铜绿假单胞菌临床感染的耐药性及毒力基因分析

目的了解铜绿假单胞菌在医院感染的临床分布、对抗菌药物的耐药性特点及多药耐药菌株毒力基因的携带与耐药性关系,为合理用药提供依据。方法对该院2016年1月至2017年12月临床分离的铜绿假单胞菌引起的感染分布及药敏结果进行回顾性分析。同时收集43株多药耐药铜绿假单胞菌,运用聚合酶联反应(PCR)法对毒力基因exoS和exoU进行检测,对携带exoS(-)/exoU(+)和exoS(+)/exoU(-)两组菌株的耐药率进行χ2检验。结果共分离出1 000株铜绿假单胞菌,以痰液标本为主,为72.6%;铜绿假单胞菌对阿米卡星敏感度最好,耐药率为9.6%,对头孢他定耐药率最高为42.2%。43株多药耐药菌株中以exoS(+)/exoU(-)基因型为主,有33株,占78.6%,exoS(-)/exoU(+)基因型有6株,占14.3%,exoS(-)/exoU(+)菌株对环丙沙星和左氧氟沙星等抗菌药耐药率均明显高于exoS(+)/exoU(-),耐药率差异有统计学意义(P0.05)。结论铜绿假单胞菌在医院表现出多药耐药,且以exoS为主,虽然携带exoU的菌株所占比例较低,但其耐药率高。     

铜绿假单胞菌毒力基因检测及临床意义

摘要：目的：检测淄博和青岛地区107例铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)临床分离株毒力基因存在情况。 方法：用ATB系统鉴定Pa;PCR法检测分离菌株exoU、exoS、pcrV、exoT以及exoY 5种毒力基因。 结果：exoU和exoS 2种基因在分离菌株中相互排斥;黏液型与非黏液型Pa菌株5种毒力基因的阳性率无显著性差异（P＞0.05）;淄博地区Pa毒力基因exoU阳性率高于青岛地区（P＜0.01）,exoS阳性率低于青岛地区（P＜0.05）。 结论：exoU和exoS 2种基因可能占据相同的染色体位点,两者不能共存;Pa黏液型与非黏液型的毒力基因携带情况相似;Pa毒力基因携带存在一定的地域性差别。     

阿奇霉素对铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统exoS和exoU基因表达的影响

目的通过研究铜绿假单胞菌临床株Ⅲ型分泌系统基因exoS、exoU的分布情况与耐药性的关系以及阿奇霉素对菌株exoS、exoU mRNA表达的影响,为临床在相应菌株中应用阿奇霉素提供理论依据。方法运用PCR检测50株临床分离的铜绿假单胞菌exoS、exoU基因分布情况,K-B法研究这些细菌对常用抗菌药物的耐药率,用逆转录PCR(RT-PCR)分析不同浓度阿奇霉素对铜绿假单胞菌exoS、exoU mRNA表达的作用。结果 50株临床分离的铜绿假单胞菌中36株(72.00%)为exoS阳性,14株(28.00%)为exoU阳性,无同时携带两种基因的菌株。exoU阳性株对10种抗菌药物的耐药率高于exoS阳性株,环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率差异有统计学意义(P0.05)。用不同浓度阿奇霉素处理铜绿假单胞菌exoS阳性株后,exoS mRNA相对表达水平高于空白对照水平,4μg/mL时最高,随着药物浓度的增加,exoS mRNA的相对表达水平逐渐下降至空白对照水平;不同浓度阿奇霉素处理exoU阳性株后,exoU mRNA相对表达水平较空白对照组明显减低。结论铜绿假单胞菌中毒力基因exoU的检出率低,exoU阳性株耐药性相对较强,低浓度阿奇霉素能促进铜绿假单胞菌毒力基因exoS mRNA的表达,而抑制exoU mRNA的表达。     

泛耐药铜绿假单胞菌的毒力基因检测和同源性分析

目的了解毒力基因在泛耐药铜绿假单胞菌中的分布情况,并分析其同源性。方法采用PCR方法检测毒力基因exoU和exoS,用BOX—PCR指纹图谱分析技术进行同源性分析。结果53株临床分离的泛耐药铜绿假单胞菌,其中40株毒力基因为exoS＋／exoU一型,10株为exoU＋／exoS-基因型,1株为exoS＋／exoU＋基因型,2株为exoS-／eexo U-基因型。BOX-PCR结果显示,41株exoS＋菌株分为24种基因型,11株exoU＋菌株分为7种基因型。结论临床分离的泛耐药铜绿假单胞菌,毒力基因的携带率高,BOXPCR指纹图谱分析技术适合铜绿假单胞菌的同源性分析,可为医院感染的控制与管理提供病原学基因分型资料。     

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌毒力基因检测及同源性分析

目的了解临床分离耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,CR-PA)毒力基因exoU与exoS携带情况、耐药特征及同源性。方法收集2016—2017年临床分离CR-PA 54株,PCR扩增exoU和exoS毒力基因,比较exoS~+exoU~-株和exoS~-exoU~+株间耐药率差异及其分离患者临床特征,随机扩增多态性DNA(RAPD)分析菌株间亲缘关系。结果 54株CR-PA中,exoS和exoU基因阳性株数分别为38株和13株,其中exoS~+exoU~-、exoS~-exoU~+、exoS~+exoU~+和exoS~-exoU~-型分别为37株、12株、1株和4株。exoS~-exoU~+株对庆大霉素和环丙沙星耐药率高于exoS~+exoU~-株(χ~2=7.734,P0.05;χ~2=4.274,P0.05)。30株CR-PA可聚类,exoS~+exoU~-型株居多(32.4%),集中分布于ICU和神经内科。结论本院exoS~+exoU~-型CR-PA临床分离率高。与exoS~+exoU~-型相比,exoS~-exoU~+型CR-PA对庆大霉素和环丙沙星的耐药率较高。     

铜绿假单胞菌碳青霉烯耐药的机制研究

目的分析159株临床分离的非重复碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药性,探究体外联合药敏试验对碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌表现不同作用的机制。方法收集来自不同患者的铜绿假单胞菌159株,亚胺培南及美罗培南耐药。采用三维水解试验检测β-内酰胺酶、聚合酶链式反应(PCR)等方法检测多重耐药菌可能存在的耐药机制。结果 159株临床分离的非重复碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌,通过三维实验检测,其中15株产MBL、13株产AmpC酶。体外联合药物敏感试验,加入MC-207,110后约38%的菌株对碳青霉烯类抗生素的MIC下降4个梯度。检测试验菌株,21株携带IMP基因,18株携带ampC基因;检测OprD2通道蛋白,159株中约有48%的菌株OprD2丢失。结论北京友谊医院碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因不是IMP、AmpC水解酶;碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因可能是外排泵及外膜孔道蛋白。     

基于组学数据表达谱的下呼吸道铜绿假单胞菌毒力基因exoS和exoU的共表达网络分析

目的以铜绿假单胞菌的基因芯片为研究样本,并对其进行组学数据层面的挖掘,旨在从分子生物学的层面阐明下呼吸道铜绿假单胞菌毒力基因exoS和exoU的共表达网络特征,并发现其关键的调控基因。方法于2016年3月至2018年5月采用定群抽样的方法选取内蒙古包钢医院呼吸内科接诊并在该院接受后续治疗的312例下呼吸道铜绿假单胞菌感染者为受试对象,生物标本为患者的肺泡灌洗液及痰液。使用寡聚核苷酸探针对铜绿假单胞菌的基因进行检测,对芯片数据进行预处理。选择头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、阿米卡星、环丙沙星、左旋氧氟沙星、多尼培南、替卡西林共8种呼吸内科针对革兰阴性菌常用的抗菌药物对生物标本进行耐药性测定,利用MCODE算法构建以exoS/exoU为核心的耐药基因共表达网络模型。结果耐药组exoS/exoU表达量均显著高于非耐药组,差异有统计学意义(P0.05);耐药组肺泡灌洗液标本前5位差异表达基因差异表达量从高到低排序依次为RAC1、ITGB1、ITGB5、CRK及IGF1R。痰标本顺序为RAC1、CRK、IGF1R、ITGB1及ITGB5。肺泡灌洗液标本中仅RAC1与exoS、exoU表达呈正相关性(P0.05);痰标本中RAC1、ITGB1、ITGB5、CRK及IGF1R与exoS、exoU表达呈正相关性(P0.05)。共表达网络中纳入的基因包括exoS、exoU、RAC1、ITGB1、ITGB5、CRK、CAMK2D、RHOA、FLNA、IGF1R、TGFBR2、FOS。其中RAC1基因调控能力评分最高(72.00),调控基因数最多(6个);其后依次为ITGB1、ITGB5及CRK基因。结论痰标本出现exoS和exoU高表达提示铜绿假单胞菌有更高概率产生耐药性;RAC1、ITGB1、ITGB5及CRK基因可能是调控exoS和exoU表达的关键基因。     

多重耐药的铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子与其多重耐药基因的相关性分析

目的 调查本院多重耐药铜绿假单胞菌耐药基因的存在状况,Ⅰ类整合子的分布情况以及其与多重耐药基因相关性分析.方法 采用K-B法测定临床分离的铜绿假单胞菌对15种药物的耐药性,筛选出35株多重耐药菌株,采用聚合酶链反应(PCR)检测β-内酰胺酶编码基因、OPrD2基因、氨基糖苷类修饰基因和Ⅰ类整合子基因.结果 35株多重耐药铜绿假单胞菌中β-内酰胺酶编码基因CTX-M-1、TEM、SHV的检出率分别为51.4%、31.4%、14.0%;OPrD2基因的阳性率为28.6%;氨基糖苷类修饰基因aac(6′)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ和ant(3″)-Ⅱ的阳性率分别为20%、2.86%、14.3%和17.1%;Ⅰ类整合子阳性的菌株中,CTX-M-1、TEM、SHV、aac(6′)-Ⅱ和ant(3″)-Ⅰ的检出率为45.4%、9.1%、27.3%、36.4%和27.3%,未检出aac(6″)-Ⅰ和ant(2″)-Ⅰ基因.结论 本院多重耐药铜绿假单胞菌存在多种耐药基因,常见的有β-内酰胺酶编码基因、OPrD2基因和氨基糖苷类基因.Ⅰ类整合子广泛存在于多重耐药的铜绿假单胞菌中,并携带多种耐药基因参与形成铜绿假单胞菌的多重耐药.     

黏液型铜绿假单胞菌的毒力基因、产金属酶检测与耐药性研究

目的比较两种表型铜绿假单胞菌(PAE)毒力基因、产金属酶(MBLs)及耐药性,为临床治疗和医院感染控制提供依据。方法采用ATB鉴定系统进行菌株鉴定,筛选出两种表型菌株;纸片扩散法检测耐药性;PCR方法检测毒力基因exoS、exoU和exoY;改良Hodge试验(PAE-MHT)法检测MBLs。结果非黏液型PAE对各种抗生素的耐药率均高于黏液型,其中对庆大霉素、氨曲南、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南的耐药率明显高于黏液型;同时非黏液型MBLs阳性率明显高于黏液型;3种毒力基因阳性率黏液型均高于非黏液型,但两者比较无显著性差异;6种基因型中,除exoU+/exoS-/exoY-和exoU-/exoS-/exoY-两种基因型非黏液型明显高于黏液型外,其余四种基因型的比较无显著性差异。结论针对PAE感染,应尽早尽快选择敏感药物治疗,以免非黏液型转化成黏液型后,增加治疗难度。     

多重耐药铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因的检测及分析

目的 探讨多重耐药铜绿假单胞菌的氨基糖苷类药物的耐药机制.方法 分离出50株多重耐药铜绿假单胞菌,PCR法检测4种氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因,即aac(6′)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ的表达情况.并用MLVA基因分型的方法对菌株进行聚类分析.结果 50株铜绿假单胞菌中,4种AMEs基因的总检出率为70%.aac(6′)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ的检出率分别为60%、40%、24%、32%.MLVA基因分析聚类结果显示,没有多重耐药铜绿假单胞菌的暴发流行.结论 多重耐药铜绿假单胞菌的AMEs基因携带率较高,没有发现其爆发流行.     

DNA microarray for genotyping multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates

The management of infections with multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa needs fast and reliable methods of antibiotic susceptibility testing for a therapy improvement. For this purpose, we developed a DNA microarray for genotyping antibiotic resistance and a few virulence factors. The array covers mutations in the efflux regulators mexR, nfxB, mexT, gyrase gyrA, and parC, as well as plasmid-encoded vim, imp, oxa, aph, aac, and aad genes, and virulence-associated mucA and exoU, exoT, and exoS genes, respectively. The whole procedure can be performed in less than 5 h and consists of DNA isolation, target gene amplification, fluorescence labeling, fragmentation, and array hybridization. Concerning the genotype-phenotype comparison in the test collection, the coverage of relevant resistance determinants for antibiotics used in a calculated therapy of critical ill patients was 87.8%.     

191株铜绿假单胞菌对10种药物的体外抗菌活性分析

目的分析我院铜绿假单胞菌的耐药持点．指导临床用药。方法收集2004年7月～2005年6月自我院分离的191株铜绿假单胞菌，采用纸片扩散法进行药物敏感试验，数据分析采用WHONET5．3软件。结果191株铜绿假单胞菌分离株中，耐药率〈30％的抗菌药物仃哌拉西林／三唑巴坦、亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟和阿米卡星，其中对亚胺培南耐药率达到22．5％，ICU分离菌对哌拉西林、哌拉西林／三唑巴坦。亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟和阿米卡星的耐药率高于非ICU21．7％～42．6％（P〈0．05）。结论 了解铜绿假单胞菌的耐药现状，有利于为临床合理用药提供依据。     

虎杖对3种耐药细菌的抗菌效果分析

目的观察中药虎杖不同含量熬制成中药汤对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、多重耐药铜绿假单胞菌及产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的抗菌效果,并进行分析。方法收集攀枝花市十九冶医院住院患者分离的45株MRSA,其中非meca基因介导的25株、meca基因介导的20株,20株多重耐药铜绿假单胞菌,65株产ESBLs大肠埃希菌分别配成0.5个麦氏点的菌悬液,分别用20、30、40、50、60、70g虎杖熬成不同含量的中药汤,采用琼脂稀释法制备平板,在制备的平板上用打孔的方法接种细菌。结果 25株非meca基因介导的MRSA和20株多重耐药的铜绿假单胞菌在30g含量以下虎杖中药汤制备的平板中均生长、40g及40g以上含量虎杖中药汤制备的平板中均不生长;20株meca基因介导的MRSA在50g含量以下虎杖中药汤制备的平板中均生长、50g及50g以上含量虎杖中药汤制备的平板中不生长;65株产ESBLs大肠埃希菌在所有含量虎杖中药汤制备的平板中均生长。结论 40g及40g以上含量的虎杖中药汤可以抑制非meca基因介导的MRSA和多重耐药的铜绿假单胞菌的生长,具有抗菌效果;50g及50g以上含量虎杖中药汤可以抑制meca基因介导的MRSA的生长,具有抗菌效果;所有含量的虎杖中药汤均不能抑制产ESBLs大肠埃希菌,对产ESBLs大肠埃希菌不具有抗菌效果。     

Complementation of the exoS gene in the pvdE pyoverdine synthesis gene-deficient mutant of Pseudomonas aeruginosa results in recovery of the pvdE gene-mediated penetration through the intestinal epithelial cell barrier but not the pvdE-mediated virulence in silkworms

Translocation of endogenous Pseudomonas aeruginosa from the colonized intestinal tract is an important pathogenic phenomenon. Comparative genome hybridization analysis of high virulent and low virulent strains allowed us to identify bacterial genes that are associated with bacterial translocation from gut in infected hosts. Here we focused on the pvdE pyoverdine synthesis gene among the identified bacterial genes, showing that the pvdE gene is required for bacterial penetration through epithelial cell monolayers and for bacterial translocation from gut to hemolymph in infected silkworms. We next revealed that mRNA expression level of the exoS gene in a pvdE-deficient mutant (ΔpvdE) after incubation with Caco-2 cells was greatly reduced as compared with that in the wild-type strain. The pvdE- and exoS-complemented ΔpvdE strains (ΔpvdE/pvdE and ΔpvdE/exoS) showed recovery of the ability of bacterial penetration through Caco-2 cell monolayers and of the ability of bacterial translocation from gut to hemolymph in infected silkworms. However, there were differences between the ability of ΔpvdE/pvdE and ΔpvdE/exoS to kill silkworms after intestinal infection and to replicate in hemolymph following direct injection into the hemolymph: ΔpvdE/pvdE could kill silkworms after intestinal infection and could replicate in hemolymph to levels similar to those of the wild-type strain, but ΔpvdE/exoS could not. Taken together, our results suggest that the virulence of the wild-strain mediated by the pvdE gene is the result of the ability to both penetrate through the intestinal epithelial cell barrier depending on ExoS and to replicate in hemolymph independently of ExoS.     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌医院感染现状及耐药性分析

目的 探讨耐亚胺培南铜绿假单胞菌（imipenem resistant Pseudomonas aerugirtM，IRPA）医院感染现状及其对临床常用抗苗药物的耐药情况．以指导临床更有效地使用抗生索。方法 按常规方法对163株铜绿假单胞苗进行分离培养。VITEK-Ⅱ全自动细菌鉴定仪进行鉴定，按2005年NCCLS的标准用纸片扩散（K-B）法对临床常用的抗苗药物进行药物敏感性试验。采用whonet5．3及SPSS11．0软件对数据进行统计处理。结果 共分离出IRPA60株，占36．8％（60／163）；主要来源于痰标本占66．7％（40／60），IR-PA在病区的分布中居前3位依次为ICU、呼吸内科和神经内科，IRPA对12种常用抗生索的耐药率除阿米卡星35．0％．庆大霉素45．0％外。对头孢吡肟、哌拉西林等10种抗苗药的耐药率均高于50．0％；除环丙沙星、庆大霉素．IRPA组的耐药率明显高于亚胺培南敏感铜绿假单胞苗（imipenem susceptible Pseu-domonasaeruginosa，ISPA）组，差异有显著性（P〈0．05）。结论 IRPA对大多数临床常用抗生索呈现出多重耐药．且IRPA比ISPA具有更强的耐药性。     

国内铜绿假单胞茵对喹诺酮类药物耐药机制的Meta分析

目的 系统评价我国铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的相关耐药机制。 方法 计算机检索CNKI、WanFang Data、CBM、VIP、PubMed、EMbase和The Cochrane Library数据库,检索时限均从建库至2012年12月,查找来自中国的有关铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药机制研究的相关文献。按照纳入与排除标准筛选文献后,采用RevMan 5.0软件进行Meta分析。 结果 共纳入19篇文献,合计723株耐喹诺酮类铜绿假单胞菌。统计分析结果显示：gyrA、gyrB、parC和parE基因检出率在淮河以北地区分别为88.0%、13.3%、31.4%和16.7%;在淮河以南地区分别为64.6%、50.0%、35.4%和11.5%。质粒介导的耐药基因aac（6’）-Ib-cr淮河以北地区检出率为0（0/66）,淮河以南地区检出率则为39%（25/64）,主动泵出系统表达率为68.1%。 结论 在我国,铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的机制以gyrA基因突变为主,其主动泵出系统是重要的耐药机制,而DNA拓扑异构酶Ⅳ的异常及质粒介导的耐药是次要机制。     

烟台地区产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的耐药性分析及基因型检测

目的研究烟台地区产金属伊内酰胺酶铜绿假单胞菌的耐药性,基因型及菌株的同源性,为监控产酶菌株的流行及指导临床合理选择抗生素提供依据。方法EDTA纸片复合法和E—test法分别筛选产金属β-内酰胺酶菌株,PCR扩增耐药基因imp、vim、spm和gim,用MIC法测定产金属G内酰胺酶菌株对8种常用抗菌药物的敏感度,用肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应（ERICPCR方法）确定菌株之间的同源性。结果42株耐亚胺培南和头胞他啶铜绿假单胞菌EDTA纸片复合法筛选出18株金属酶菌株、E—test法15株、PCR法12株;PCR法检测到imp阳性菌株4株,vim阳性菌株8株;产金属β-内酰胺酶菌株呈多重耐药,且PCR法阳性产金属酶菌株呈现为高水平耐药;ERIC—PCR结果显示,18株产金属伊内酰胺酶菌株呈现7种基因模型,其中10株为同一基因模型。结论经济简便快捷的EDTA纸片复合法可作为首选方法来对产金属酶铜绿假单胞菌进行筛选,烟台地区临床分离的铜绿假单胞菌所产金属β-内酰胺酶基因型以vim型为主,阿米卡星、环丙沙星具有较好的抗菌活性,某医院在一定时期曾出现爆发流行。