人ω干扰素在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化

目的 :在巴斯德毕赤酵母中表达及纯化人ω干扰素 (interferonω ,IFN_ω)以对其功能进行深入研究。方法 :用PCR方法扩增人IFN_ω基因 ,与分泌型酵母表达载体pMEX9K重组 ,经酶切、PCR和序列测定证实重组表达载体pMEX9Kω构建正确。将重组载体pMEX9Kω用SalⅠ酶切后 ,转化毕赤酵母GS115。得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中有人IFN_ω的表达 ,表达量为 4× 10 9U L。经过ButylSepharose 4FF疏水层析柱 ,SPSepharoseFF离子交换柱和Superdex 75凝胶过滤三步层析纯化 ,利用反相HPLC分析纯化的重组蛋白。结果 :得到了纯度 >99%的重组IFN_ω。N端氨基酸序列测定表明重组人IFN_ω具有正确的N端氨基酸残基顺序 ,相对分子质量为 2 2 0 0 0 ,并具有同天然蛋白相似的比活性。结论 :在毕赤酵母中成功地表达并纯化得到了同天然蛋白具有相似的比活性的人IFN_ω。     

抑瘤素M在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

目的：构建抑瘤素M（oncostatinM,OSM)的酵母表达体系,方法：将人OSM cDNA连入pPIC9K酵母表达载体,转染毕赤酵母（Pichia pastoris),用MD和MM营养缺陷型培养基筛选具有正确表型的重组转化子,用RNA印迹法和蛋白质印迹法鉴定母转化菌株中OSMmRNA转录和OSM相对分子质量。MTT法鉴定OSM蛋白对人黑素瘤细胞生长的抑制活性。结果：构建的毕赤酵母体系可实现人OSM分泌表达,表达量占外分泌蛋白的70％以上,表达蛋白相对分子质量约30000,对黑素瘤细胞生长可产生明显抑制作用。结论：OSM的酵母分泌表达体系表达量可观,表达蛋白集中于培养液上清,便于纯化,是日后进行OSM大规模制备的可行途径。     

重组人血清白蛋白在酵母中的表达及分析鉴定

目的：实现重组人白蛋白（rHSA)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表达,方法：将本室构建的rHSA表达载体转化毕赤酵母,用G418筛选抗性克隆,SDS－PAGE与Western印迹检测并鉴定表达产物;采用生化法、电泳扫描及Brodford法、竞争ELISA3种方法测定摇瓶培养条件下rHSA的表达量。结果：Western印迹分析发现转移至膜上的酵母表达产物能与抗人血清白蛋白单克隆抗体结合,相对分子质量与人血白蛋白一致,证明在酵母中成功地表达了rHSA。在甲醇诱导下摇瓶培养,rHSA表达量随诱导表达时间的延长而增加,第8天产量约为3．5g/L。结论：人血清白蛋白表达载体与毕赤酵母基因组整合,获得酵母表达株,摇瓶培养,该株表达量为3．5g/L。     

重组人α-半乳糖苷酶A在巴氏毕赤酵母中的表达及鉴定

目的：克隆人α-半乳糖苷酶A（α-GalA）cDNA，并在毕赤酵母中表达重组的人α-GalA。方法：利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人α-半乳糖苷酶AcDNA并构建到可用甲醇诱导的分泌型巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA中。将重组质粒导入毕赤酵母并用Zeion抗生素筛选转化细胞。在甲醇诱导后。利用SDS-PAGE、Western印迹及酶活测定方法在酵母上清中鉴定重组的人α-GalA。结果：获得人α-GalA cDNA，构建酵母表达质粒pHGCZα-A，将重组表达载体导入到酵母细胞，并在上清中检测到人α-GalA蛋白。结论：获得了人α-GalA cDNA及具有生物活性的重组人α-GalA，为临床应用于法布莱氏病的治疗奠定了基础。