二重实时PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的 建立二重实时聚合酶链反应（duplexreal-timePCR）快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。方法 采用二重SYBR Green实时PCR快速检测MRSA的决定基因mecA和金葡菌的种特异性基因nuc，经熔解曲线分析鉴定产物。结果 所有MRSA菌株的熔解曲线均呈现mecA、nuc基因特异性的峰，甲氧西林敏感的金葡菌仅有nuc峰，耐甲氧西林的表葡菌仅有mecA峰，甲氧西林敏感的表葡菌与其他菌种的菌株无特异峰出现；当MRSA菌浓度达10^2cfu／ml时就可检出。在131株金葡菌中，30．53％（40／131）耐药；二重实时PCR扩增mecA基因29．01％（38／131）阳性，nuc基因100％阳性。单引物与二重实时PCR两者阳性扩增符合率为100％。结论 对mecA、nuc基因进行二重实时PCR能准确、快速地鉴定耐甲氧西林的金葡菌和凝固酶阴性的葡萄球菌。     

耐甲氧西林葡萄球菌mecA基因的检测

为检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的mecA基因,准确和快速鉴定临床分离的MRS,将临床分离的161株葡萄球菌应用PCR扩增法鉴定MRS的mecA基因,并与苯唑西林纸片扩散法进行比较。结果表明,161株葡萄球菌用苯唑西林纸片扩散法和mecA基因法检测MRS,4株菌有差异,mecA基因法鉴定阴性耐苯唑西林纸片扩散法鉴定为耐药株;3株纸片扩散为临界耐药,mecA基因法鉴定阳性,两种方法的符合率是97．52％。结论：mecA基因检测技术可以准确、快速判定MRS,特别是在鉴定纸片扩散法临界耐药株具有优势。     

3种鉴定耐甲氧西林葡萄球菌方法的比较

目的比较琼脂稀释、纸片及基因检测法鉴定甲氧西林耐药葡萄球菌的方法。方法按2004年美国临床实验室标准化委员会推荐的头孢西丁纸片扩散(K-B)法、琼脂二倍稀释(MIC)法,从中筛选出表型耐甲氧西林葡萄球菌(MRS),再将受试的葡萄球菌进行多重聚合酶链反应的体外扩增检测mecA基因。结果从临床分离的180株葡萄球菌中,mecA基因阳性葡萄球菌98株,其中金黄色葡萄球菌(SA)mecA基因阳性26株,阳性率为36.1%;凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)mecA基因阳性72株,阳性率为66.7%,mecA阳性的MRS只对万古霉素、替考拉宁敏感。结论mecA基因的PCR检测能够尽早准确诊断,便于及时治疗MRS造成的感染。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法的比较

目的 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测方法进行比较.方法 分别用mecA基因PCR扩增法、PBP2a胶乳凝集试验法、头孢西丁纸片扩散法和苯唑西林纸片扩散法对临床分离的135株金黄色葡萄球菌进行榆测.结果 mecA基因PCR扩增法显示阳性79株,阴性56株;PBP2a胶乳凝集试验法的敏感性和特异性分别为96.2%和100.0%;头孢西丁纸片扩散法的敏感性和特异性分别为94.9%和96.4%;苯唑西林纸片扩散法的敏感性和特异性分别为94.9%和62.5%.结论 PBP2a胶乳凝集试验法和头抱西丁纸片扩散法与mecA基因PCR扩增法的检测结果高度一致;苯唑西林纸片扩散法特异性低,不再适用于MRSA的检测.     

应用PCR方法直接检测痰中耐甲氧西林葡萄球菌

目的建立直接用痰标本通过PCR方法快速检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法。方法利用聚合酶链反应技术（PCR）快速检出耐甲氧西林葡萄球菌，建立一种从痰中快速提取DNA方法，以粗提DNA作为PCR模板，检测编码耐甲氧西林葡萄球菌青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的mecA基因和细菌中均有的16SrRNA基因。结果364份临床痰标本经PCR方法检出mecA基因的38份，药敏法检出耐甲氧西林的葡萄球菌33份；38份mecA基因阳性的痰标本中有31份药敏法检测为耐甲氧西林的葡萄球菌，药敏法检出耐甲氧西林的葡萄球菌33份痰标本中有2份mecA基因阴性。16SrRNA基因片段在PCR中作为内部对照避免了假阴性结果的出现。结论用PCR直接检测痰中的mecA基因，是判断痰中是否含有耐甲氧西林的葡萄球菌的一种快速有效的方法。     

万古霉素敏感性减低葡萄球菌筛选及抗生素耐药相关基因检测

目的 了解万古霉素敏感性减低葡萄球菌临床分离株对-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素以及万古霉素耐药相关基因存在状况.方法 采用含61tg/mL万古霉素脑心浸液琼脂从临床分离的葡萄球菌中筛选万古霉素中介葡萄球菌和万古霉素耐药葡萄球菌;采用菌谱分析法筛选异质性万古霉素耐药葡萄球菌:E-test法和琼脂稀释法检测其MIC值;PCR技术扩增mecA,aac(6')/aph(2'),aph(3)-Ⅲ,tetM,vanA.vanB和vanC基因,并对阳性扩增产物进行测序.结果 从100株临床分离葡萄球菌中检出7株异质性万古霉素耐药葡萄球菌,并从部分菌株中检出耐药基因,mecA,aac(6')/aph(2'),aph(3')-川基因检出率分别为85.7%,57.1%和85.7%,没有检出tetM,vanA,vanB和vanC.对PCR阳性扩增产物进行测序,BLASTn比对分析,与已登录基因库的相同基因序列具有高度同源性.结论 同甲氧西林耐药葡萄球菌相似,万古霉素敏感性减低葡萄球菌携带多种耐药基因,耐药表型与基因分析支持该菌株多药耐药,该类菌株的检测对于指导临床合理用药具有积极意义.     

457株葡萄球菌临床分离率及耐药性分析

目的：回顾性分析2005年1月～2006年3月本地区临床标本中分离的457株葡萄球菌。对该时段细菌的临床分布情况及耐药性进行调查分析。以指导临床合理用药．控制医院内感染及进行流行病学调查。方法：对457株葡萄球菌的分布及耐药性进行统计分析，并检测mecA基因的携带情况，比较耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）与甲氧西林敏感葡萄球菌（MSS）的耐药率。结果：MRS感染以60～88岁的呼吸科、老年病科及ICU的患者居多（57.3％）。MRS在痰液样本中分离率最高（54．5％）。纸片扩散法和微量肉汤稀释法的检出率为均77．9％，葡萄球菌mecA基因检出率为73．5％。101株MSS对青霉素及氨苄青霉素的耐药率为87．1％和86．1％。而对氨苄西林，舒巴坦的耐药率为28．7％。MRS与MSS相比，对非β-内酰胺类抗生素的耐药率差异存在显著性。而对利福平和莫匹罗星，两者的耐药率均〈5％，且差异无显著性。未发现对万古霉素和替考拉宁耐药菌株。结论：MRS所致医院内感染情况严重，对抗菌药物呈多重耐药。其耐药性显著高于MSS。故临床治疗MRS感染必须依据实验室的结果合理选用抗生素。     

耐甲氧西林金葡菌的头孢西丁检测法与耐药性分析

目的评价头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的效果．了解MRSA的耐药状况。方法用头孢西丁及苯唑西林纸片扩散法、mecA基因聚合酶链反应（PCR）检测MRSA．并以mecA基因PCR法为参考方法与头孢西丁及苯唑西林纸片扩散法检测MRSA进行比较分析。按CLSI（原NCCLS）规定的标准测定MRSA对青霉素等10种抗生素的耐药率（KB法）。结果95株金葡菌（SA）中mecA基因阳性株42株。头孢西丁纸片法筛选出40株MRSA，其中39株mecA基因阳性，方法特异性为97．5％，灵敏度92．9％；苯唑西林纸片法筛选出44株MRSA，其中36株mecA基因阳性．方法特异性为81．8％．灵敏度85．7％。MRSA对青霉素、苯唑西林100％耐药，对万古霉素全部敏感．对红霉素、头孢唑林、克林霉素、氨苄西林／舒巴坦、头孢呋辛、左氧氟沙星、奈替米星呈不同程度耐药。结论头孢西丁纸片扩散法检测MRSA特异性和灵敏度优于苯唑西林纸片扩散法。MRSA具有多重耐药性．须加强其对抗生素的耐药性监测。     

哺乳期乳腺脓肿分离的金黄色葡萄球菌耐药性与毒力基因研究

目的研究哺乳期乳腺脓肿分离的金黄色葡萄球菌耐药性和毒力基因,为临床治疗提供参考依据。方法收集2015年1月至2017年12月我院乳腺科哺乳期妇女发生乳腺脓肿后分离到的金黄色葡萄球菌,包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)60株和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)64株,用聚合酶链反应(PCR)的方法分析mecA、hla、pvl、clfA、nuc、sea、psm-mec基因。结果 MRSA和MSSA菌株对青霉素(≥90.6%)和红霉素(≥59.4%)的耐药率较高,对利福平、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、莫西沙星、替加环素、万古霉素和利奈唑烷的敏感性较高(≥98.3%)。MRSA对克林霉素、四环素的耐药率明显高于MSSA (P<0.05)。60株MRSA经mecA基因检测均为阳性,64株MSSA均为阴性。Hla、clfA、nuc毒力因子在MSSA和MRSA中均具有较高的携带率(≥98.3%),MRSA携带毒力因子pvl明显低于MSSA (P<0.05)。结论 MRSA携带mecA基因,对克林霉素、四环素的耐药率高于MSSA;MRSA毒力因子pvl携带率低于MSSA,临床应针对哺乳期乳腺脓肿进行MRSA防控,同时需监测MSSA携带毒力基因的状况,评估患者的预后。     

16S rRNA及18S rRNA同时检测脑脊液中的病原菌

目的 提高脑脊液中病原菌的快速、准确鉴定率。方法 以细菌的保守序列16SrRNA和真菌的18SrRNA为通用引物，用多重PCR技术对标准菌株及46例中枢神经系统感染患者的脑脊液进行扩增，同时与脑脊液的培养结果进行比较。结果 标准菌株金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌、化脓性链球菌及白色念球菌均出现特异条带，人白细胞DNA为阴性。46份脑脊液标本培养阳性39例，另有2例PCR阳性而培养阴性，后经诱导传代培养证实为L型金黄色葡萄球菌。PCR阳性41例，与培养分离鉴定结果符合率为100％。结论 多重PCR可快速鉴定脑脊液中病原菌，为临床及时治疗提供必要的诊断信息。     

2006—2011年60株血感染的金黄色葡萄球菌毒素及耐药基因分析

【摘要】目的 了解2006-2011年临床分离的60株血感染金黄色葡萄球菌的耐药情况及毒素基因和耐药基因的流行情况。方法 VITEK 2-compact全自动细菌鉴定仪及配套鉴定卡、药敏卡对细菌进行鉴定及药敏试验;头孢西丁纸片扩散法筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）;应用聚合酶链反应（PCR）检测mecA、耐消毒剂基因（qacA）、杀白细胞素基因(pvl)、肠毒素基因（sea、seb、sec1、sed、see）及中毒休克综合征毒素-1基因( tst)。结果 60株金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率最高（91.7%）,其次为红霉素（65.0%）、克林霉素（65.0%）、庆大霉素（40.0%）。未发现万古霉素、利奈唑胺、替加环素耐药菌株。其中携带耐药基因mecA 13株（21.7%）、qacA 3株（5.0%）、检出毒素基因pvl 4株（6.7%）、肠毒素基因sea 20株（33.3%）、seb 3株（5.0%）、sec 9株（15.0%）及sed 7株（11.7%）,未检出see 及tst。结论 血感染的金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素、克林霉素、庆大霉素耐药率高,同时携带多种毒素及耐药基因,临床应加强毒素及耐药基因检测。     

Rapid detection of methicillin resistance in staphylococci using a slide latex agglutination kit

The slide latex agglutination test, MRSA-Screen, was compared with the mecA polymerase chain reaction (PCR) and traditional susceptibility test methods for the detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. The MRSA-Screen test detected the same number of methicillin-resistant S. aureus as the mecA PCR and the traditional susceptibility tests. It correctly identified all 21 methicillin-susceptible S. aureus as being sensitive. It also produced the same result as the mecA PCR in identifying a methicillin-resistant S. aureus among six isolates classified as borderline resistant by traditional susceptibility tests. The MRSA-Screen test and mecA PCR detected methicillin resistance in 10 and 15 of 17 methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci, respectively. From these results, it is concluded that the MRSA-Screen is a very accurate, reliable and rapid method of detecting methicillin resistance in S. aureus and is suitable for use in clinical microbiology laboratories. Further study of its use in detecting methicillin resistance in coagulase-negative staphylococci is required.     

引物标记技术的应用与葡萄球菌多重耐药基因检测法的建立

目的 基于多重基因遗传信息表达分析系统(GeXP)技术平台,应用CY5(荧光染料)标记的特异引物代替通用引物,建立一种高通量的葡萄球菌多重耐药基因检测法。方法 设计细菌16S rDNA、耐甲氧西林相关基因(mecA、MecA LGA251)与耐大环内酯类相关基因(ermA、ermB、ermC、sat4、msrA、ereA、ereB、mefA/E)的引物,经“PCR+琼脂糖电泳”筛查2014年1月—2016年12月中山大学附属第八医院129株耐甲氧西林或者耐红霉素葡萄球菌基因,同时优化PCR。用CY5标记上游引物5'端,制作GeXP多重PCR引物。应用多重PCR扩增多重耐药基因核酸,产物经琼脂糖电泳与GeXP毛细管电泳,分析电泳图优化PCR。应用优化后的GeXP多重PCR扩增43株葡萄球菌,验证应用效果。结果 129株葡萄球菌筛出7种基因(16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC、sat4和msrA)。16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC和msrA引物特异性好,但不同核酸的sat4基因能扩增出两种不同大小片段。建立的GeXP多重PCR能同时检出所有靶基因。43株葡萄球菌的检测结果与表型检测(VITEKⅡ Compact System)相符;与“PCR+琼脂糖电泳”相比：sat4符合率为97.67%(42/43),无统计学差异(P＞0.05);msrA符合率为95.35%(41/43),无统计学差异(P＞0.05);ermA、mecA、16S rDNA、ermB和ermC符合率均为100%(43/43)。结论 采用CY5标记特异引物应用于GeXP系统检测葡萄球菌多重耐药基因的方法可行,其特异性与敏感性高,若采用更多引物,其检测通量可进一步提高。     

多重PCR技术检测沙门菌两种四环素耐药基因

应用两对特异性引物同时检测四环素耐药基因tetB和tetC通过对35株沙门菌分离株的四环素耐药性检测，表明所有沙门菌分离株均含tetC基因，与药敏试验结果阳性符合率65．7％，8株同时含有tetB基因，与药敏试验结果阳性符合率100％，tetB基因和tetC基因双阳性的菌株与药敏试验结果阳性符合率也为100％。取其中部分菌株扩增出tetB和tetC基因片段进行序列分析，5株菌的tetB基因扩增产物序列完全相同，与质粒pRT11相应序列同源性达99．7％；14株菌的tetC基因扩增产物与质粒pBR322中的相应序列同源性为100％。证实沙门菌耐药基因普遍存在，且同时含有tetB和tetC基因的菌株表现耐药。多重PCR技术同时检测两种四环素耐药基因，适合大量样本的检测，对开展沙门菌四环素多种耐药基因的分子流行病学监测提供了有效途径。     

41株金黄色葡萄球菌耐药性分析及PVL基因检测

目的了解临床分离金葡菌对常用抗生素的耐药性和杀白细胞毒素(PVL)基因携带情况。方法采用头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),K-B法检测临床分离的41株金葡菌对常用抗生素的敏感性,PCR法检测mecA基因和PVL基因携带情况。结果 41株金葡菌中MRSA占51.2%,MRSA对克林霉素、红霉素、氨基糖苷类和喹诺酮类耐药率明显高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),MRSA和MSSA对复方新诺明敏感率分别为90.5%和95%,未发现对万古霉素、替考拉林和利奈唑胺耐药株。21株MRSA mecA基因均阳性,41株金葡菌中共检出2株携带PVL基因,MRSA与MSSA各占1株,均分离自骨科病房。结论该院临床分离MRSA耐药率高,应规范临床用药,加强MRSA耐药性监测,加强PVL基因的检测,防止此类菌株的播散。     

Discrepancies between mecA PCR and conventional tests used for detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus

Conventional and molecular techniques are being used in the detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus but they do not always show concordant results. In this study, a mecA PCR-based amplification was compared with the 1 microg oxacillin disk diffusion test and the Epsilometer test (E-test) for detection of MICs. Among 31 isolates initially characterized as MRSA by the disk diffusion test, mecA was detected in only 13 (42%) isolates. The E-test showed a wide range of oxacillin MICs (0.5 - > 256 microg/ml) among these 31 MRSA isolates: seven isolates had an MIC of > 256 microg/ml, one had 64 microg/ml, two had 4 microg/ml, two had 3 microg/ml, one had 2.5 microg/ml, nine had 2 microg/ml, three had 1.5 microg/ml, five had 1 microg/ml and one had 0.5 microg/ml. Comparing the mecA PCR results with the E-test oxacillin MIC findings revealed that mecA was detected in seven of eight isolates (87.5%) with an MIC of > or = 64 microg/ml, in three of 14 isolates (21.4%) with an MIC of 2-4 microg/ml and in three of nine isolates (33.3%) with an MIC of < 2 microg/ml. Beta-lactamase production was positive in 28/31 isolates (90.3%). Because of this variation between tests and since several resistance mechanisms are known to mediate methicillin resistance in S. aureus, the reliable detection of MRSA cannot be solely based on detection of mecA gene in S. aureus. At this stage and until new guidelines are introduced by an official body, such as NCCLS, a combination of conventional methods alone or together with a molecular method should be used every time S. aureus is tested for detection of methicillin resistance.