人类血小板抗原基因分型

本文介绍了5个对人类影响最大且已被国际上公认的血小板抗原系统的分子生物学研究结果及其分型方法,包括最早采用的血清学方法、近几年发展起来的分子生物学方法:DNA序列分析、等位基因特异性寡核苷酸点杂交(PCR-ASO)、聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)及聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)。其中重点介绍了PCR-SSP方法的可靠性及实用性。     

人类血小板抗原全套基因分型方法的建立与应用

目的 建立一种基于DNA扩增和测序分型(PCR sequencing-based typing,PCR-SBT)的人类血小板抗原HPA-1～HPA-16w的基因分型方法.方法 从免疫多态性数据库中下载HPA-1～HPA-16w的全套HPA核酸序列,以Primer Premier 5.0软件设计引物,特异性扩增包含HPA-1a/lb到HPA-16aw/16bw多态性的核酸片段.通过调整引物序列和PCR条件获得单一的特异性扩增产物.PCR产物纯化后直接进行DNA序列分析并确定HPA基因型.通过对2份标准样本的HPA分型验证PCR-SBT方法的准确性;并利用PCR-SBT法对2008年度国际输血协会(ISBT)第14届国际血小板免疫学工作组提供的16份比对样本(包括6个含有基因突变的干扰样本)进行HPA基因分型.结果 设计11对引物扩增和测序16个HPA系统.2份标准样本的HPA基因型分别为HPA:1aa/2aa/3ab/4aa/5ab/6aa/7aa/8aa/9aa/10aa/11aa/12aa/13aa/14aa/15aa/16aa和HPA:1aa/2aa/3aa/4aa/5aa/6aa/7aa/8aa/9aa/10aa/11aa/12aa/13aa/14aa/15as/16an.16份ISBT考核样本的256个HPA基因型结果清晰,其中HPA-1～HPA-6w、HPA-9w和HPA-15共8个系统的128个基因型结果与ISBT参考结果完全一致.结论 建立了HPA-1～HPA-16w的PCR-SBT分型方法,结合高通量的DNA序列分析仪,具有简单、快速和准确的优点,适合于临床HPA全套基因分型,具有良好的应用前景.     

人类血小板抗原基因分型

本文介绍了５个对人类影响最大且已被国际上公认的血小板抗原系统的分子生物学研究结果及其分型方法，包括最早采用的血清学方法，近几年发展起来的分子生物学方法：ＤＮＡ序列分析、等位基因特异性寡核苷酸点杂交（ＰＣＲ－ＡＳＯ）、聚合酶链反应－限制性片断长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）及聚合酶链反应－序列特异性引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ），其中重点介绍了ＰＣＲ－ＳＳＰ方法的可靠性及实用性。     

人类血小板抗原1～4系统基因分型

目的 :建立人类血小板抗原 1～ 4系统序列特异性引物 (PCR SSP)分型方法。方法 :合成 14条引物 ,采用PCR SSP方法对 2 5名健康献血者的HPA 1～ 4系统进行基因分型 ;分型结果与采用等位基因特异性寡核苷酸点杂交 (PCR ASO)获得的结果进行比较。结果 :以PCR SSP方法对HPA 4个系统进行分型均取得了明确、满意的结果 ,且与PCR ASO方法获得的结果完全一致。结论 :人类血小板抗原PCR SSP基因分型方法具有简便、快速、准确等优点 ,具有广泛的应用前景。     

多重聚合酶链反应-微流芯片检测人血小板抗原系统基因型方法的建立与应用

目的建立人血小板抗原（HPA）-2、4、5系统基因型的检测方法。方法用多重聚合酶链反应和微流芯片检测方法，通过设计9条特异性引物、优化反应体系和反应条件，在一个体系中同时扩增HPA-2、4、5系统特异性的目的基因片段，利用微流芯片快速检测HPA-2、4、5系统基因型；并把分型结果与采用聚合酶链反应．序列特异性引物（PCR-SSP）获得的结果进行比较。结果对35名健康单采血小板者进行HPA-2、4、5系统分型的结果为：33名为2a／2a型，2名为2a／2b型；34名为4a／4a型，1名为4a／4b型；29名为5a／5a型，6名为5a／5b型。未发现2b／2b、4b／4b及5b／5b纯合子个体。该结果与PCR．SSP方法获得的结果完全一致。结论该方法可快速、准确地用于血小板血型抗原基因分型，尤其适合于大样本检测。     

大连地区精神分裂症患者人类白细胞抗原-DRB1等位基因的分布及其关联性

目的：研究大连地区精神分裂症患者的人类白细胞抗原-DRB1基因的分布，以期发现精神分裂症与人类白细胞抗原-DRB1基因的关联。方法：实验于2001-10／2003-01在大连医科大学附属一院检验科完成。应用微量聚合酶链反应-序列特异性引物技术对54例精神分裂症患者(患者组)和40例健康人(对照组)的人类白细胞抗原-DRB1基因进行了分布检测，同时应用免疫荧光技术和酶联免疫吸附测定抗核抗体和白细胞介素-2。结果：患者组54例及对照组40例均参与结果分析。①患者组的人类白细胞抗原-DRB1*01基因的频率为29．6％，明显高于对照组7．5％，(RR=5．2)。其他等位基因频率在患者组与对照组之间差异无显著意义。②患者组抗核抗体阳性率为35．2％(19／54)，明显高于对照组2．5％（1／40)，(P&;lt;0．01)。③患者组血清的白细胞介素-2水平[(3．9&;#177;1．1)ng／L]，明显低于对照组[(5．6&;#177;1．4)ng／L，P&;lt;0．05]。结论：人类白细胞抗原-DRB1*01基因与大连地区精神分裂症患者的发病有关联，可能是精神分裂症的易感基凶。患者组的抗核抗体阳性率增高，白细胞介素-2水平下降，所伴有免疫异常与其发病可能有内在的联系。     

徐州地区汉族人群血小板HPA1～17等位基因的研究

目的调查徐州地区汉族人群血小板特异性抗原(HPA)基因多态性及特点,为人类遗传学提供资料,为本地区临床血小板免疫性减少症患者提供血小板输注配型参考。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)对徐州地区100名无血缘关系的汉族成年人进行HPA1～17等位基因分型。在包含引物混合液的96孔反应板中,按照相同的循环条件扩增PCR产物。结果在徐州地区汉族人群的HPA1～17系统中,呈多态性分布的等位基因是HPA1a、HPA2a、HPA3a、HPA4a、HPA5a、HPA6a、HPA15a,其频率分别为0.995 0、0.935 0、0.590 0、0.9950、0.980 0、0.975 0、0.575 0,HPA7～14、16～17呈单线性分布。结论徐州地区汉族人群HPA的基因有地区特点,人类血小板抗原HPA的基因具有民族多态性。     

大连地区精神分裂症患者人类白细胞抗原-DRB1等位基因的分布及其关联性

目的:研究大连地区精神分裂症患者的人类白细胞抗原-DRB1基因的分布,以期发现精神分裂症与人类白细胞抗原-DRB1基因的关联。方法:实验于2001-10/2003-01在大连医科大学附属一院检验科完成。应用微量聚合酶链反应-序列特异性引物技术对54例精神分裂症患者(患者组)和40例健康人(对照组)的人类白细胞抗原-DRB1基因进行了分布检测,同时应用免疫荧光技术和酶联免疫吸附测定抗核抗体和白细胞介素-2。结果:患者组54例及对照组40例均参与结果分析。①患者组的人类白细胞抗原-DRB101基因的频率为29.6%,明显高于对照组7.5%,(RR=5.2)。其他等位基因频率在患者组与对照组之间差异无显著意义。②患者组抗核抗体阳性率为35.2%(19/54),明显高于对照组2.5%(1/40),(P<0.01)。③患者组血清的白细胞介素-2水平[(3.9±1.1)ng/L],明显低于对照组[(5.6±1.4)ng/L,P<0.05]。结论:人类白细胞抗原-DRB101基因与大连地区精神分裂症患者的发病有关联,可能是精神分裂症的易感基因。患者组的抗核抗体阳性率增高,白细胞介素-2水平下降,所伴有免疫异常与其发病可能有内在的联系。     

应用PCR-SSP方法进行人类血小板抗原1～6系统的基因分型

目的研究采用PCR-SSP技术,建立人类血小板抗原1～6系统(HPA-1,2,3,4,5,6)的基因分型方法.方法合成18条序列特异性引物,通过调节引物浓度、Mg2+离子浓度和探索最佳PCR扩增条件,建立HPA-1～6系统同步基因分型技术.对第10届及第11届国际输血协会(ISBT)血小板基因定型协作组送检的考核样本进行盲检来验证.并应用该技术对198名深圳地区健康的血小板志愿捐献者进行基因分型.结果应用本研究的方法,对第10届及第11届ISBT送检的考核样本进行基因分型,结果与ISBT公布的结果完全一致,符合率达100%.对198名随机的血小板志愿捐献者观察到的基因频率分别是:HPA-1a和1b为0.9924和0.0076,HPA-2a和2b为0.9545和0.0455,HPA-3a和3b为0.5556和0.4444,HPA-4a和4b为0.9975和0.0025,HPA-5a和5b为0.9848和0.0152,HPA-6a和6b为0.9798和0.0202.结论本研究建立的HPA基因分型技术具有简便、快速、准确的特点,适合于常规HPA基因分型,具有广泛的应用前景.     

血小板特异性抗原HPA-17bw基因分型及基因频率调查

目的对HPA-17bw基因分型并调查其在部分汉族人群中的分布。方法采用PCR-SSP方法对无亲缘关系的健康无偿献血者HPA-17bw进行基因分型,采用基因计数法进行基因频率、基因型频率的计算。结果259名正常人的HPA-17bw基因频率为0.000;HPA-17bw/bw的基因型频率为0.000。结论HPA-17bw为低频抗原,259份汉族样本中尚检测不出HPA-17bw。     

多重聚合酶链反应用于人血小板抗原-2、-4、-5系统基因分型的研究

目的建立用于检测人血小板抗原(HPA)-2、-4、-5系统基因型的多重聚合酶链反应(PCR)。方法在一个反应体系中同时扩增HPA-2、-4、-5系统特异性目的基因片段。用琼脂糖凝胶电泳确定HPA-2、-4、-5系统基因型;再用多重PCR对75名健康的单采血小板者进行HPA-2、-4-、5系统基因分型,分型结果与PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)获得的结果进行比较。结果HPA-2、-4、-5系统分型的结果为:70名为2 a/2 a型,5名为2 a/2b型;73名为4 a/4 a型,2名为4 a/4b型;66名为5 a/5 a型,9名为5 a/5b型。未发现2b/2b、4b/4b及5b/5b纯合子个体。多重PCR结果与PCR-SSP方法获得的结果一致。结论多重PCR具有操作简便、快速、准确等特点,可以用于血小板血型抗原基因分型。     

Human platelet antigen allele frequencies and new mutations on platelet glycoprotein genes in the Chinese Han population

Background and Objectives: The frequencies of human platelet antigens (HPAs) vary between different populations. In this study, we determined the HPA allele frequencies in the Chinese Han population and identified situation of incompatibility possibly leading to alloimmunisation. Methods: A total of 750 volunteer blood donors of the Chinese Han population were genotyped for HPA‐1 to ‐17w systems. HPA genotyping was determined by polymerase chain reaction sequence‐based typing. Results: Among the 17 HPA systems, the allele frequency is different from other populations. We noted the absence of HPA‐7bw to HPA‐14bw, HPA‐16bw and HPA‐17bw alleles in the population. The estimated incompatibility probabilities regarding platelet antigens 1 to 6w and 15 systems after transfusion of random donor platelet were from 0·004 to 0·373. Thirteen glycoprotein alleles were observed in the population. In addition, we identified 16 novel mutations on the glycoprotein genes separated from HPA polymorphisms, including GP1BA (517‐525delAAC), ITGA2B (2722C>T and IVS26+85T>C), ITGA2 (1521C>T, 2474T>G and IVS20+10 G>C), ITGB3 (1476G>A, IVS10+19C>A, 1813G>A, IVS11+21G>A, IVS11+152A>G and IVS11‐104T>C), GP1BB (IVS1‐79G>A, IVS1‐27C>T and 129G>A) and CD109 (2139A>G). Five of them could lead to amino acid deletion, substitution or premature stop codon in corresponding glycoprotein. Conclusions: There was a high degree of polymorphism of the membrane glycoprotein genes related to human platelet alloantigen‐1 to ‐17w systems in the Chinese Han population. These data could have some impact on the diagnosis, prevention and treatment of alloimmune thrombocytopenia.     

盐城地区汉族人血小板抗原HPA-1～17，Caba基因多态性分析

目的：研究盐城地区汉族人群血小板特异性抗原人类血小板同种抗原1～17（HPA1～17）,Caba的基因分布,建立本地区固定机采血小板供者 HPA数据库。方法应用序列特异性引物聚合酶链式反应（PCR‐SSP）技术,对盐城市中心血站200名汉族固定血小板献血者的血液进行HPA1～17,Caba基因分型。用χ2检验统计分析各 HPA血型系统基因分布的期望值与观察值,验证其是否符合 Hardy‐Weinberg平衡定律,并与国内外人群相比较。结果盐城地区200名汉族血小板献血者的HPA‐1a、2a、3a、4a、5a、6a、15a的基因频率分别为0．9950、0．9375、0．5725、0．9925、0．9850、0．9875、0．5425,呈多态性分布,HPA7～14、16～17及Caba呈单线性分布;不配合率大于10％的HPA系统有HPA‐2～3、15。结论本研究已确认盐城地区200名固定血小板供者 HPA基因分布特征,与国内其他地区、其他国家相比有本地区人群特点;在此基础上建立本地区已知 H PA基因型固定机采血小板供者数据库,为临床血小板HPA血型配合性输注提供可能。     

基于PCR反向斑点杂交技术的32型生殖道人乳头瘤病毒基因分型方法的建立

目的建立基于PCR反向斑点杂交技术(PCR-RDB)的32型生殖道人乳头瘤病毒(HPV)基因分型方法。方法设计并合成基于MY09/11的HPV型特异性引物和探针;以HPV载体和临床样本为模板,用自建的PCR-RDB法对300例临床宫颈脱落细胞进行HPV分型检测,并与商品化的PCR-RDB法检测结果进行比较。结果自建的PCR-RDB法的特异性、准确性和重复性良好,其对39和51型HPV的最低检测限为50拷贝/反应,其余各型别HPV最低检测限为5拷贝/反应。用自建的PCR-RDB法对300例临床样本进行HPV分型的总阳性率、单一感染率和多重感染率分别为18.67%(56/300)、12.33%(37/300)、6.33%(19/300),与商品化试剂的检测结果均无统计学意义(χ2分别为0.744,0.597和0.118,P均0.05)。两法一致性检验的Kappa值为0.889(P0.01)。结论成功建立了灵敏度、特异性高,重复性良好,适合临床上对32型HPV分型的PCR-RDB法。     

Development of a quadriplex polymerase chain reaction for human cytomegalovirus detection

The development of a quadriplex PCR method with amplification of HCMV in a single‐step procedure using primers taken from four different regions of the viral genome is described. Different concentrations of dNTPs and MgCl₂ were assayed in order to optimize the constitution of the buffer for the multiplex PCR. The specificity of the PCR was tested with 100ng, 10ng, and 1ng of genomic MRC‐5 cell DNA infected with CMV in the presence of 10μg of uninfected MRC‐5 cell DNA. The sensitivity of the PCR was evaluated by the amplification of various amounts (100ng, 10ng, 1ng, and 0.1ng) of genomic MRC‐5 cell DNA infected with CMV. The specificity and sensitivity assays were performed for each pair of primers and for the combined four primer pairs in the multiplex PCR. CMV was consistently detected from 10ng of genomic MRC‐5 cell DNA with each primer pair. When all four sets of primers were combined in a single reaction tube, the sensitivity of the assay was equivalent to 10ng of genomic MRC‐5 cell DNA, whereas amplification from 1ng genomic MRC‐5 cell DNA produced only a subset of the amplimers. By amplifying four target‐sequences of HCMV simultaneously with minimum incubation time at each temperature, a quadriplex, highly sensitive PCR assay was performed. The use of four primer sets designed in different genomic regions of HCMV allowed the detection of variants and achieved maximal sensitivity and specificity which are essential for a diagnostic utilization. J. Clin. Lab. Anal. 13:99–105, 1999. © 1999 Wiley‐Liss, Inc.     

布鲁菌PCR快速检测方法的建立及应用

目的建立布鲁菌聚合酶链反应(PCR)方法,对其进行应用评价。方法针对布鲁菌外膜蛋白编码基因(omp-2)设计PCR引物,建立PCR方法,利用19种常见细菌和布鲁菌株DNA分别对其进行特异性和敏感度评价,对3株疑似布鲁菌株进行核酸检测,并与分离培养法进行结果比对。结果本研究建立的布鲁菌PCR检测方法仅能检出布鲁菌阳性菌株,对照菌DNA未出现目的条带;敏感度为100拷贝/反应;PCR方法对3株疑似布鲁菌株检出omp-2基因条带,鉴定结果为布鲁菌,与分离培养法结果相同。结论本研究建立了一种布鲁菌PCR检测方法,与分离培养法相比,布鲁菌PCR方法准确、快速,适合布鲁菌病疫情的快速检测。