TPX2作为c-MYC下游靶点在肝细胞癌中的作用机制研究

目的 探讨爪蟾驱动样蛋白2靶向蛋白(Targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2,TPX2)在肝细胞癌中的表达及作用,并初步探讨其促进肝癌进展的分子机制.方法 应用实时定量RT-PCR法及Western blot法检测肝细胞系L02、肝癌细胞系HepG2、MHCC-97H、Huh7、SMMC-7721中TPX2的表达情况;应用TPX2-siRNA转染MHCC-97H细胞,通过Western-blot技术检测转染后TPX2的表达变化,并采用BrdU细胞增殖分析、Caspase3/7活性分析检测细胞增殖及凋亡变化,明确下调TPX2表达对肝癌细胞增殖凋亡的影响;应用c-MYC-siRNA转染MHCC-97H细胞,通过Western-blot技术分析c-MYC的表达与TPX2分子及AKT信号通路的关系.结果 肝癌细胞系MHCC-97H中TPX2表达水平显著高于其它细胞系L02、HepG2、MHCC-97H、Huh7、SMMC-7721(P＜ 0.05);下调TPX2表达将显著降低MHCC-97H细胞的增殖,并促进肝癌细胞凋亡;下调c-MYC表达能够显著下调TPX2表达并减少AKT的磷酸化水平,抑制AKT信号通路活化.结论 TPX2可能在肝细胞癌的增殖凋亡中起了重要作用,很有可能是肝癌靶向治疗的一个新的靶点.     

一氧化氮供体JS-K联合阿司匹林促进人肝细胞癌细胞凋亡

目的 研究一氧化氮供体(JS-K)与阿司匹林联合用药协同诱导人肝细胞癌(肝癌)HepG2和SMMC7721细胞凋亡的作用.方法 人肝癌HepG2和SMMC7721细胞分别设立细胞对照组(只加等量二甲亚砜,终浓度<0.01％)、JS-K 5μmol·L-1组、阿司匹林5,10和20 mmol·L-1组、JS-K 5μmo...     

趋化因子受体CXCR4及其配体CXCL12在肝癌侵袭 转移中的作用及机制

目的 探讨趋化因子受体 CXCR4 及其配体 CXCL12（CXCL12/CXCR4）在原发性肝癌侵袭转移中的作用 及机制。方法 分别采用 Western blot、免疫组化和 Real-time PCR 等方法检测 60 例肝癌及对应癌旁组织标本中 CXCL12/CXCR4 蛋白及 mRNA 表达水平。常规培养 4 种肝癌细胞（Huh7、MHCC97h、HepG2、Hep3B）和正常肝细胞 （7702）,Real-time PCR 检测上述细胞中 CXCL12、CXCR4 mRNA 的表达,筛选合适的实验细胞。将 CXCR4 干扰质 粒（sh-CXCR4）和对应空载体（sh-control）分别转染至 MHCC97h 构建稳转细胞系。Transwell 侵袭实验、细胞划痕实 验、MTT 实验分别检测 2 组细胞的侵袭、迁移和增殖能力。取稳定表达的 sh-control 和 sh-CXCR4 MHCC97h 细胞, 接种至 6 只裸鼠皮下,观察瘤体生长情况。Western blot 检测 sh-control 和 sh-CXCR4 MHCC97h 细胞及对应裸鼠移 植瘤中血管内皮生长因子-C（VEGF-C）的表达,同时对转染 CXCR 过表达质粒的 MHCC97h 中 VEGF-C 的表达水平 进行检测。结果 （1）Western blot、免疫组化和 Real-time PCR 的结果均证实肝癌组织中 CXCL12/CXCR4 蛋白及 mRNA 表达水平均高于癌旁组织。（2）Huh7、MHCC97h、HepG2、Hep3B 细胞中 CXCL12/CXCR4 mRNA 表达水平均高 于 7702 细胞,选取 MHCC97h 为实验细胞。转染 sh-CXCR4 的 MHCC97h 细胞的侵袭、迁移和增殖能力均明显低于 sh-control 组,同时接种含 sh-CXCR4 的 MHCC97h 细胞的裸鼠移植瘤的生长速度也明显小于 sh-control 组。（3）体外 和体内实验均证实 sh-CXCR4 组的 VEGF-C 表达水平均低于 sh-control 组,而过表达 CXCR4 后,VEGF-C 的蛋白表 达明显上调。结论 CXCL12/CXCR4 在原发性癌组织和肝癌细胞中呈现高表达,CXCL12/CXCR4 可能通过调控 VEGF-C 蛋白表达从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。     

叉头框转录基因C1和上皮钙黏蛋白对肝癌临床预后及癌细胞生物学行为的影响

目的探索叉头框转录基因C1(FOXC1)和上皮钙黏蛋白(E-Cadherin)表达水平与肝癌临床预后的关系,及其对肝癌细胞生物学行为的影响。方法用免疫组织化学法检测FOXC1和E-Cadherin在97例肝癌组织和及对应的癌旁组织标本中的表达,并分析两者表达的相关性。构建稳定干扰细胞系HepG2-shFOXC1,同时设置阴性对照HepG2-shNC和空白对照HepG2,用平板克隆实验和Transwell实验分别检测增殖和侵袭能力。结果在肝癌组织和癌旁组织中FOXC1蛋白阳性表达率分别为74.23%(72例/97例)和42.27%(41例/97例),E-Cadherin阳性表达率分别为29.89%(29例/97例)和100.00%(97例/97例),差异均有统计学意义(均P<0.05)。Spearman分析结果显示,FOXC1和E-Cadherin在肝癌组织中的表达呈负相关(P<0.01)。HepG2-shFOXC1组、HepG2组和HepG2-shNC组的克隆细胞数分别为(234.00±21.00),(897.00±89.00)和(898.00±84.00)个,通过matrigel基质胶的数量分别为(62.00±11.00),(171.00±15.00)和(167.00±17.00)个,HepG2-shFOXC1组的上述指标均明显低于HepG2组和HepG2-shNC组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论FOXC1可能通过抑制E-Cadherin表达,从而增强肝癌细胞增殖和侵袭能力。     

靶向沉默SSBP1基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响

目的 观察靶向沉默线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响.方法 设计并构建靶向SSBP1 基因的特异性siRNA,采用脂质体介导瞬时转染肝癌HepG2细胞,细胞分3组:对照组、空白转染组、转染组.Real time-PCR和Western-blot检测靶向干扰后SSBP1 mRNA和蛋白表达变化.CCK-8法检测细胞增殖.流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率及线粒体膜电位.划痕实验及Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭转移能力.Western-blot检测增殖、侵袭转移相关基因蛋白表达状况.结果 SSBP1 siRNA能够显著抑制SSBP1 mRNA和蛋白表达.与对照组和空白转染组比较,转染SSBP1 siRNA后HepG2细胞增殖能力、G2期和S期细胞比例、线粒体膜电位明显降低,G1期细胞比例、细胞凋亡率明显升高(P<0.05);同时细胞增殖相关基因PCNA、凋亡抑制基因Bcl-2、转移相关基因MMP-9蛋白表达显著下调,凋亡诱导基因Bax蛋白表达显著上调(P<0.05).结论 靶向沉默SSBP1基因能够通过线粒体途径抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移,并诱导其凋亡.     

青天葵甲醇提取物通过ERK通路抑制人肝癌细胞增殖并诱导其凋亡

目的 研究青天葵甲醇提取物（Nervilia fordii methanol extracts，NFME）体外对人肝癌SMMC7721和HepG2细胞的凋亡作用及其作用机制。方法 紫外-可见分光光度法测定青天葵中总黄酮和总多酚的含量；MTT法检测不同浓度（0，0.25，0.5，1，1.5，2 mg·mL^-1）NFME处理24 h对SMMC7721、HepG2和LO2细胞生长抑制率的影响；克隆形成试验观察NFME对SMMC7721和HepG2细胞克隆形成率的影响；Hoechst凋亡染色观察NFME对SMMC7721细胞凋亡的影响；流式细胞术检测NFME对SMMC7721细胞凋亡和细胞周期的影响；Western blotting测试NFME作用下caspase3、PARP、ERK1/2和c-Raf蛋白磷酸化水平的变化。结果 NFME中总多酚含量为（4.25±0.46）mg·g^-1，总黄酮含量为（4.72±0.13）mg·g^-1；MTT试验结果显示，与对照组相比，在给药24 h时0.5 mg·mL^-1的NFME就能抑制SMMC7721和HepG2细胞的增殖（P<0.001）；克隆形成试验表明，0.125 mg·mL^-1的NFME能够抑制SMMC7721和HepG2细胞集落的形成（P<0.001）；Hoechst凋亡染色观察到0.25 mg·mL^-1的NFME作用24 h能够观察到SMMC7721细胞发生凋亡（P<0.05）；流式细胞试验结果证实0.5 mg·mL^-1的NFME能够诱导SMMC7721细胞的凋亡（P<0.01），凋亡率14.43%，阻滞细胞周期于S期；Western blotting结果表明NFME能使SMMC7721细胞中caspase3发生剪切，随着给药浓度增加其剪切作用越明显（P<0.05），活化的caspase3剪切下游PARP的表达；同时NFME能够降低SMMC7721细胞中ERK1/2和c-Raf蛋白的磷酸化水平（P<0.05）。结论 NFME能抑制人肝癌SMMC7721和HepG2细胞的活性并诱导其发生凋亡，其作用机制可能与抑制ERK信号通路从而诱导细胞凋亡有关。     

MTA1在不同肝癌细胞和组织中的表达及其调控初步研究

用RT-PCR的方法检测了不同来源的肝细胞和不同的临床来源肝组织样本中MTA1表达差异,发现在肝癌细胞HepG2和SSMC-7721中的MIA1表达显著高于正常来源肝细胞L02,在肝癌组织的MTA1表达量是正常对照和癌旁组织的2倍左右,同时其在转移性肝癌的MTA-1表达也高于非转移肝癌.利用信号通路筛选的方法对常见的和...     

沙苑子黄酮抗裸鼠人肝癌移植瘤的实验研究

目的观察沙苑子黄酮(ACF)对人肝癌细胞SMMC7721裸鼠移植瘤生长的影响。方法30只裸小鼠建立人肝癌SMMC7721细胞皮下移植瘤模型后随机分为模型组、环磷酰胺(CTX,25mg·kg-1)组、ACF-1(400mg·kg-1)、ACF-2(200mg·kg-1)和ACF-3(100mg·kg-1)5组,给予相应药物,观察肿瘤生长曲线和移植瘤重量,计算肿瘤抑制率;免疫组化方法检测增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在肿瘤组织中的表达;光镜和电镜观察肿瘤组织病理变化。结果ACF-1组和ACF-2组裸鼠肿瘤体积和重量明显降低,ACF各给药组平均抑瘤率分别为68.20%、41.19%、26.79%;ACF-1组和ACF-2组肿瘤组织PCNA表达率明显减少(P<0.01,P<0.05);病理学观察结果,ACF可引起SMMC7721细胞坏死,诱导SMMC7721细胞凋亡。结论ACF可抑制SMMC7721裸鼠移植瘤的生长,其作用可能与下调肿瘤组织PCNA表达和诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

2β(3羟丙氧基)骨化三醇对人肝癌细胞周期阻滞及P~(27kip1)蛋白的诱导表达

目的探讨2β(3羟丙氧基)骨化三醇(ED-71)诱导人肝癌细胞HepG2生长抑制和细胞周期G1阻滞,及对抑癌基因P27kip1表达的影响。方法培养HepG2,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察ED-71对HepG2的生长抑制作用,流式细胞术分析细胞周期,以Western-blot检测HepG2细胞中P27kip1蛋白的表达水平。结果ED-71处理后HepG2的生长缓慢,细胞生长受到明显抑制。细胞阻滞于G1期(80.6±2.6,48.7±3.0,P<0.05),P27kip1蛋白表达水平增强(0.11±0.06,0.67±0.08,P<0.05)。结论ED-71抑制人肝癌细胞株HepG2的生长,诱导人肝癌细胞分化,使细胞阻滞于G1期,可能与ED-71诱导人肝癌细胞中抑癌基因P27kip1蛋白的表达有关。     

黄芩素通过调控糖酵解及谷氨酰胺代谢抑制肝癌细胞能量代谢

摘要：目的:探讨黄芩素对肝癌细胞能量代谢能力的影响及机制。方法:不同人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2中给予不同浓度的黄芩素,通过检测细胞ATP含量、乳酸含量、谷氨酰胺代谢评价黄芩素对肝癌细胞增殖及能量代谢的影响,同时分别采用siRNA干扰己糖激酶2（HK2）及溶质载体家族1A5（SLC1A5）表达后,考察黄芩素对肝癌细胞增殖及能量代谢能力的影响。结果:黄芩素可以浓度、时间依赖性的抑制肝癌细胞活力,SMMC-7721细胞24,48,72 h处理后的半数抑制浓度(IC50)分别为26.07,20.9,18.7μmol·L-1,HepG2细胞24,48,72 h处理后的IC50分别为27.8,24.5,22.6μmol·L-1。与对照组比较,20μmol·L-1黄芩素可明显降低SMMC-7721和HepG2细胞对葡萄糖的消耗及乳酸含量（P<0.05）,同时显著降低SMMC-7721和HepG2细胞中谷氨酰胺含量（P<0.05）。与敲除HK2的肝癌细胞联合培养72 h后,与对照组比较,20μmol·L-1黄芩素仍可降低细胞能量代谢水平（P<0.05）,但对肝癌细胞的糖酵解能力无显著影响。与敲除SLC1A5后的肝癌细胞联合培养72 h后,与对照组比较,20μmol·L-1黄芩素能显著降低肝癌细胞的能量代谢及糖酵解能力（P<0.05）。在无谷氨酰胺环境下,20μmol·L-1黄芩素对于敲除HK2肝癌细胞的能量代谢调节作用与siRNA HK2组无显著差异。结论:黄芩素可抑制肝癌细胞的增殖,降低肝癌细胞的能量代谢水平,其作用机制与其同时参与肝癌细胞糖酵解及谷氨酰胺代谢相关。     

Knockdown of Myosin VI Inhibits Proliferation of Hepatocellular Carcinoma Cells In Vitro

Hepatocellular carcinoma is the primary malignancy of the liver and is the third leading cause of cancer‐related death worldwide. Despite its severity, the treatment methods for hepatocellular carcinoma are limited due to poor prognosis. This study identified the short hairpin RNA‐mediated silencing of myosin VI as a potential approach for the treatment of hepatocellular carcinoma. Firstly, the expression of myosin VI was analyzed in 57 hepatocellular carcinoma samples and 10 non‐neoplastic samples by immunohistochemistry. The results demonstrated that myosin VI expression was much stronger in hepatocellular carcinoma tissues than in adjacent normal tissues. Myosin VI short hairpin RNA was then transduced into HepG2 and SMMC‐7721 hepatocellular carcinoma cell lines, respectively, using a lentivirus delivery system. Knockdown of myosin VI led to a significant reduction in cell proliferation and colony‐forming capacity, as well as a blockade of cell cycle progression. Moreover, an obvious decrease in PRAS40 phosphorylation and a concomitant increase in p38 phosphorylation were observed in myosin VI knockdown cells, which suggest that myosin VI silencing inhibits hepatocellular carcinoma cell growth in vitro probably via inactivation of PRAS40 and activation of p38 mitogen‐activated protein kinase‐dependent signaling pathway. This study highlights the potential of myosin VI to be developed as a target for hepatocellular carcinoma therapy.     

PTPeta介导生长抑素对SMMC7721生长抑制作用的实验研究

目的:采用生长抑素抑制人肝细胞肝癌细胞株SMMC7721增殖,检测细胞中蛋白酪氨酸磷酸酶eta(PTPeta)的表达情况,观察使用正钒酸钠抑制PTPeta活性后肿瘤细胞增殖变化。方法:应用免疫荧光/RT-PCR法检测SMMC7721细胞中PTPeta的表达;RT-PCR、MTT法检测生长抑素作用后及正钒酸钠抑制PTPeta活性后,PTPeta的表达变化及肿瘤细胞增殖变化。结果:SMMC7721细胞中PTPeta表达为阳性,并定位于细胞壁;生长抑素作用后SMMC7721细胞内PTPeta表达增加,细胞增殖受抑,正钒酸钠可取消这一作用。结论:PTPeta在SMMC7721细胞中表达,并介导生长抑素对SMMC7721细胞生长抑制作用。     

肝细胞癌的细胞分裂周期基因 20表达与临床病理特征关系及对预后的影响

目的分析肝细胞癌病人细胞分裂周期基因 20(CDC20)表达与临床病理特征的关系及对预后的影响。方法收集 2016年 5月至 2017年 12月在商丘市第三人民医院行手术治疗的肝细胞癌病人 146例，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、蛋白质印迹法和免疫组织化学检测肝细胞癌及癌旁组织中 CDC20的表达情况。将免疫免疫组织化学评分 0~7分和 8~12分的病人分别设为 CDC20低水平组( n=86)和 CDC20高水平组( n=60)分析两组间的临床病理特征和生存率。结果 CDC20 mRNA在肝细胞癌组织中相对表达水平为( 2.33±0.67)，高于癌旁组织(0.9，7±0.29)(P<0.001)。 CDC20在肝细胞癌组织中蛋白表达水平为( 0.91±0.05)高于癌旁组织( 0.14±0.05)(P<0.001)。 CDC20在肝细胞癌组织中阳性表达率为 77.4%(113/ 146)高于癌旁组织 8.2%(12/146)(，P<0.001)。 CDC20的表达与病人的肿瘤长径、被膜侵犯、脉管侵犯、肿瘤多发、分化程度和 TNM分，期有关(均 P<0.05)。 CDC20高水平组术后 3年总生存率( 61.7%)和疾病无进展生存率( 50.0%)，均低于 CDC20低水平组(87.2%、69.8%)(均 P<0.05)。结论肝细胞癌中 CDC20的水平增加，可能参与肿瘤的增殖和侵袭。 CDC20高水平提示病人     

Argonaute 2 promotes angiogenesis via the PTEN/VEGF signaling pathway in human hepatocellular carcinoma

Aim:

Argonaute2 (AGO2) protein is the active part of RNA-induced silencing complex, cleaving the target mRNA strand complementary to their bound siRNA. An increasing number of miRNAs has been identified as essential to angiogenesis of hepatocellular carcinoma (HCC). In this study we investigated how AGO2 affected HCC angiogenesis.

Methods:

Human HCC cell lines HepG2, Hep3B, Huh7, SMMC-7721, Bel-7404, MHCC97-H and LM-3, and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were tested. The expression of AGO2 in HCC cells was knocked down with siRNA and restored using recombinant adenovirus expressing Ago2. The levels of relevant mRNAs and proteins were examined using RT-PCR, Western blot and EILSA. Nude mice were implanted with Huh7 or SMMC-7721 cells, and tumor volumes were measured. After the mice were euthanized, the xenograft tumors were used for immunohistological analysis.

Results:

In 6 HCC cell lines, AGO2 protein expression was significantly correlated with VEGF expression (r=+0.79), and with VEGF secretion (r=+0.852). Knockdown of Ago2 in Huh7 cells and SMMC-7721 cells substantially decreased VEGF expression, whereas the restoration of AGO2 reversed both VEGF expression and secretion. Furthermore, knockdown of Ago2 significantly up-regulated the expression of PTEN (a tumor suppressor involved in the inhibition of HCC angiogenesis), and vice versa. Moreover, the specific PTEN inhibitor bisperoxovanadate (7, 14, 28 nmol/L) dose-dependently restored the expression of VEGF and the capacity of HCC cells to induce HUVECs to form capillary tubule structures. In the xenograft nude mice, knockdown of Ago2 markedly suppressed the tumor growth and decreased PTEN expression and CD31-positive microvascular in the xenograft tumors.

Conclusion:

A direct relationship exists between the miRNA processing machinery AGO2 and HCC angiogenesis that is mediated by the AGO2/PTEN/VEGF signaling pathway. The results suggest the high value of Ago2 knockdown in anti-angiogenesis therapy for HCC.     

人过氧化物氧化还原酶-1在胃癌中的表达情况及其临床意义

目的 探讨人过氧化物氧化还原酶-1（PRDX1）在胃癌中的表达情况及其与胃癌临床病理特征和预后之间的关系。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）检测21例胃癌与相应癌旁组织中PRDX1 mRNA和蛋白的表达水平,并应用免疫组化法检测105例胃癌和癌旁组织中PRDX1蛋白的表达水平,以分析其表达情况与临床病理特征及预后的关系。结果 qRT-PCR和Western Blot检测发现,PRDX1在胃癌组织中的mRNA和蛋白的表达水平均高于癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学检测结果表明,PRDX1蛋白水平在胃癌组织中高于癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.05）。不同肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期间PRDX1蛋白表达水平差异有统计学意义（P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示,PRDX1蛋白的过表达与总生存时间及无病生存时间较短相关。COX多因素分析显示,PRDX1是胃癌独立的预后影响因子。结论 胃癌组织中PRDX1蛋白的表达明显升高,PRDX1蛋白高表达可能促进了胃癌的发生和发展,可能做为胃癌的早期诊断及预后评估的新型生物学指标。     

乙肝相关性肝癌组织中细胞凋亡蛋白抑制因子 2蛋白的表达变化及其意义

目的 探讨乙肝相关性肝癌组织中细胞凋亡蛋白抑制因子2(inhibitor of apoptosis protein 2,IAP2)蛋白的表达变化及其意义.方法 选取2015年1月至2017年6月河南省传染病医院乙肝相关性肝癌术后组织标本80例(A组)、非乙肝相关性肝癌术后组织标本40例(B组)、乙肝相关性肝癌癌旁组织(C组)40例,采用免疫组织化学、蛋白质印迹法(Western blotting)检测三组标本中IAP2蛋白表达,分析乙肝相关性肝癌组织中IAP2蛋白表达与其病理特征的关系.结果 A组的IAP2蛋白阳性表达率为76.25％,高于B组的35.00％和C组的30.00％,差异有统计学意义(P<0.05);A组的IAP2蛋白积分光密度累积值高于B组和C组,差异有统计学意义(P<0.05);IAP2蛋白阳性表达与乙肝相关性肝癌病人的临床分期、包膜侵犯、门脉侵袭、发生淋巴结转移显著相关(P<0.05).结论 IAP2蛋白在乙肝相关性肝癌组织中表达显著提高,并且与病人的临床分期、包膜侵犯、门脉侵袭、发生淋巴结转移有相关关系.