改良R18S3冷冻液对cre转基因小鼠精子冷冻效果探讨

目的 比较改良精子冷冻液与传统冷冻液对cre转基因小鼠的精子冻存和体外受精率的影响,建立采用精子冷冻技术稳定保存两种cre转基因小鼠的方法.方法 以R18S3作为精子冷冻液和以R18S3作为基础液添加477 μmol/L的硫代甘油（MTG）配成R18S3＋MTG冷冻液,冻存Neurog3-cre和Itgax-cre雄鼠精子,采用相同方法复苏精子.同时,以两种cre小鼠的背景鼠C57BL/6J作为对照组,另选用ICR和FVB小鼠用两种冷冻液冻存并复苏精子,进行体外受精,统计受精率来评价精子冷冻效果.结果 以R18S3冷冻并复苏的两种ere小鼠及野生型C57BL/6J的精子体外受精率分别为10.5％,11.6％和12.0％,无显著差异.以R18S3＋MTG冷冻并复苏的精子体外受精率分别为66.4％,62.5％和67.6％,相对传统冷冻液有显著提高.ICR和FVB小鼠用改良精子冷冻液前后的体外受精率分别是34.1％,46.7％和65.7％和70.2％,后者都有所提高.结论 改良后的R18S3＋MTG冷冻液能明显提高以C57BL/6J为背景的cre转基因小鼠冷冻后精子的体外受精率,对ICR和FVB品系的小鼠的体外受精率也有提高.     

激光打孔技术用于冷冻精子复苏后体外受精的研究

目的 比较精子冷冻前后体外受精率的变化,以及卵子经过激光打孔后,与新鲜精子及冷冻复苏精子体外受精,比较受精率的变化.方法 冷冻2个近交系小鼠和5个品系的基因工程小鼠的精子,比较新鲜精子和冷冻复苏精子与C57BL/6J小鼠卵子做体外受精的结果;然后对C57BL/6J卵子做激光打孔,再与新鲜及冷冻复苏精子体外受精结果进行比较.结果 (1)新鲜C57BL/6J精子受精率为50.4％,C57BL/6N的受精率为48.6％,远高于冷冻精子复苏后的受精率(17.7％和15.4％);卵子打孔后,再与C57BL/6J及C57BL/6N的新鲜精子或冷冻复苏精子受精,受精率分别为64.6％,59.7％和60.4％,48.3％,冷冻精子复苏后的体外受精率提高显著;(2)5个基因工程小鼠新鲜精子和冷冻精子复苏后与C57BL/6J卵子的受精率分别为:91.5％ vs 28.6％,77.4％vs 52.3％,40.7％ vs 12.7％,56.5％ vs 14.6％,65％vs 6.5％;这5个品系的小鼠新鲜精子和冷冻精子复苏后与C57BL/6J打孔卵子的受精率分别为75％ vs 50.8％,74.3％ vs 35.6％,75.7％ vs32.7％,79.5％ vs 48.9％,59.5％ vs 46.3％,冷冻精子复苏后的受精率较之不打孔卵子,提高显著.结论 激光打孔技术用于冷冻复苏精子的辅助体外受精,可以显著提高冷冻精子复苏后的受精率,使得精子保种更加经济有效.     

两种抗冷冻剂对不同品系小鼠精子冷冻的影响

目的建立一套比较理想的小鼠精子冷冻复苏的方法。方法采用R18S3和FERTIUPTM-CPA两种保护剂,对DBA/2、C57BL/6J、KM和B6.129S7-Ldlrtm1Her/J四个品系的小鼠精子进行冷冻,冷冻精子用三种方法复苏,以体外受精率来评价精子冷冻的效果。结果以R18S3作为冷冻保护剂,DBA/2(73.3%,88.4%,55.6%)和KM(64.9%,60.2%,39.6%)品系小鼠冷冻精子复苏后体外受精率差异显著(P<0.05),C57BL/6J(3.0%,10.3%,3.7%)和B6.129S7-Ldlrtm1Her/J(0%,5.0%,0%)结果差异不显著(P>0.05);以FERTIUPTM-CPA作为冷冻保护剂,DBA/2(33.6%,14.1%,91.6%)、C57BL/6J(8.4%,21.0%,4.9%)和B6.129S7-Ldlrtm1Her/J(8.2%,10.0%,28.9%)品系小鼠冷冻精子复苏后体外受精率差异显著(P<0.05),而KM(48.1%,48.0%,48.1%)小鼠冷冻精子复苏后体外受精率差异不显著(P>0.05)。结论对于DBA/2和KM品系小鼠来说,用R18S3或FERTIUPTM-CPA冷冻精子,选择一种恰当的复苏方法,均可以得到较理想的体外受精率,而C57BL/6J和B6.129S7-Ldlrtm1Her/J品系小鼠无论采用哪种冷冻保护剂,选择何种方法复苏精子,得到的体外受精率都较低。     

不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究

目的　探讨不同品系小鼠的体外受精、胚胎和精子的低温保存效果。方法　本实验分别在中国科学院上海实验动物中心 (SLAC)和日本熊本大学动物资源开发中心 (CARD)对 13个品系小鼠 (C57BL 6J、BALB c、C3H HeJ、ICR、KM、FVB、MRL、NOD、CBA、DBA 2、CD 1、BDF1、B6C3F1)的体外受精 (IVF)率、胚胎培养及移植成绩进行了比较研究。结果　各品系小鼠新鲜精子的IVF率 15 1%～ 87 9% ,冻融精子的IVF率 8%～ 80 % ;冷冻胚胎的复苏率4 2 6 %～ 83 9% ;冻融胚胎移植后的产仔率在 17 8%～ 5 1 8%。结论　遗传背景不同的小鼠体外受精率、冷冻胚胎复苏率和胚胎移植的产仔率差异有显著性。但同一品系两个实验室间的新鲜精子的IVF率、冷冻胚胎的复苏率及移植产仔率差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;冻融精子的体外受精率CARD明显高于SLAC(P <0 0 1)。     

小鼠精子冷冻的研究

目的：探索、建立一套小鼠精子冷冻方法。方法：通过CPS和RS318两种冷冻液对比试验；进行不同解冻法试验；对B6DF1、CD-1、DBA、C57BL／6四种品系小鼠精子分别进行快速冷冻和缓速冷冻，将解冻精子、鲜精与卵母细胞进行体外受精，并进行体外培养、胚胎移植，通过受精率和受孕率对冷冻方法进行筛选。结果：两种冷冻液试验、不同解冻法试验的受精率差异均无显著性。B6DF1、CD-1、C57BL-6品系小鼠快速冷冻精子解冻后与卵母细胞的体外受精率(35％、34％、17％)显著低于鲜精(60％、59％、34％)、缓速冷冻精子的受精率(62％、58％、30％)，此三种品系小鼠快速、缓速冷冻精子体外受精试验的受孕率均显著低于鲜精试验的受孕率。结论：缓速冷冻法是小鼠精子冷冻的适宜方法，干解冻法和稀释法处理冷冻液可简单有效地解冻精子。     

不同冷冻保护剂用于C57BL／6J小鼠精子冷冻的比较研究

目的 通过对不同冷冻保护剂用于C57BL/6J小鼠精子冷冻后冻融精子体外受精率的比较,建立一套更适合C57BL/6J小鼠精子冷冻的方法.方法 以R18S3为基础液添加不同体积浓度的卵黄和甘油作为冷冻保护剂对C57BL/6J和Y3F小鼠精子进行冷冻,并采用同种方法复苏精子,以体外受精率来评价精子冷冻的效果.结果 以R18S3为基础液分别添加体积浓度为5%、10%、15%、20%、25%卵黄离心后获得的上清液作为冷冻保护剂,C57BL/6J小鼠冻融精子体外受精率分别为18.7%、15.6%、36.0%、40.0%、29.7%,差异显着( P<0.05); 以R18S3为基础液分别添加体积浓度为1%、2%、3%、4%、5%、6%的甘油作为冷冻保护剂, C57BL/6J小鼠冻融精子体外受精率分别为7.8%、10.0%、16.9%、6.0%、10.3%、18.1%,差异显著( P<0.05); 以R18S3+5%卵黄离心后获得的上清液+6%甘油、R18S3+15%卵黄离心后获得的上清液+2%甘油、R18S3+20 %卵黄离心后获得的上清液+1%甘油作为冷冻保护剂,C57BL/6J小鼠冻融精子体外受精率分别为: 16.7%、36.0%、22.9%,差异显著(P<0.05); 以R18S3作为冷冻保护剂,C57BL/6J小鼠冻融精子体外受精率为25%,异常卵裂率为2.6%.Y3F小鼠冻融精子体外受精率为52.2%,异常卵裂率为 5.1%.结论 以R18S3为基础液添加15%或20%的卵黄离心后获得的上清液可以有效提高C57BL/ 6J小鼠冻融精子的体外受精率但添加不同浓度的甘油却降低C57BL/6J小鼠冻融精子体外受精率.添加卵黄和甘油冷冻效果不如卵黄但好于甘油.     

两种玻璃化胚胎冷冻方法对不同品系小鼠胚胎冷冻结果比较

目的 探讨EFS和DAP两种玻璃化冷冻方法对不同品系小鼠胚胎冷冻的效果。方法6个品系小鼠（KM、ICR、BALB/c、C57BL/6J、OB/OB、LAP/rtTA0F59）的2-cell胚胎分别用EFS和DAP两种玻璃化冷冻方法进行冷冻和复苏,比较两种冷冻方法的胚胎复苏率和着床率。结果 6个品系小鼠冷冻胚胎EFS方法的平均复苏率为69.97%（47.9%～83.6%）,DAP方法的平均复苏率47.23%（26.3%～76.7%）EFS方法明显优于DAP方法。其中KM、ICR和BALB/c小鼠EFS方法的冷冻复苏率显著高于DAP方法（P<0.01）;冻融胚胎移植后EFS方法的平均着床率27.23%（1.75%～45.0%）,DAP方法的平均着床率31.43%（7.0%～46.3%）。除KM、ICR小鼠外,其他4个品系小鼠的着床率DAP方法高于EFS方法。结论 KM和ICR远交群小鼠胚胎适合用EFS方法冷冻保存;C57BL/6J、OB/OB、LAP/rtTA0F59三个品系小鼠DAP方法优于EFS方法,但差异不大; BALB/c小鼠两种玻璃化冷冻方法的冻融胚胎着床率均较低,需进一步研究。     

小鼠体外受精及其胚胎体外培养的比较研究

目的 通过比较不同品系小鼠体外受精情况以及不同培养液对C57BL/6J小鼠胚胎体外培养效果的实验,进一步完善小鼠体外受精和早期胚胎体外培养体系.方法 对C57BL/6J、DBA/2、FVB/NJ、BALB/c、KM、ICR及BARR Ⅱ小鼠进行超排和体外受精,并对C57BL/6J小鼠体外受精后的2-细胞胚胎用HTF、CZB、KSOM、M16、HECM五种培养液在相同条件下进行体外培养到囊胚,计算4-细胞～囊胚的发育率.结果 各品系小鼠平均排卵数为13.0～38.7个(P＜0.01),体外受精率为70.2%～92.8%(P＜0.05).不同培养液至4-细胞的发育率为60.3%～95.8%,其中KSOM的4-细胞发育率为95.8%,最适合2-细胞向4-细胞的发育.8-细胞发育率为52.8%～91.1%,桑椹胚发育率为40.6%～87.5%,囊胚发育率为5.1%～75.4%,各阶段胚胎发育率均差异显著.其中适合于金黄仓鼠桑椹胚、囊胚发育的HECM-2并不支持C57BL/6J囊胚的发育,其囊胚发育率只有5.1%,CZB最适合其囊胚的发育.结论 遗传背景是影响小鼠超排及体外受精效果的主要因素之一.葡萄糖的存在不利于克服2-细胞发育阻断,胚胎在8-细胞期以前,主要能源物质不是葡萄糖,直到桑椹胚后期,葡萄糖才是主要的能量物质.磷酸盐可引起胚胎发育阻断.氨基酸和EDTA有利于克服胚胎发育阻滞.     

一种以小鼠精子为主导的综合性保种体系

目的 利用活体保种、精子冷冻技术及辅助生殖技术建立一套安全的综合性保种体系.方法 以单侧睾丸摘除方法获得ICR、BDF1、C57BL/6J和GFP四种小鼠的附睾精子进行冷冻保存实验,术后恢复的公鼠继续用于自然繁育.如果无法自然繁育,则将冻融精子用于体外受精(IVF).如果冻融精子仍无法受精获得后代,则需要借助卵胞质内单精子注射技术(ICSI)进行胚胎构建,胚胎移植,直至获得后代.结果 单侧睾摘除的BDF1、C57BL/6J的公鼠可以继续繁育;不育的ICR和GFP小鼠的冻融精子IVF后,只有ICR小鼠可以得到正常的胚胎和子鼠;而以C57BL/6J 为遗传背景的GFP小鼠,其冻融精子只有采用ICSI技术,才可以得到子代.结论 精子冻融小鼠的遗传背景是影响IVF成功与否的关键性因素,同时还建立了一种以小鼠精子为主导的综合性保种体系,既可以达到品系保存的目的,同时又可以最大限度地利用小鼠品系.     

不同日龄和品系小鼠超排卵、体外受精及受孕率的比较研究

用PMSG和HCG分别对不同日龄(28日龄、56日龄和112日龄)的ICR,B6C3F1和C57BL/6J三个品系小鼠进行超排处理,并分别进行IVF(体外受精)及体外培养后将2-细胞期的胚胎移植至假孕受体的输卵管中,以此比较不同日龄和品系小鼠的超排、体外受精率和受孕率.结果显示,三个品系的28日龄小鼠的排卵数均高于56日龄和112日龄的排卵数(P<0.01),但品系和年龄并不影响卵母细胞在体外受精后形成2-细胞胚胎的受精率(平均约为91%的受精率),以及这些正常的胚胎在移植至受体后的受孕率(约51%左右).     

不同品系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究

目的　研究甘油作为冷冻保护剂、不同基因型小鼠对胚胎玻璃化冷冻的影响。方法　采用 6 5mol L的甘油作为冷冻保护剂 ,采用二步法对CBA、NOD、C57BL 6J、ICR及CD1小鼠 3 5d的胚胎进行玻璃化冷冻 ,并比较了不同品系小鼠胚胎的复苏率及移植受孕率。结果和结论　CBA、NOD、C57BL 6J,ICR及CD1的复苏率分别为 5 7 6 %、4 8%、31 3%、86 5 %及 88% ,移植受孕率为 2 1%、2 3 5 %、11%、38%和 35 5 % ,封闭群小鼠的胚胎复苏率、移植受孕率均显著高于近交系小鼠。这提示胚胎的复苏率及移植受孕率可能与小鼠的不同基因型有关。五个品系中 ,桑椹胚及早期囊胚的体外复苏率均显著高于扩张囊胚。这说明不同基因型及胚胎的不同发育阶段对胚胎玻璃化冷冻效果有影响     

三种不同冷冻保护剂对小鼠附睾冷冻效果的比较

目的 探讨三种不同冷冻保护剂对C57BL/6J小鼠附睾冷冻的效果。方法 性成熟并交配过的6-8周龄C57BL/6J雄鼠附睾，分别用3种不同冷冻保护剂二甲基亚砜 (DMSO)、丙二醇 (PROH)、R18S3进行玻璃化冷冻、复苏和精子采集，观察比较三个实验组的复苏精子形态、存活率以及生殖能力。结果 三组冷冻复苏分离后的精子形态完整，具有镰刀头状结构；荧光染色后PROH组精子存活率为 (88.17±3.43)%，明显高于DMSO组：(61.17±10.65)% 和R18S3组(16.83±6.49)%（P<0.05）；经辅助体外受精后均具有受精能力。获得的胚胎移植后可得到正常子代小鼠 (DMSO : PROH : R18S3 = 13 : 8 : 17）。结论 3种冷冻保护剂均适用于C57BL/6J小鼠附睾冷冻，但PROH冷冻效果较好。     

小鼠冷冻胚胎和精子SNP遗传鉴定方法的建立

【摘要】目的 建立小鼠冷冻胚胎和精子SNP(Single-Nucleotide Polymorphism)分型方法,用于冷冻胚胎和精子快速遗传鉴定方案。方法 本研究以中科院上海实验动物中心（国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心）提供的小鼠冷冻胚胎和精子为样本,采用全基因组扩增技术和PCR-LDR分型技术建立小鼠冷冻物SNP遗传鉴定方法。结果 全基因组扩增技术能大幅度增加冷冻胚胎样本的DNA总量;PCR-LDR分型方法适用于小鼠全基因组45个SNPs的分型;分型确定C57BL/6, BALB/c, FVB/NJ 等胚胎和精子各10种近交系,SNP位点信息与测序结果一致;小鼠冷冻胚胎个数与SNPs检出个数成正比,当胚胎数达到12以上时SNP检出率100%。结论 实现近交系小鼠冷冻胚胎和精子快速SNP基因分型,及遗传质量鉴定。     

不同小鼠品系囊胚受体对C57BL/6胚胎干细胞种系嵌合效率的影响

目的 为了考察不同品系的小鼠囊胚对C57BL/6胚胎干细胞种系嵌合效率的影响，进而提高通过在C57BL/6胚胎干细胞中同源重组制作基因打靶小鼠的效率。 方法 本研究除了选取近交系B6(Cg)-Tyrc-2J和BALB/c品系，还选了封闭群ICR作为囊胚供体鼠，通过在TLX3、Ai3K和SL三个不同基因修饰ES细胞的种系嵌合实验中，平行比较三者的囊胚利用率、嵌合鼠获得效率以及种系遗传效率等三个方面，并进一步针对囊胚来源这一因素对效率的影响进行统计学分析。 结果 本研究中三种ES细胞均未能通过B6(Cg)-Tyrc-2J品系囊胚的注射获得种系遗传。而BALB/c品系与ICR品系相比，囊胚利用率明显低于ICR品系（P< 0.05）；嵌合鼠获得效率方面，BALB/c与ICR相当（P= 0.115）；而种系遗传效率方面，BALB/c品系显著高于其他品系（P< 0.01）。 结论 BALB/c品系在C57BL/6胚胎干细胞种系嵌合效率方面确实具有优势，然而，由于BALB/c囊胚较难获得，并且存在发育延迟和透明带脆性高等问题，而ICR品系在囊胚获得和利用方面的效率明显高于BABL/c，并且也可以支持C57BL/6胚胎干细胞的种系遗传，因此也是C57BL/6胚胎干细胞囊胚注射中较好的选择。     

不同品系小鼠对实验感染念珠状链杆菌敏感性的观察

本文通过念珠状链杆菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｕｓｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，Ｓ．ｍ．）实验感染昆明、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＩＣＲ、ＮＩＨ、ＤＢＡ共６个品系小鼠，观察其对Ｓ．ｍ．敏感性的差异。其中昆明、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ两个品系在腹腔接种后表现出明显的临床、病理改变。昆明小鼠发病率和死亡率分别为９２％和８０％；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ分别是８０％和１２％。昆明小鼠较之Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠起病急、病情严重，多数动物死于感染的急性期。其余品系的发病率为：ＮＩＨ８％、ＢＡＬＢ／ｃ和ＤＢＡ４％，没有动物死亡；ＩＣＲ在接种后无任何临床病理改变。在实验感染后临床病理改变方面，昆明小鼠和Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠间有较大不同。昆明小鼠以末梢血管淤血、四肢尾部水肿、关节炎、截瘫、腹泻为主，而Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠则以注射部位和其它部位皮下脓肿、化脓性关节炎为主。本研究提示，中国昆明小鼠对Ｓ．ｍ．敏感性最高，可以将其作为“哨兵动物”用于实验大鼠Ｓ．ｍ．的常规监测；不同品系小鼠不仅对实验感染Ｓ．ｍ．的敏感性不同，而且表现出不同的临床病理改变。     

FVB小鼠精子冷冻及体外受精的研究

目的：探索FVB小鼠及FVB遗传工程小鼠种系保存的新途径.方法：用孕马血清和人绒毛膜促性腺激素（HCG）超排FVB小鼠,并分别用复苏精子和新鲜精子进行体外受精并将受精卵移植到假孕雌鼠输卵管中,比较两种精子的受精率;对注射HCG后13,15,17h不同时间采集FVB小鼠的卵母细胞进行体外受精,比较其受精率及体外培养至2细胞情况.结果：新鲜精子的受精率（62.4%）略高于冷冻复苏精子的受精率（58.1%）;在注射HCG 13～15 h后取FVB小鼠卵母细胞其受精率效果较好,受精率（60.2%、61.6%）显著高于17h取卵的受精率（51%）,但13,15,17 h采集卵母细胞体外受精后胚胎发育至2细胞及异常卵数无显著性差异.结论：本研究将为FVB小鼠及FVB遗传工程小鼠的种系保存、繁殖提供了基础.     

同品系小鼠卵巢移植方法的建立

目的 建立KM、ICR、C57BL/6J、BALB/C四个品系新鲜卵巢异体同位移植的方法.方法 上述四个品系出生10 d、20 d、4周的仔鼠作为供体,取出整个卵巢,将卵巢原位移植到同品系4周龄受体雌鼠,术后置于屏障系统内精心饲养,5~8周后,与同品系成年雄鼠交配,观察移植受体是否有正常的繁殖功能.结果 同品系不同时间段的新鲜卵巢,移植到同品系受体中,移植卵巢在受体体内可以恢复正常功能,受体可以正常交配,产生正常的仔鼠.结论 同品系不同日龄的异体同位卵巢移植方法可行.