弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆与原核表达

目的 克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）基因，构建原核表达载体，并表达该重组蛋白。方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入BamHI和XhoⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段，插入克隆载体pMD18-T，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，插入原核表达质粒pET28a，重组子双酶切、PCR和测序鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株cD-NA中扩增出693bp的HXGPRT基因片段；含pET28a／HXGPRT的宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物，Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别，获得纯化的重组蛋白。结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因，构建pET28a／HXGPRT重组质粒，并高效表达．为进一步研究提供了条件。     

烟曲霉硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的原核表达及抗原性分析

摘要：目的：克隆烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TR）基因并构建原核表达载体,获得烟曲霉TR重组蛋白,并鉴定其抗原性。 方法：用RT-PCR方法从烟曲霉总RNA中扩增出TR cDNA片段,克隆至pMD18-T载体,并转化E.coli JM109。经序列分析证实后,提取重组克隆质粒双酶切获得目的基因,与表达载体pET28a(+)连接,转化E.coli BL21（DE3）,筛选重组表达质粒。用异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导重组融合蛋白表达,用SDS-PAGE及免疫印迹法分析重组蛋白质,并用亲和层析柱进行纯化。 结果：构建了含TR全长基因的重组表达质粒,IPTG诱导后可高效表达。免疫印迹结果表明该重组蛋白质可被侵袭性曲霉病患者血清识别。 结论：成功构建了重组表达质粒pET28a(+)/TR,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,重组蛋白质具有良好的抗原性,为进一步研究奠定了基础。     

小鼠Foxp3融合蛋白的原核表达及纯化

目的克隆小鼠Foxp3(MFoxp3)基因,构建含该基因的原核表达载体,并表达、纯化出小鼠的Foxp3融合蛋白。方法RT-PCR方法从小鼠淋巴细胞扩增出小鼠Foxp3基因,连入T Easy Vector进行测序,然后将序列正确的小鼠Foxp3基因用酶切的方法从T Easy vector切下,并将其连接到用相同酶切,含有硫氧还蛋白(含6个组氨酸“标签”)的pET 32a( )原核表达载体中构建pET 32a( )-MFoxp3表达载体。用IPTG诱导转化pET 32a( )-MFoxp3表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化MFoxp3融合蛋白。结果经RT-PCR成功地克隆了1,290 bp的小鼠Foxp3基因,测序正确后转化大肠杆菌原核表达载体pET 32a( ),重组质粒在BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为63 kD的融合蛋白,运用Ni-NTA方法纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白纯度达80%,并用Western Blotting检测蛋白的灵敏度和特异性。结论构建了小鼠Foxp3的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出小鼠Foxp3的融合蛋白。     

沙眼衣原体外膜蛋白2重组蛋白的表达纯化和免疫性鉴定

目的表达沙眼衣原体外膜蛋白2,纯化表达产物,并对其免疫性进行鉴定。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术获得沙眼衣原体D型外膜蛋白2第167～434位氨基酸的编码基因片段,将此片段克隆于表达载体pET28b(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE、蛋白印迹试验分析表达产物,亲和层析法纯化重组蛋白;重组蛋白免疫家兔以检测其免疫原性。结果重组质粒酶切分析及DNA测序证实成功构建pET28b(+)/Omp2aa167～aa434表达质粒;通过优化表达和纯化条件,获得了相对分子质量约为35.0×103纯化蛋白产物,蛋白印迹试验证实该重组蛋白能与Ct感染者阳性血清反应;ELISA法测定免疫血清特异性抗体效价在1∶1280以上。结论表达的重组外膜蛋白2aa167～aa434具有良好的免疫性。     

人偏肺病毒F1、F2亚单位原核表达系统的构建及多克隆抗体制备

目的 构建人偏肺病毒融合蛋白亚单位F1、F2原核表达系统,初步获得抗F1、F2重组蛋白的多克隆抗体,为相关疫苗的研究奠定基础。 方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增F1、F2基因片段,经T-A克隆确保其准确性,双酶切后插入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),按优化后条件大量诱导表达,纯化后经Western Blot检测特异性。取纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA法检测效价,间接免疫荧光法(IFA)检测多克隆抗体是否能与人偏肺病毒发生特异性反应。 结果 F1、F2基因均正确插入pET32a(+)中,并具有正确的读码框架。0.5 mmol/L IPTG 37 ℃诱导培养5 h可获得大量带His标签的重组蛋白,纯化后浓度分别达到200 g/ml和300 g/ml。Western Blot结果显示,重组蛋白可被抗His标签抗体特异识别;免疫小鼠获得多克隆抗体效价分别为抗pET32a-F1最高1 : 640,抗pET32a-F2最高1 : 40 960。IFA显示抗pET32a-F1、抗pET32a-F2多克隆抗体均可与人偏肺病毒作用产生特异性荧光。 结论 成功构建了F1、F2的原核表达质粒, 并在大肠埃希菌中获得高效表达,该蛋白具有良好的抗原性;免疫小鼠获得特异性多克隆抗体,有利于人偏肺病毒的深入研究。     

UQCRB基因的原核表达和纯化

目的为研究UQCRB(ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)与中药的作用机制,本实验室进行了UQCRB基因的克隆、原核表达和纯化。方法提取人肝癌SMMC-7721细胞总RNA,反转录后采用特异引物进行PCR扩增获取UQCRB基因全长,产物纯化后连入T载体测定正确,克隆经NheI、XhoI双酶切后连入PET28a(+)载体,构建PET28a(+)-UQCRB原核表达质粒。在BL21(DE3)宿主菌中表达超声处理后,应用Amicon○R Pro Affinity Concentration Kit-Ni-NTA纯化,表达及纯化产物用westernblot验证。结果构建了PET28a(+)-UQCRB表达质粒,经过酶切鉴定和测序鉴定正确。重组UQCRB在BL21(DE3)中的最优表达条件为IPTG 1mM诱导5h。Westernblot证实了表达和纯化结果。结论重组UQCRB的原核表达和纯化成功,为进一步研究UQCRB的作用奠定了基础。     

肺表面活性物质相关蛋白C原核表达载体的构建、表达及纯化

背景:研究表明肺表面活性物质蛋白基因缺陷导致肺表面活性物质蛋白的结构发生变化。早期检测肺表面活性物质的含量对于预测肺部疾病的发生意义重大。目的:克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(surfactant associated protein C,SP-C)基因,构建原核表达载体PET-28a/SP-C,并纯化SP-C蛋白。方法:提取正常人肺组织总RNA,RT-PCR技术获得SP-C cDNA序列,纯化后的SP-C基因插入至中间载体PMD-18T,得到重组质粒PMD-18T-SP-C,重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的SP-C cDNA,将质粒PET-28a同样经过双酶切后纯化回收得到与SP-C cDNA具有相同黏性末端的质粒片段,将具有黏性末端的SP-C cDNA与PET-28a定向连接后得到重组质粒PET-28a/SP-C。然后将鉴定正确的PET-28a/SP-C重组质粒转入BL21中诱导表达。结果与结论:酶切鉴定及核苷酸序列测序证实扩增的SP-C cDNA及其重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,在5000～7500bp和250～1000bp处可检测到2条条带。核苷酸序列测序结果证实,质粒中插入基因长597bp,为一开放阅读框架,与GeneBank中公布的人SP-C cDNA序列相符。Western-blot检测结果显示,纯化后的SP-C蛋白在相对分子质量约27000处出现1条新生条带,与预期的大小一致。结果证实,实验成功克隆人SP-C基因并插入至质粒PET-28a中,构建了PET-28a/SP-C重组质粒,将其体外转化至BL21后可以表达SP-C蛋白。     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

日本血吸虫候选疫苗原肌球蛋白的表达载体构建、原核表达及免疫原性研究

目的 将日本血吸虫原肌球蛋白基因(tropomyosin)克隆到原核表达载体pET-28a(+)裁体上,在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中表达其产物,并对其进行免疫原性分析.方法 从日本血吸虫的Expressed Sequence Tag(EST)文库中筛选出包含tropomyosin全长基因的EST,然后用高保真酶PCR扩增,构建到pET-280(+)裁体上,最终在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IFTG)诱导表达.表达的his-tropomyosin融合蛋白用镍螯舍树脂蛋白纯化柱(Ni-NTA resin)亲和层析纯化,得到纯度较高的tropomyosin后,通过Western Blotting技术,用感染日本血吸虫的兔血清作为天然抗体来研究tropomyosi的免疫原性.结果 pET-28a(+)-tropomyosin重组质粒在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中成功表达,使用SDS-PAGE分析得到实际Mr约为40 000的his-tropomyosin融合蛋白,Ni-NTA resin的纯化效果很明显,获得的相对纯的目的 蛋白经过Western BIotting方法 检潮显示:tropomyosin融合蛋白能够与感染日本血吸虫6 w的兔血清有较强的免疫反应.结论 Tropomyosin能够在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中高效表达,且抗原免疫原性强,日本血吸虫感染的兔血清能够识别体外表达的tropomyosin,具有与天然的tropomyosin相同的免疫原性.     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。     

重组金属硫蛋白2A质粒的构建与表达

目的构建重组金属硫蛋白2A(MT-2A)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究MT-2A奠定基础。方法从人骨骼肌细胞cDNA文库中PCR扩增MT-2A基因DNA序列,构建重组表达质粒MT2A-pET32a,PCR与DNA测序法鉴定插入序列;重组细菌用IPTG诱导表达,His-bind亲和层析柱纯化MT-2A蛋白,Western blotting鉴定蛋白特性。结果扩增获得的MT-2A基因片段长186bp,DNA测序证实MT2A-pET32a重组质粒构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒MT2A-pET32a,在大肠埃希菌内诱导表达并纯化获得MT-2A。     

肠道病毒71型 VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的：对肠道病毒71型 VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据 GenBank 中 EV71序列设计一对特异性引物,以 EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板, RT-PCR 扩增 EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体 pET28a。构建 pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化 E．coli DH5α,IPTG诱导表达,使用 SDS-PAGE 及 Western blot 分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用 ELISA 分别检测 EV71阳性与 COX A16阳性患者 VP-1 IgG 抗体,进行统计学分析。结果目的基因经 BLAST 比对,同源性与 GenBank 登录号为 JQ766207．1 EV71 VP1一致性达99％。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×10^3,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有 N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA 结果显示EV71阳性患者 OD 值为（2．425±0．521）,COX A16阳性患者 OD 值为（1．205±0．314）,健康对照组 OD 值为（0．353±0．128）。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84％和88％。结论成功构建了 pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行 ELISA 初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于 EV71诊断及疫苗的相关研究。     

Galectin-7多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备鼠抗重组半乳糖凝集素7(Galectin-7)多克隆抗体及其在膀胱癌组织中特异性鉴定。方法 PCR法从人包皮组织中扩增Galectin-7基因,并构建到pET28a表达载体中,使用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过镍柱亲和层析纯化获得Galectin-7蛋白。以纯化的Galectin-7蛋白混合福氏完全佐剂免疫Balb/C小鼠制备抗体,并用ELISA,Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果 成功表达、纯化了Galectin-7重组蛋白,ELISA检测Galectin-7蛋白免疫的小鼠血清效价为1:32 000,Western blot显示该抗体能与天然的Galectin-7特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人膀胱肿瘤组织的天然Galectin-7。结论 通过制备重组Galectin-7蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗Galectin-7多克隆抗体。     

日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj26GST)疫苗的构建及鉴定

目的 构建日本血吸虫重组两歧双歧杆菌（pGEX-Sj26GST）疫苗,并对其进行鉴定.方法 采用RNeasy Mini试剂盒提取日本血吸虫成虫总RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得Sj26GST抗原编码基因;将该编码基因与pGEX-1λT载体进行连接,得到重组质粒pGEX-Sj26GST,并对其进行双酶切鉴定;将重组质粒电转化入两歧双歧杆菌中,构建重组两歧双歧杆菌（pGEX-Sj26GST）疫苗,PCR鉴定疫苗.结果 RT-PCR扩增出的日本血吸虫成虫Sj26GST基因片段长度为676 bp;双酶切证实Sj26GST抗原编码基因成功插入pGEX-1λT载体中;PCR证实从重组两歧双歧杆菌疫苗中扩增出长度为676 bp 的Sj26GST基因片段.结论 成功构建了日本血吸虫重组两歧双歧杆菌（pGEX-Sj26GST）疫苗.     

GⅡ型诺如病毒衣壳蛋白抗原表位预测及单克隆抗体的制备

目的原核表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,制备抗诺如病毒衣壳蛋白VP1的单克隆抗体,并研究其抗原表位特性。方法 PCR扩增GⅡ型湖州株诺如病毒VP1蛋白基因,将目的基因克隆至载体pET28a(+),转化至大肠埃希菌原核表达。纯化表达产物免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。用Modeller9.9为诺如病毒GⅡ型湖州株VP1蛋白构建三维模型,构建好的三维模型提交到SEPPA在线B-cell空间表位预测软件,对GⅡ型湖州株VP1蛋白进行空间表位预测。用预测的表位序列来筛选阳性克隆,得到对应这些表位的单克隆抗体。结果成功构建重组表达载体pET28a(+)-Noro-VP1并在大肠埃希菌中获得表达,重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用预测的抗原表位多肽筛选,获得10株杂交瘤细胞株。与重组蛋白的ELISA结果显示1E8、1P10、2C15和2L16四株反应性最强,其他几株反应性较弱。Western blotting结果显示只有2K10、1K16、1E8三株能与重组蛋白很好的结合。结论成功制备了抗GⅡ型湖州株诺如病毒VP1蛋白的单克隆抗体,抗原表位位于衣壳蛋白的P2区,为制备诺如病毒快速免疫诊断试剂盒及抗原表位的研究提供基础。     

MK—EGFP融合蛋白的构建和表达

目的克隆中期因子（midkine，MK）的编码序列，构建MK—EGFP融合表达质粒，诱导表达并亲合纯化。方法用RT—PCR技术从人胚胎组织中获得MK编码基因，构建原核表达质粒pET—MK-EGFP；转化大肠杆菌，诱导表达重组蛋白；纯化回收后鉴定生物活性。结果重组质粒经酶切测序与预期相符，融合蛋白表达后的指示荧光于激光共聚焦显微镜下清晰可见，MK在其中保持了原有的完整构象和生物活性。结论MK—EGFP重组质粒构建正确，融合蛋白大量表达，并具有完整的生物学活性。     

大鼠脑源性神经营养因子的克隆及原核重组表达载体的构建

目的:构建重组表达载体pGEX-脑源性神经营养因子(BDNF),探讨其原核表达BDNF的可行性。方法:大鼠BDNF进行密码子优化,人工合成BDNF的全基因序列,经回收、纯化、酶切后连接到pGEX原核表达载体中,将重组质粒pGEX-BDNF转化大肠杆菌BL21细胞中,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,利用ELISA方法鉴定其表达的活性。结果:PCR鉴定及测序显示BDNF序列完全正确,BDNF基因的克隆和表达载体构建成功,IPTG诱导表达目的蛋白经ELISA检测,其表达的目的蛋白具有一定的活性。结论:经密码子优化后经人工合成得到BDNF基因片段并成功构建pGEX-BDNF重组表达载体,具有一定的生物活性。     

人精子特异性乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达及其初步应用

目的 构建人精子特异性乳酸脱氢酶(hLDH-CA)的原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达,将重组hLDH-CA应用于抗精子抗体(ASA)的检测.方法 以人睾丸TripIEx cDNA文库为模板,PCR扩增hLDH-CA编码序列.PCR产物经Hind Ⅲ-Xho I酶切后,克隆至表达载体pET-28a(+)中,在E.coli BL21(DE3)中诱导His-Tag融合的重组蛋白表达.用免疫印迹、酶活性测定等方法鉴定表达产物.以纯化的重组hLDH-CA为基质,建立检测ASA的ELISA方法.结果 构建了hLDH-C4原核表达载体pET-28a(+).hLDHC.在IPTG的诱导下,重组菌可高效表达相对分子质量35 000的产物,与预期大小相符.免疫印迹显示,重组蛋白可被抗His-Tag单克隆抗体和兔抗人LDH-C4抗体识别.重组菌在IPTG诱导后,其裂菌液的乳酸脱氢酶活性是诱导前的11.2倍.用基于hLDH-C4抗原的间接ELISA法,在一组不育症患者中检测血清抗hLDH-CA抗体,阳性率达30.51%.结论 成功地克隆了hLDH-C4编码序列,并在E.coli BL21(DE3)中获得高效的表达,重组hLDH-C4在ASA检测中得到初步应用.     

骨肉瘤细胞热休克蛋白70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的从人的骨肉瘤细胞中钓取热休克蛋白70(HSP70)基因并在大肠杆菌中表达出热休克蛋白,为进行热休克蛋白的功能试验提供抗原。方法热休克人骨肉瘤细胞后,采用One-Step,RT-PCR方法从人骨肉瘤细胞中钓取HSP70基因,DNA测序正确的HSP70基因和表达载体pET28a连接后,构建成功了重组表达质粒pET28a-HSP70,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果人骨肉瘤细胞HSP70基因的PCR产物约为1.9 kb,DNA序列测定结果证实,所获目的序列与文献报道的基本一致,仅有两个碱基的差异。构建的重组表达质粒pET28a-HSP70,能够在大肠杆菌中表达。结论从人骨肉瘤细胞中成功地钓取了HSP70基因并在大肠杆菌中表达出HSP70蛋白,为研究人骨肉瘤细胞HSP70的结构、功能与临床应用奠定了基础。