重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子的抗肿瘤活性

目的：检测重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）的抗肿瘤活性。方法：检测重组人可溶性VEGI对建株人脐静脉内皮细胞（ECV304）、新生牛主动脉内皮细胞（BAEC）增殖抑制的活性以及对荷S180肉瘤小鼠的疗效。结果：重组人可溶性VEGI可以直接抑制ECV304、BAEC的增殖,强烈抑制S180肉瘤生长并延长S180腹水瘤小鼠的寿命。结论：重组人可溶性VEGI可通过抑制新生血管形成用于肿瘤治疗。     

羊栖菜多糖对人肺癌细胞及肿瘤血管内皮细胞模型增殖活性的影响

目的研究羊栖菜多糖（SFPS）对体外培养的人肺癌细胞SPC-A-1、血管内皮细胞及肿瘤血管内皮细胞模型增殖活性的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）观检测羊栖菜多糖对人肺癌细胞SPC-A-1、血管内皮细胞及肿瘤血管内皮细胞模型的增殖活性的影响。结果 300及1000 mg/L浓度SFPS可明显抑制SPC-A-1细胞的增殖活性;30及100 mg/L浓度SFPS对人胎儿脐静脉内皮细胞的增殖具有促进作用,但明显抑制SPC-A-1诱导的肿瘤血管内皮细胞模型的增殖活性。结论高浓度SFPS可抑制人肺癌细胞SPC-A-1增殖活性,并可通过抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖而抑制肿瘤的生长。     

可溶性血管内皮细胞生长抑制因子基因的克隆与表达

目的：对可溶性人血管内皮细胞生长抑制因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＶＥＧＩ）基因进行克隆和表达,检测表达产物对血管内皮细胞增殖的抑制活性。方法：将可溶性人ＶＥＧＩ基因克隆入载体ｐＵＣ１９后测序;再将正确的ＶＥＧＩ基因亚克隆入表达载体ｐＰＲＯＥＸＨＴｂ,ＩＰＴＧ诱导表达;初步纯化表达产物,检测对新生牛主动脉内皮细胞增殖抑制活性。结果：可溶性人ＶＥＧ     

重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中的高效表达

目的:在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性.方法:采用PCR方法对编码人VEGI全基因进行修饰,获得编码成熟蛋白第29～174位氨基酸的C端胞外区基因片段,将PCR产物亚克隆到 pMD-18T中,经DNA测序证实后亚克隆入高表达载体pLOU-1,转化大肠杆菌BL21,获得高表达菌株.经IPTG诱导获得高表达,纯化表达产物并检测其对内皮细胞ECV304增殖的抑制活性 .结果:重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中获得高效表达,约占细菌总蛋白的40％;纯化的重组蛋白经复性后具有直接抑制内皮细胞增殖的活性.结论: 重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中获得高效表达,且表达的重组蛋白具有抑制内皮细胞生长作用,为研究其抗肿瘤作用打下了基础.     

血管生成抑素endostatin的表达、纯化及活性研究

目的：将从人胎肝组织克隆的血管生成抑素endostatin基因进行原核表达、纯化,检测重组endostatin的生物学活性。方法：利用原核表达载体pBV220在大肠杆菌DH5α中表达endostatin,利用肝素Sepharose亲和层析及SephacrylS-200分子筛纯化;通过体外内皮细胞（ECV304）增殖实验及体内鸡胚尿囊膜（CAM）新生血管实验检测其抑制活性。结果：Endo-statin在DH5α中的表达率为28.5%,纯化后纯度可达90.5%.En dostatin可明显抑制体外培养的内皮细胞增殖.IC50为72ug/ml;20时使细胞于48h发生明显凋亡;200ug/ml的endostatin可使CAM新生血管化率下降30%.结论:研究结果表明endostatin对内皮细胞具有明显抑制作用.提示其在肿瘤及新生血管性疾病的治疗中有潜在的应用前景。     

Ad-VEGI151对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的:研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子基因(VEGI151)对静脉内皮细胞的增殖抑制作用.方法:利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,Western印迹法检测病变细胞内基因的蛋白质表达.X-gal染色测定重组腺病毒载体系统的基因转移效率,结晶紫染色法检测细胞D570/630值,观察Ad-VEGI151对ECV304细胞增殖抑制作用的效果,免疫组织化学检测ECV304细胞内VEGI151基因的蛋白质表达.结果:应用细胞内质粒DNA同源重组法,将脂质体介导质粒pCA13-VEGI151与pJM17共转染293A细胞制备重组腺病毒,所获病毒滴度高,是一种制备重组腺病毒切实可行的方法.Ad-VEGI151在病变细胞内能成功表达蛋白,具有较高的基因转移效率,对静脉内皮细胞的增殖具有强烈的抑制作用,并能在靶细胞内表达有生物学活性的蛋白质.结论:以复制缺陷型重组腺病毒为载体的VEGI151基因能在靶细胞内表达具有生物学活性的蛋白质,抑制体外静脉内皮细胞的增殖,这为进一步肿瘤及新生血管性疾病的基因治疗提供了新的方法.     

视网膜Müller细胞条件培养基及抗VEGF对血管内皮细胞的作用

目的：观察高糖条件下制备的视网膜Müller细胞条件培养基（HGMCM）及抗VEGF对血管内皮细胞的作用。 方法：采用免疫荧光、流式细胞术和Boyden小室迁移实验观察HGMCM,含wortmannin及含VEGF单克隆抗体HGMCM对血管内皮细胞的作用。 结果：HGMCM可促进体外培养的血管内皮细胞的增殖和迁移（142.00±15.32/视野）,wortmannin、VEGF单克隆抗体可明显抑制HGMCM诱导的血管内皮细胞的增殖和迁移（89.00±9.28/视野,93.00±9.64/视野）,使血管内皮细胞被阻滞于G₁/S转变期,含wortmennin和VEGF单克隆抗体HGMCM组与HGMCM组比较,差异均有显著性（P<0.01）。 结论：HGMCM诱导血管内皮细胞的增殖和迁移一部分是通过VEGF发挥作用的,拮抗VEGF的活性可抑制血管内皮细胞的增殖和迁移,进而抑制新生血管形成。     

IFN-α抑制肿瘤血管形成的实验研究

目的:探讨干扰素α(IFN-α)的抗肿瘤血管形成作用机制.方法:采用MTT法检测不同浓度IFN-α对体外培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响;检测不同剂量IFN-α对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成的影响.结果:IFN-α对血管内皮细胞增殖有直接抑制作用;而且对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成也有抑制作用.结论:提示IFN-α可通过直接抑制血管内皮细胞增殖而发挥抗血管形成作用.     

铁对人肺癌细胞及肿瘤血管内皮细胞模型增殖活性的影响

目的研究铁对体外培养的人肺腺癌细胞SPC-A-1及肿瘤血管内皮细胞模型增殖活性的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测人肺腺癌细胞SPC-A-1及肿瘤血管内皮细胞模型的增殖活性,流式细胞仪检测铁对SPC-A-1细胞周期和细胞凋亡的效应。结果10、30、100及300lamol／L浓度组铁可明显促进SPC-A-1细胞的增殖活性;10、30及100μmol／L浓度组铁使SPC-A-1的G1期细胞比例减少,S期和G2期细胞比例增多;30及100μmol／L浓度组铁使SPC-A-1的凋亡率显著降低;30及100μmol／L的铁可明显促进肿瘤血管内皮细胞的增殖活性。结论铁可通过促进肿瘤细胞向S期转化、降低凋亡率从而促进SPC-A-1细胞增殖,还可通过刺激血管内皮细胞的增殖促进肿瘤的增长。     

真核表达人和鼠可溶性VEGFR 2的双基因疫苗的构建及抗肿瘤实验研究

目的 构建能同时表达人和鼠可溶性VEGFR2的双基因真核表达载体.并初步验证其功能.方法 分别以pORF-hVEGFR2和pORF-mVEGFR2为模板,通过PCR将人和鼠的sVEGFR2基因定向克隆人真核细胞双顺反子载体pVITR02的多克隆位点区.构建pVITRO2-hm-sVEGFR2双基因表达质粒.通过体外实验研究pVITRO2-hm-sVEGFR2的表达产物能否阻断VEGF对脐静脉血管内皮细胞的促增殖能力,体内实验建立小鼠B16肿瘤模型研究其抗肿瘤活性,CD31免疫组化染色检测其对肿瘤新生血管的抑制情况.结果 pVITR02一hm-sVEGFR2双基因表达质粒成功构建,体外能阻断VEGF对血管内皮细胞的促增殖能力,能明显抑制肿瘤在小鼠体内的生长以及肿瘤组织内的新生血管生成,其抑制作用大于人或鼠可溶性VEGFR2单基因治疗方案.结论 pVITRO2-hm-sVEGFR2明显抑制新生血管生成活性,是一种新型的抗血管生成DNA疫苗,为抗肿瘤治疗研究提供了新的思路和方法.     

小檗碱衍生物B-119抑制肿瘤及血管内皮细胞增殖的作用

目的探讨小檗碱衍生物B-119对肿瘤细胞的增殖抑制作用及对血管内皮细胞增殖、迁移和小管形成的影响。方法MTT法检测B-119对瘤细胞株MDA-MB-231、B16、K562、LLC、HT29、SMMC-7721、Colo205、HL60和血管内皮细胞ECV304的增殖抑制作用;划痕法测定B-119对血管内皮细胞ECV304迁移的影响;观察B-119对血管内皮细胞ECV304小管形成的影响。结果 B-119对8株肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用,IC50值为0.76～26.83mg/L;B-119对ECV304的增殖抑制作用表现为时间、浓度依赖性,24,48,72h的IC50分别为59.22,12.08,3.31mg/L;药物干预组ECV304细胞迁移数减少,且随B-119浓度的增加,迁移抑制作用越强,B-119浓度为1.25,2.5,5mg/L干预24h后,细胞迁移数渐次减少,抑制率分别为49.29%,59.71%和71.94%(P<0.01);B-119对ECV304小管形成有明显的抑制作用,浓度为10,20,30mg/L时的小管形成抑制率分别为35.71%,57.14%和67.86%(P<0.01)。结论 B-119可抑制肿瘤细胞的增殖,并抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成。     

三羟异黄酮对脐静脉内皮细胞ECV304增殖影响与VEGFR的关系

目的探讨三羟异黄酮(genistein)抗肿瘤血管生成的机制.方法通过绘制生长曲线和流式细胞仪检测三羟异黄酮和血管内皮生长因子(vaScular endothelial growth factor,VEGF)对脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响,应用免疫沉淀和激酶活性分析方法检测ECV304细胞血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growthfactor receptor,VEGFR)磷酸化水平和蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)活性.结果VEGF单独处理能使ECV304细胞增殖,VEGFR磷酸化水平和PTK活性升高,而三羟异黄酮单独处理能抑制ECV304细胞生长,细胞周期主要被阻止在G2/M期,并出现细胞凋亡现象,VEGFR磷酸化水平和PTK活性降低(P＜0.01),三羟异黄酮和VEGF同时处理时,细胞周期主要仍被阻止在G2/M期,但凋亡率下降,VEGFR磷酸化水平和PTK活性与VEGF单独处理组相比降低.结论三羟异黄酮能下调ECV304细胞VEGFR的磷酸化水平及PTK活性,从而阻断胞外生长刺激信号向胞内转导的级联反应,阻遏血管内皮细胞生长,抑制肿瘤血管生成.     

小鼠脑微血管内皮细胞的体外培养

目的 探讨脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行细胞超微结构研究及组织型纤溶酶原激活物（ＴＰＡ）活性测定。方法 取新生小鼠脑组织,通过匀浆、过筛、胶原酶消化、差速粘附等技术对鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养,待细胞铺满瓶底时,用０．１２５％胰酶－０．０２％ＥＤＴＡ消化,离心收集内皮细胞,进行传代培养。原代、传代各取８例,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试ＴＰＡ活性。结果 经Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学鉴定     

c-myc反义核苷酸对淋巴瘤细胞系CA46凋亡的作用

目的 研究c—myc反义核苷酸对体外培养的淋巴瘤细胞系CA46基因表达及诱导凋亡的作用。方法 c—myc反义核苷酸(ASPO)为人工合成的针对c—myc基因的一段外源性基因片段，以无义的寡核苷酸作为对照，导入CA46细胞后观察其基因表达及诱导凋亡的作用。流式细胞仪检测c—myc基因产物表达，荧光染色观察CA46细胞的凋亡形态，流式细胞仪定量检测凋亡百分率，TUNEL检测加用VP16后的CA46原位凋亡。结果 c—myc反义核苷酸(ASPO)作用CA46细胞后，RT—PCR示c—myc mRNA表达降低。荧光染色ASPO组细胞胞体缩小，胞膜完整，核质浓缩，出现黄绿色不规则或局部致密荧光，凋亡细胞约占23．3％，而SPO组及空白组未见明显凋亡细胞，细胞呈均匀绿色荧光。流式细胞仪检测仅用VP16 10mg／L 3d，ASPO作用2d后加VP16 10mg／L 1d及ASPO作用3d均出现凋亡峰，凋亡率分别为16％，72％及52％，而SPO组及空白但均未见凋亡峰。流式细胞仪检测CA46细胞c—myc蛋白为95．3％，经ASPO作用后降为23．7％，同时SPO组c—myc表达率为90．6％，TUNEL检测ASPO组凋亡细胞为25．5％，加用VP16后的CA46凋亡率为36．7％。结论 体外实验中CA46特异地被c—myc反义核酸抑制生长，细胞出现凋亡表现，c—myc mRNA癌基因表达降低。     

β-榄香烯对血管内皮细胞成血管能力、细胞凋亡及MMP-2、MMP-9活性的影响

  目的 观察β-榄香烯对血管内皮细胞成血管能力、细胞凋亡及基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9活性的影响,探讨β-榄香烯对肿瘤血管生成的抑制作用。方法 人血管内皮细胞株ECV304体外培养,Matrigel胶检测血管内皮细胞的成血管能力,Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,明胶酶谱实验检测血管内皮细胞中MMP-2和MMP-9的活性。结果 接种于Matrigel胶的ECV304细胞经β-榄香烯作用后,形成管腔数目明显减少。随着β-榄香烯浓度增加及作用时间延长,ECV304细胞凋亡明显增多。明胶酶谱实验结果显示,β-榄香烯可明显抑制内皮细胞中MMP-2和MMP-9的活性。结论 β-榄香烯可以促进体外培养的血管内皮细胞凋亡,抑制血管内皮细胞的成血管能力,使血管内皮细胞在Matrigel胶中形成的管腔数目减少,同时β-榄香烯能够抑制血管内皮细胞中MMP-2和MMP-9的活性。     

褪黑激素对体外培养肿瘤细胞活性的影响

目的 研究褪黑激素（MT）对体外培养肿瘤细胞活性的影响。方法 MTT法测定MT的抗肿瘤活性;电镜观察药物对肿瘤细胞形态学的影响;流式细胞仪检测药物对肿瘤细胞周期的影响。结果 高浓度MT（1mmol/L或2mmol/L)可抑制肿瘤细胞的生长,延长肿瘤细胞倍增时间（TD）;作用3天,可使S期细胞的比例减少,细胞形态学发生非特异性改变,有较多的坏死细胞和少量凋亡细胞。结论 高浓度MT抑制肿瘤细胞增殖。MT作为肿瘤患者的辅助治疗药物有待深入研究。