微小RNA miR-26a的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆微小RNA hsa-miR-26a并构建其慢病毒表达载体.方法 将PCR扩增得到的miR-26a前体序列和pIVTHM载体经双酶切后连接产生pIVTHM-miR-26a慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.用pIVTHM-miR-26a、psPAχ2和pMD2.G 3质粒共转染包装细胞293FT,包装产生慢病毒.以293FT细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果 经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-26a的慢病毒表达载体pIVTHM-miR-26a.倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光,并测得病毒滴度为5×105TU/ml.成功构建hsa-miR-26a的慢病毒表达载体.为深入研究miR-26a的生物学功能奠定了基础.     

大鼠PEDF44mer慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠色素上皮衍生因子（PEDF）44mer基因的慢病毒表达载体并检测其表达.方法 化学合成PEDF 44mer-6his,亚克隆入GV206载体,测序鉴定.挑取阳性克隆转染293T细胞,实时荧光定量PCR法测定病毒滴度.将已构建的病毒转染293T细胞,RT-PCR和Western blot法检测44mer-6his表达.结果 阳性克隆测序与设计的44mer基因序列完全一致,44mer慢病毒构建成功.实时荧光定量 PCR法检测病毒滴度为2.00E＋9 TU/ml.44mer慢病毒转染293T细胞后,RT-PCR检测到44mer表达.Western blot显示44mer-6his融合蛋白表达阳性.结论 成功设计构建了PEDF 44mer慢病毒,为进一步研究44mer在缺血性心肌病中的作用和机制奠定基础.     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

人NESG1基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

目的克隆人NESG1基因,构建与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体pGC-FU-NESG1-EGFP,包装慢病毒,感染293FT细胞并进行鉴定。方法以NESG1全长克隆为模板扩增其编码框序列,通过限制性内切酶AgeI酶切、T4 DNA连接酶连接,将NESG1插入慢病毒载体pGC-FU-EGFP,构建pGC-FU-NESG1-EGFP重组载体。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系293FT,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293FT细胞,荧光显微镜下观察感染效率,Western blot方法检测NESG1-EGFP融合蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体pGC-FU-NESG1-EGFP,三质粒共转染293FT细胞后可见大量绿色荧光;浓缩病毒后测定其滴度为2×107 TU/ml;以复感染系数MOI为1感染293FT细胞,感染效率在90%以上。Western blot证实细胞表达NESG1。结论成功构建NESG1慢病毒表达载体,包装得到高滴度慢病毒,为后续感染鼻咽癌细胞,探索其在鼻咽癌发生和发展中的作用奠定了基础。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

Construction of lentiviral expression vector containing human TRADD gene and its inhibitory effect on proliferation in hyperplastic scar fibroblasts

目的 构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体,并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响.方法 以购买的人TRADD基因为模板,采用PCR法扩增目的基因片段,PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro重组.重组质粒转化DH5α感受态细胞.菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆测序无误后,质粒共转染293FT细胞制备慢病毒.Real-time定量PCR法检测病毒滴度.Western blot检测TRADD-GFPFLAG融合蛋白的表达.MTT法检测TRADD基因慢病毒对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响.结果 菌落PCR扩增产物经凝胶电泳,阳性克隆得到1 200 bp片段,基因测序显示重组质粒中TRADD序列与GenBank中序列一致.包装产生的慢病毒转染293 FT细胞48 h后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度为3.22×108 IU/ml,Western blot检测到融合蛋白TRADD-GFP-FLAG在293FT细胞中获得有效表达,MTT法证实该融合蛋白具有生物活性,能有效抑制瘢痕成纤维细胞增殖.结论 成功构建并包装了pLVX-TRADD-EGFP-3 FLAG-Puro慢病毒表达载体,其可明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖.     

小窝蛋白-1重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建小窝蛋白-1（Cav-1）重组慢病毒载体，并在293T细胞和小鼠中验证Cav-1过表达。方法将Cav-1基因克隆至慢病毒载体GV287，然后利用酶切、PCR扩增鉴定、阳性克隆鉴定及测序验证构建Cav-1重组慢病毒。将Cav-1重组慢病毒转染至293T细胞，通过荧光检测慢病毒转染效果，采用Westernblot法检测Cav-1蛋白表达情况，同时转染C57BL6小鼠，免疫组化法检测小鼠肺组织中Cav-1的表达情况。结果经酶切、PCR扩增鉴定以及阳性克隆测序，提示Cav-1重组慢病毒构建正确。荧光检测显示转染Cav-1重组慢病毒后的293T细胞可见强荧光，Westernblot法检测结果显示目的基因可表达，小鼠肺组织中Cav-1呈强阳性表达，且实时定量PCR检测Cav-1重组慢病毒滴度为1.3×1012copies/ml，达到可利用标准。结论采用本研究方法可成功构建Cav-1重组慢病毒载体。     

LMP1与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒的制备

目的: 制备EB病毒LMP1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒. 方法: 采用RT- PCR方法获得LMP1全外显子片段,使之克隆到带绿色荧光蛋白慢病毒表达载体质粒FUGW中. 经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体. 在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-LMP1导入病毒包装细胞293FT, 荧光显微镜检测基因的表达,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩,PCR鉴定. 结果: 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合; LMP1准确克隆入FUGW的多克隆位点. 慢病毒的3种质粒可高效转染入293FT细胞,荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光. 绿色荧光位于细胞的胞膜及胞质. 结论: 成功制备了LMP1与GFP融合基因慢病毒,为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.     

人THAP11慢病毒载体的构建及表达研究

目的 构建人死亡相关蛋白11(THAP11)基因的慢病毒载体,并建立其慢病毒表达系统.方法 PCR方法获得人THAP11基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pBPLV-THAP11-myc,并通过转染HEK293细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及Western blot检测其表达.在脂质体介导下将重组质粒与包装质粒pLP1和pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞包装产生慢病毒.结果 构建的质粒经PCR,酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293FT细胞获取的5.5×106TU/ml慢病毒滴度.结论 成功构建了人THAP11基因慢病毒载体质粒THAP11-myc-pBPLV,并建立了其慢病毒表达系统,为后续的应用研究奠定了基础.