牛成牙骨质细胞在体内形成牙骨质样组织的初步研究

目的：培养成牙骨质细胞（cementoblasts,CBs)，观察以CBs自身作为组织工程支架在裸鼠内形成牙骨质的可行性。方法：在矿化培养液中培养新生牛的成牙骨质细胞，使其形成多层CBs作为载体（CBs-made carrier)与CBs混合，植入裸鼠皮下。以CBs与胶原膜载体（collagen carrier) 复合体作为对照。7周后取材并做HE、von Kossa、茜素红及牙骨质附着蛋白单克隆抗体免疫组化染色。结果：CBs在体内可形成牙骨质样矿化组织，中心矿化程度较高，四周有尚未钙化的类牙骨质及CBs包绕，并有牙骨质细胞埋入矿化组织。以CBs自身作为载体所形成的牙骨质较以胶原膜作为载体所形成的牙骨质样组织多。结论：本组分离培养的CBs在体内可形成牙骨质样矿化组织；以多层细胞自身作为载体是一种较理想的生物支架材料。     

Beagle犬骨髓基质细胞复合A-PCPC裸鼠皮下成骨的实验研究

目的:观察支架材料活性磷酸钙骨水泥(active porous calcium phosphate cement,A-PCPC)及其与Beagle犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)复合体在裸鼠体内的成骨性能.方法:抽取Beagle犬骨髓,体外分离培养、成骨诱导、扩增BMSCs并通过细胞化学方法检测其成骨表型.体外构建BMSCs/A-PCPC复合体,并行扫描电镜超微结构观察.将复合体植于裸鼠背部皮下,同期植入单纯A-PCPC作为对照组.术后2、4、8周取材,HE染色,进行组织学及组织形态计量学分析.结果:ALP染色阳性,Von Kossa染色可见钙结节形成.扫描电镜可见细胞贴附于材料表面及孔隙表面生长.HE染色显示,2周时,复合体组可见少量编织骨,单纯材料组成骨较少.4周时,复合体组可见编织骨向小梁骨转化,单纯材料组可见大量骨样组织.8周时,复合体组新骨趋于成熟,单纯材料组骨成熟度较差.结论:A-PCPC支架接种BMSCs后显示良好的成骨活性,能够促进未成熟骨矿化.可以作为骨组织工程支架材料.     

犬骨髓基质细胞和β-磷酸三钙复合物在裸鼠体内的成骨性能

目的：观察犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）和支架材料β-磷酸三钙（β-TCP）复合物植入裸鼠体内的成骨情况。方法：首先在体外构建BMSCs和β-TCP的复合物，大小3mm^3左右。实验分为3组：裸鼠体内植入单纯β-TCP，植入未经体外培养的BMSCs和β-TCP复合体，植入体外培养5d的BMSCs和β-TCP复合体。植入后1周、1个月和3个月取出标本，进行大体观察、X线片观察、灰度测定、组织学观察及成骨图像分析。结果：植入后3个月，BMSCs＋B-TCP体外培养组X线片密度最高，DigiDens X线片灰度值3组分别为：0．605〉0．555〉0．473（P〈0．01）。HE染色显示：1个月后，BMSCs＋β-TCP体外培养组见新骨和血管形成；3个月后，BMSCs＋β-TCP体外培养组新骨形成明显，并有大量血管生成．BMSCs＋β-TCP体外未培养组少量成骨，单纯β-TCP组未见明显成骨。成骨罔像分析3组成骨密度均数分别为：23．99％、8．36％、1．23％（P〈0．05）。结论：BMSCs＋β-TCP复合物植入裸鼠体内4周出现新骨形成．3个月时．骨形成明显并有血管化生成。     

矿化诱导对骨髓基质细胞修复Ⅱ度根分叉病变的影响

目的:研究价矿化诱导对骨髓基质细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)体内形成牙周支持组织,治疗根分叉病变的影响。方法:2只beagle犬双侧下颌第3、4前磨牙和第1磨牙制备根分叉病变,分别植入胶原膜(空白对照组)、胶原膜-矿化诱导的BMSCs复合物(矿化诱导组)和胶原膜-非矿化诱导的BMSCs复合物(非矿化诱导组),术后12周组织学观察牙周组织再生情况。结果:新生牙槽骨面积和新生牙骨质长度的百分比,矿化诱导组(62.31±15.45和72.34±17.42)和非矿化诱导组(48.24±12.34和52.25±15.45)显著高于空白组(24.65±10.35和25.34±9.45)(P<0.05),但矿化诱导组和非矿化诱导组之间没有统计学差异。结论:BMSCs移植可以促进II度根分叉病变牙周组织再生,矿化诱导不能提高BMSCs体内修复Ⅲ度根分叉病变的能力。     

Bio-Oss胶原结合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:研究Bio-Oss胶原作为骨组织工程支架材料的可行性。方法:抽取成年小型猪骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞(BMSCs),经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况,并进行I型胶原、骨钙素的免疫细胞化学检测。将培养的第3代细胞接种于Bio-Oss胶原,进行超微结构观察,并将Bio-Oss胶原/BMSCs复合物植入裸鼠背部皮下,4、8周后进行组织学检测。结果:当接种密度为0.8×106/ml时,细胞与支架材料之间有最大附着量;VonKossa染色可见钙结节形成;I型胶原、骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示,8周时复合物内有新骨形成。结论:Bio-Oss胶原/BMSCs复合物显示成骨活性,Bio-Oss胶原可用作骨组织工程支架材料。     

hBMP-7基因转染的骨髓基质细胞与BME-10X胶原膜复合物的体外构建

目的:观察人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因转染的骨髓基质细胞(BMSCs)与胶原膜BME-10X复合后,BMSCs在BME-10X上的生长状态。方法:利用脂质体介导法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSCs,传代与胶原膜BME-10X复合,荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜观察。结果:转染细胞复合胶原膜后生长良好,24h细胞已贴附、伸展。透射电镜可见细胞与材料表面连接紧密,包膜部分增厚,形成类似半桥粒样结构。结论:hBMP-7基因转染BMSCs在胶原膜BME-10X上生长良好,hBMP-7基因转染的BMSCs与胶原膜复合物有望应用于牙周组织工程。     

不同浓度的骨髓基质细胞裸鼠体内成骨能力的研究

目的：探讨不同浓度骨髓基质细胞（BMSCs）与胶原膜BME-10X复合培养体的体内成骨能力,为深入开展牙周组织工程研究奠定基础。方法：将BMSCs分别以5×10^5/mL、5×10^6/mL和5×10^7/mL浓度与胶原膜复合培养后植入裸鼠皮下,8周后取材做病理切片,苏木精-伊红、Mallory染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色,观察其体内成骨能力。结果：实验组和对照组均有不同程度Ⅰ型胶原的表达,5×10^6/mL和5×10^7/mL组高于对照组和5×10^5/mL组（P〈0.05）,而5×10^6/mL与5×10^7/mL组之间、对照组与5×10^5/mL组之间无显著型差异。结论：在一定条件下BMSCs的浓度可影响复合体的体内成骨能力,浓度越高其成骨能力越强。     

矿化诱导对骨髓基质细胞修复Ⅱ度根分叉病变的影响

2只beagle犬双侧下颌第3、4前磨牙和第1磨牙制备根分叉病变,分别植入胶原膜(空白对照组)、胶原膜-矿化诱导的BMSCs复合物(矿化诱导组)和胶原膜-非矿化诱导的BMSCs复合物(非矿化诱导组),术后12周组织学观察牙周组织再生情况。结果:新生牙槽骨面积和新生牙骨质长度的百分比,矿化诱导组(62.31±15.45和72.34±17.42)和非矿化诱导组(48.24±12.34和52.25±15.45)显著高于空白组(24.65±10.35和25.34±9.45)(P<0.05),但矿化诱导     

应用兔骨髓基质细胞膜片与珊瑚支架构建组织工程骨

目的：探讨应用富血小板血浆与骨髓基质细胞（BMSCs）构建骨髓基质细胞膜片，以及应用骨髓基质细胞膜片与珊瑚支架构建组织工程骨的可行性。方法：将取自同一供体兔的BMSCs与富血小板血浆复合后，共同在体外培养10天，构建出BMSCs膜片，用其包裹珊瑚支架后植入裸鼠背部皮下，另以单纯BMSCs种植到珊瑚支架及以单一珊瑚植入作为对照。术后4周和8周取材，通过组织学观察和组织形态测量分析，评价其成骨情况。采用SPSS11．0软件，对所得数据进行统计学分析。结果：BMSCs与富血小板血浆共同在体外培养10d，可构建出厚约2mm的BMSCs膜片。用其包裹珊瑚支架后植入裸鼠背部皮下4周和8周，在珊瑚表面及其孔洞内有大量软骨和骨质形成．其成骨量明显大于单纯BMSCs种植组。单一珊瑚植入组未见骨或软骨形成。结论：将富血小板血浆与BMSCs复合后共同在体外培养，可构建出具有一定厚度的BMSCs膜片，将此膜片包裹珊瑚支架所形成的膜片一支架复合体具有良好的成骨活性.     

骨髓基质细胞-牙根-珊瑚羟基磷灰石复合体体内再植的初步观察

目的:评价体外构建的骨髓基质细胞(BMSCs)、珊瑚-羟磷灰石支架(CHA)、牙根复合体植入体内后牙根周组织的再生情况。方法:体外分离纯化的狗BMSCs分别与牙根及CHA支架共培养形成复合体后植入体内生长,16周后取材,组织切片观察牙根周组织的再生情况。结果:实验组较对照组所不同的是:有更趋成熟、致密的牙槽骨生成;牙根与牙槽骨之间形成了清晰的软组织间隙———类牙周膜结构,主要由纤维组织、毛细血管组成。结论:BMSC-CHA-牙根复合物植入体内后有效促进牙周组织的再生;组织工程学方法促进牙周组织再生具有可行性。     

骨髓基质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓基质干细胞低氧条件下培养后的成骨能力

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导内皮细胞(ECs)与自体BMSCs低氧条件下联合培养对BMSCs成骨能力的影响.方法:体外分离培养兔BMSCs并向ECs诱导培养,用CD34免疫细胞化学染色鉴定内皮细胞表型:实验分组为BMSCs常氧成骨诱导培养组,BMSCs低氧成骨诱导培养组,BMSCs+ ECs常氧成骨诱导联合培养组BMSCs+ECs低氧成骨诱导联合培养组,持续培养7d,前6d应用PNPP法每天固定时间测定碱性磷酸酶(ALP)活性并作统计学分析;茜素红染色观察第7d矿化结节形成情况.低氧组为1.0％O2浓度.采用SPSS11.0软件包对数据进行方差分析和q检验.结果:BMSCs在一定诱导条件下可诱导为ECs,CD34免疫细胞化学染色为阳性;统计学分析表明,BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组的ALP活性表达显著高于其他3组(P＜0.05).只有BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组有钙化结节形成,茜素红染色呈橘红色.结论:在一定时间内,由BMSCs诱导来源的ECs与自体BMSCs低氧条件下联合培养,BMSCs的成骨活性可显著提高.     

CKIP-1对骨髓间充质干细胞体外增殖和分化能力的影响

目的：探讨CKIP-1基因对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和分化能力的调控。方法：选择CKIP-1基因敲除型小鼠（KO）和野生型C57小鼠（WT）,采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,取第3代BMSCs,分为KO组和WT组,分别采用成骨及成脂诱导液对细胞进行诱导培养,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测目的细胞表面标记分子,用ALP染色、茜素红染色、油红O染色分别对细胞成骨及成脂能力做定量分析。结果：2种细胞增殖和干细胞分子表达相似;成骨诱导后ALP染色显示,KO组的细胞染色的阳性率要大于WT组。茜素红染色观察显示KO组的矿化结节要多于WT组;油红O染色显示KO组细胞的脂质沉淀量大于WT组。结论：CKIP-1基因缺失可以使BMSCs成骨及成脂分化能力增强,对其增殖影响不明显。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

SDF-1α/CXCR4信号轴介导柚皮素对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的: 探讨柚皮素对骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的影响,SDF-1α/CXCR4信号轴是否参与介导柚皮素促进BMSCs成骨分化。方法: 分离、培养及鉴定大鼠BMSCs,CCK8法检测不同浓度柚皮素对BMSCs增殖的影响,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性;RT-qPCR法检测各组ALP、骨钙素（osteocalcin,OCN）、趋化因子受体4（CXCL receptor 4,CXCR4）和基质细胞衍生因子1α（stromal cell derived factor-1,SDF-1α）的表达,ELISA法检测各组CXCR4和SDF-1α蛋白的表达。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 细胞鉴定结果表明,培养细胞为高纯度的BMSCs。第1、3天,柚皮素对BMSCs增殖无显著影响（P>0.05）;第5天时,50 μg/mL柚皮素可促进BMSCs增殖;第7天时,不同浓度柚皮素均促进BMSCs增殖（P<0.05）;同时,ALP活性随时间推移逐渐增强。RT-qPCR结果表明,柚皮素组和成骨诱导液组中相关基因表达均较培养基组明显增加,而AMD3100组中各基因表达均受到显著抑制（P<0.05）。ELISA检测结果显示,各组CXCR4和SDF-1α蛋白表达随诱导时间增加均逐渐上调,且两者均在100 μg/mL柚皮素组表达最高。结论: 柚皮素可促进BMSCs增殖和成骨向分化,SDF-1α/CXCR4信号轴参与柚皮素对BMSCs的成骨分化,主要在BMSCs成骨分化早期阶段。     

异种脱钙骨兔体内成骨能力的实验研究

目的制备猪脱钙骨,将兔骨髓间质干细胞与猪脱钙骨支架形成细胞-生物材料复合物,回植入兔皮下观察该材料体内成骨能力。方法梯度离心法分离兔骨髓基质干细胞,向成骨细胞方向诱导培养。将猪颅骨用氯仿丙酮及过氧化氢处理后冻干保存,钴60照射消毒待用。制备细胞-生物材料复合物后植入兔皮下,分别在4w,8w,12w取材,同期大体观察及组织学检测,切片HE染色。结果倒置相差显微镜下见细胞在材料孔隙间大量生长增殖、交叠覆盖;扫描电镜观察细胞贴附于材料表面并向孔隙内生长。组织学检测4w实验组见多数骨小梁表面有细胞被覆,有较多小血管形成。8w、12w实验组见新生骨小梁有新生骨组织形成,见成骨细胞和破骨细胞并存。结论兔骨髓间质干细胞与猪脱钙骨有良好的生物相容性,在该支架材料上细胞增殖分化并具有一定的体内成骨能力。     

气电纺聚羟基丁酸酯支架用于大鼠骨髓基质细胞体外培养的研究

目的研究气电纺聚羟基丁酸酯[poly（3-hydroxybutyrate）,PHB]纳米纤维支架的体外生物相容性。方法实验组用PHB纳米纤维支架接种大鼠骨髓基质细胞进行体外培养,对照组用培养板培养孔接种大鼠骨髓基质细胞进行体外培养,通过扫描电镜、四甲基偶氮唑盐比色法以及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）检测来评价PHB纳米纤维支架对大鼠骨髓基质细胞粘附、增殖活性以及ALP活性的影响。结果气电纺PHB纳米纤维支架材料对大鼠骨髓基质细胞具有良好的亲和性;与细胞培养板相比,气电纺PHB纳米纤维支架材料上的大鼠骨髓基质细胞具有较高的增殖活性及ALP活性。结论气电纺PHB纳米纤维支架有望用作骨组织工程支架材料。     

SDF-1α复合Pluronic F-127对兔上颌窦底提升术成骨影响的实验研究

目的 :通过制备基质细胞衍生因子(SDF1-α)的Pluronic F-127复合凝胶材料,观察这种复合材料在体外对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的矿化及成血管作用和复合凝胶材料在兔上颌窦外提升术中的成骨及成血管效果。方法:将兔骨髓间充质干细胞、50ng/ml SDF1-α和质量百分比浓度0.1%的Pluronic F-127复合培养,MTT法检测其细胞毒性,碱性磷酸酶活性测定及茜素红染色。将18只新西兰大白兔双侧进行上颌窦外提升术,双侧植入不同的复合材料(共3种)并进行对照。材料分别为:β-磷酸三钙(β-TCP),生理盐水及SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶。于术后4、8、12周处死,X线片观察双侧上颌窦骨质形成情况,行HE染色、CD31+、CD34+、BMP-2及VEGF免疫组织化学染色观察成骨及成血管作用,并进行统计学分析。结果:体外实验采用MTT法证实了0.1%w/w Pluronic F-127无细胞毒性(P>0.05)。BMSCs-SDF1α复合凝胶碱性磷酸酶染色下,细胞质可见大量碱性磷酸酶染色沉淀,其余3组未见沉淀。BMSCs-SDF1α复合凝胶、BMSCs-单纯凝胶、单纯BMSCs在成骨诱导培养条件下均产生矿化结节,非成骨诱导组未见矿化结节形成。体内实验,X线片结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶及β-TCP充填侧均有阻射影,生理盐水组未见明显阻射影;HE染色结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶成骨效果与β-TCP成骨效果明显,生理盐水组未见骨质形成,统计学分析表明BMSCs-SDF1-α复合凝胶成血管作用较β-TCP及生理盐水组明显增加。结论:SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶能够成功诱导BMSCs分化为成骨细胞,无细胞毒性,在体外及兔上颌窦内成骨、成血管效果明显。     

黄芪多糖对犬骨髓基质干细胞增殖及超微结构的影响

目的探讨黄芪多糖（APS）对诱导培养的犬骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖、分化成骨作用及超微结构的影响。方法用瑞氏- 姬姆萨染色、改良Gomori钙- 钴法、茜素红染色法检测BMSCs分化成骨的能力。用四唑盐（MTT）比色和酶动力学方法测定不同浓度和时间的APS对诱导培养的BMSCs增殖影响以及超微结构的改变。结果诱导条件下BMSCs具有成骨细胞活性,瑞氏- 姬姆萨染色呈深蓝色,改良Gomori钙- 钴法将细胞及矿化结节染成黑色,茜素红染色法见细胞及矿化结节成红色。第1、3天时,低浓度（0.005 mg/mL）APS可促进诱导培养的BMSCs增殖;而第5天时,高浓度（50 mg/mL）APS则明显抑制诱导培养的BMSCs增殖。第5天,透射电镜下,0.005 mg/mL APS组细胞线粒体、粗面内质网增多,细胞外基质分泌增加;50 mg/mL APS组细胞发生退变,粗面内质网和线粒体明显减少,且二者明显肿胀、变性、膜结构破坏。结论短期低浓度APS能促进诱导培养的BMSCs的代谢和蛋白质的合成,有利于细胞的增殖和向成骨分化。     

HMGB1对大鼠骨髓基质干细胞增殖和分化的影响

目的：探讨高迁移率族蛋白B1（HMGBl）对于大鼠骨髓基质干细胞BMSCs增殖、成骨／破骨的影响。方法：原代培养的大鼠BMSCs,分别以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,M‘rr法检测细胞数目;以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,7d后行AIJP染色和RT—PCR检测成骨／破骨基因的表达（骨钙素OCN,骨保护素OPG,核因子KB受体活化因子配体RANKL）。结果：HMGBl存100、500ng／mL浓度时,第3d和第5dBMSCs的OD值有明显升高,在第7d对BMSCs的ALP染色没有明显的改变,OCN和OPG基因的表达也没有明显变化,HMGBl明显提高了BMSCs的RANKI．及RANKI．／OPG基因表达。结论：HMGBl对大鼠BMSCs的增殖和破骨基因表达有明显的促进作用,为HMGBl应用于临床提供实验依据。