药物浓度有明显依赖关系(r>0.9,P<0.01),各实验组随作用时间增加抑制率明显增加(r>0.7,P<0.01);0.625,1.250,2.500 μg/ml DADS 作用 HL-60细胞48 h 和72 h 与空白对照相比均能下调HL-60细胞 VEGF mRNA 的表达及 VEGF 蛋白的分泌(P<0.01),三个不同浓度 DADS 组间差异均有统计学意义(P<0.01),其下调 HL-60细胞 VEGF mRNA 的表达及 VEGF 蛋白的分泌效果与药物浓度呈相关性(r>0.9,P<0.01)。结论 DADS 能明显抑制 HL-60细胞的增殖;DADS 可能通过抑制 HL-60细胞 VEGF mRNA 的表达及 VEGF 蛋白分泌发挥抗白血病的效应。     

细胞质在顺铂诱导HL—60细胞凋亡中的作用

在建立Bcl-2高表达细胞及其对照细胞株基础上,用无细胞体系研究了细胞质在顺铂诱导HL-60细胞凋亡中的调控作用。实验结果显示,凋亡细胞胞质提取物可引起提取的正常细胞核的固缩及染色质边缘优,类似于完整的细胞凋亡的改变。Bcl-2高表达细胞的胞质提取物具有抗凋亡能力。上述结果说明引起凋亡的物质及对抗凋亡的物质在细胞质中都存在,说明细胞质在顺铂诱导的HL-60细胞凋亡中起着较重要的作用。