Ca^2＋-钙调蛋白在M3R介导逼尿肌细胞收缩中的作用

背景：毒蕈碱受体在调节逼尿肌细胞收缩过程中起重要作用，其受体亚型M3R直接介导逼尿肌细胞收缩。Ca^2＋是刺激逼尿肌细胞收缩的直接因素，Ca^2＋有数十种受体结合蛋白质，Ca^2＋通过与不同受体蛋白结合调节不同反应。 目的：探讨Ca^2＋-钙调蛋白在M3R介导逼尿肌细胞收缩中的作用。 设计：以逼尿肌细胞为观察对象，对比观察。 单位：解放军第三军医大学西南医院泌尿中心。 材料：实验在重庆西南医院中心实验室完成，实验动物选择健康雌性Wistar大鼠。 方法：将原代培养逼尿肌细胞分为实验组和对照组，接种于6孔培养板上培养，实验组培养细胞70％融合时加入1&;#215;10^-4mmol／L卡巴胆碱和毒蕈碱受体亚型M2R拮抗剂，分别阻断M3R、M2R，采用Ca^2＋浓度和钙调蛋白活性检测试剂盒分别测定两组逼尿肌细胞Ca^2＋浓度和钙调蛋白活性。 主要观察指标：两组细胞内[Ca^2＋]i浓度、钙调蛋白活性变化。 结果：实验组的[Ca^2＋]i和钙调蛋白的平均通道荧光对数值高于对照组（3．26&;#177;0．38，2．06&;#177;0.12，P〈0．01）；（2．87&;#177;0.34，2．14&;#177;0．24，P〈0．05）。 结论：实验结果提示Ca^2＋-钙调蛋白以信号传导途径参与了M3R介导逼尿肌细胞收缩的调节过程。     

大鼠不稳定膀胱的产生与毒蕈碱受体亚型密度改变

背景:不稳定膀胱的发生与毒蕈碱受体(MR)变化有关,MR有5种亚型,而膀胱逼尿肌仅有两种亚型—M2R,M3R,目前尚不清楚MR亚型在不稳定膀胱发生中的作用。目的:探讨MR亚型密度变化与不稳定膀胱发生之间的关系。设计:随机对照的实验研究。单位:解放军第三军医大学西南医院泌尿中心。材料:实验在重庆西南医院中心实验室完成,选用为30只Wistar大鼠。方法:建立不稳定膀胱大鼠模型,将30只大鼠分成实验组和对照组各15只,实验组在10g/L苯巴比妥麻醉下,对大鼠施行尿道结扎手术,造成尿道不完全梗阻。对照组大鼠仅切开皮肤,而不结扎尿道。采用RT-PCR方法测定实验组大鼠不稳定膀胱及对照组逼尿肌MR亚型密度。主要观察指标:尿动力学,M2RNA和M3RNA含量,及两者的比值变化。结果:对照组逼尿肌组织含有M2RNA和M3RNA,M2RNA(1.67±0.42)含量明显多于M3RNA(0.64±0.19),两者之比约2.59∶1,没有检测到M1,M2和M3亚型的mRNA。实验组大鼠不稳定膀胱逼尿肌中M2和M3密度均增加,分别为(2.03±0.65)和(1.53±0.46),M3增加更明显(P<0.01),两者比值显著缩小,约1.4∶1。结论:不稳定膀胱产生与MR亚型上调及M2R,M3R亚型之间的比例失调有关。     

钙在嗜铬细胞瘤细胞缺氧性脑损伤中的作用研究

目的观察缺氧后大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞内游离钙的浓度(犤Ca2+犦i)、环磷酸腺苷(cAMP)、钙调蛋白(CaM)和钙调蛋白激酶II(Ca2+/CaM-PKII)的变化。方法采用放免技术,从细胞水平进一步观察缺氧对PC12细胞的毒性、细胞内犤Ca2+犦i变化,cAMP、CaM和Ca2+/CaM-PKII的变化。结果缺氧组PC12细胞cAMP、CaM含量在缺氧后24h明显高于正常对照组;Ca2+/CaM-PKII活性明显低于正常对照组。结论犤Ca2+犦i、cAMP、CaM和Ca2+/CaM-PKII在缺氧PC12细胞损伤机制中起了重要的作用。     

谷氨酸在低氧性脑损伤中的作用

目的探讨谷氨酸(Glu)在低氧性脑损伤的作用机制。方法实验采用氨基酸分析和放免技术,研究缺氧后12,24,48h脑组织Glu和钙调蛋白(CaM)含量的变化以及钙/钙调蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/CaM-PKⅡ)活性的影响及其机制。结果缺氧组脑组织Glu、CaM含量在缺氧后48h明显高于12,24h和对照组;缺氧组脑组织Ca2+/CaM-PKⅡ活性在缺氧后48h明显低于12,24h和对照组;而N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂地佐环平(MK-801)和钙通道拮抗剂尼莫地平(nimodipine)可对抗这种改变。结论缺氧后Glu的兴奋毒引起脑损伤和Ca2+/CaM-PKⅡ的活性下降,主要由NMDA受体介导和胞外Ca2+内流增加有关。     

钙调蛋白在介导大鼠结肠平滑肌细胞Ca^2＋内流的作用机制

【目的】探讨钙调蛋白在介导大鼠结肠平滑肌细胞中Ca^2＋内流的作用机制。【方法】将酶解分离好的大鼠结肠平滑肌细胞,随机分为以下4组：①对照组;②EGTA组;③EGTA＋Veraparmil组;④EGTA＋W7组。荧光探针Fura-2／AM标记细胞内游离Ca^2＋,荧光分光光度计检测大鼠结肠平滑肌细胞Ca^2＋浓度。【结果】在无Ca^2＋缓冲液中加入EGTA（1mmol／L）使Ca^2＋浓度由静息时（82．24±3．65）nmol／L升高至（267．45±4．86）nmol／L,继之,向细胞外液中引入两种浓度的Ca^2＋（1．5mmol／L和3．0mmol／L）,导致Ca^2＋浓度进一步升高,分别为（470．23±4．21）hmol／L、（945．32±3．56）nmol／L．上述升高效应对L型电压操纵性钙通道阻滞剂维拉帕米（verapamil,5μmol／L）不敏感（P〉0．05）,但钙调蛋白抑制剂W7对上述升高效应有抑制作用（P〈0．01）。【结论】钙调蛋白参与大鼠结肠平滑肌细胞的钙内流。钙调蛋白抑制剂W7能抑制由EGTA引起的细胞钙内流。这对于进一步深入研究钙通道活性改变,为预防和控制因胃肠动力紊乱所致的消化管疾病具有重要意义。     

阿普卡林对低氧-复氧乳鼠心肌细胞保护作用的机制

目的探讨低氧/复氧(H/R)对心肌细胞内Ca浓度(犤Ca犦i)的影响,以及阿普卡林减轻H/R过程中钙超载的作用。方法采用SD大鼠乳鼠(n=80)进行心肌细胞培养,用Ca2+荧光指示剂Fluo-3/AM负载30min,然后分3组:(1)正常对照组;(2)H/R组:细胞低氧30min/复氧30min;(3)阿普卡林组:先加入终浓度为100μmol/L的阿普卡林,再行低氧30min/复氧30min。于两个实验组接受低氧处理前及刚开始复氧时、复氧30min后用激光共聚焦显微镜技术检测3个组心肌细胞犤Ca2+犦i的变化。实验重复8次,共观察24个细胞。结果对照组心肌细胞犤Ca2+犦i荧光强度和荧光光密度值较低,分别为645.5U,80.3U及0.5%,0.3%。低氧30min后复氧即刻,犤Ca2+犦i荧光光密度值开始增加,复氧30min后犤Ca2+犦i荧光强度和荧光光密度值显著增高(与对照组比较,P<0.01)。而阿普卡林组细胞内荧光光密度值显著低于H/R组(χ2=20.51,P<0.01)。结论心肌细胞H/R导致钙超载;而阿普卡林有明显减轻心肌细胞H/R时Ca2+超载的作用,从而保护心肌细胞。     

CB1 Cannabinoid Receptor-Dependent and -Independent Inhibition of Depolarization-Induced Calcium Influx in Oiigodendrocytes

Ca2+稳态平衡的调节在少突胶质细胞功能和存活中起重要作用.大麻素CB1和CB2受体在许多细胞中调节Ca2+水平和/或K+电流.本文利用培养的少突胶质细胞中,通过增高细胞外K+浓度(50 mM诱导膜去极化,研究大麻素复合物在此过程引发钙内流中的作用.CB2受体激动剂ACEA导致去极化诱导的少突胶质细胞胞浆的Ca2+瞬变表达浓度依赖性抑制,最大效应为(94±3)%,半效应浓度(EC50)为(1.3±0.03)μM.这种作用可被CB2/CB2激动剂CP55、940、内源性大麻素类AEA和2-AG所模拟,但是CB2受体选择性激动剂JWH133没有作用.CB2受体拮抗剂AM251(1μM)也可减少细胞外高K+诱导的Ca2+反应.但不能防止ACEA(3 μM)诱发的抑制效应.然而,ACEA和AEA减少去极化诱导的Ca2+瞬变的能力在CB2受体敲除小鼠和经百日咳毒素预处理的少突胶质细胞中明显降低.内流性K2+通道阻断剂BaCI:(300 μM)和CsCl2(1 mM)降低电压诱导的Ca2+内流并部分阻断ACEA的抑制效应.本文表明,大麻素抑制少突胶质细胞中去极化诱导的Ca2+瞬变是通过包括PTX-敏感的Gi/o蛋白和阻断K2+内流通道的CB2受体依赖性和非依赖性机制.     

2型糖尿病大鼠逼尿肌收缩功能改变的实验研究

[目的]研究2型糖尿病膀胱逼尿肌收缩功能的改变和M3受体表达的变化。[方法]建立2型糖尿病大鼠模型,在糖尿病病程第16周,应用离体膀胱灌注方法观察逼尿肌收缩功能的变化;RT-PCR和Western blotting方法观察逼尿肌M3受体mRNA表达的变化。[结果]2型糖尿病组逼尿肌收缩功能低于正常对照组,2型糖尿病两组大鼠膀胱内压为(17.61±3.62)cmH2O/100mg,正常对照组为(24.57±4.20)cmH2O/100mg;2型糖尿病组逼尿肌M3受体mRNA和蛋白的表达均高于正常对照组,分别为63.53%±3.54%和39.37%±3.70%,43.53%±1.59%和25.39%±1.40%。[结论]2型糖尿病大鼠逼尿肌M3受体的生物合成是上调的,但是逼尿肌的收缩功能却降低,可能是M3受体功能方面存在着一定的障碍。     

CB_1 Cannabinoid Receptor-Dependent and-Independent Inhibition of Depolarization-Induced Calcium Influx in Oligodendrocytes

Ca2＋稳态平衡的调节在少突胶质细胞功能和存活中起重要作用。大麻素CB2和CB2受体在许多细胞中调节Ca2＋水平和/或K＋电流。本文利用培养的少突胶质细胞中,通过增高细胞外K＋浓度（50mM诱导膜去极化,研究大麻素复合物在此过程引发钙内流中的作用。CB2受体激动剂ACEA导致去极化诱导的少突胶质细胞胞浆的Ca2＋瞬变表达浓度依赖性抑制,最大效应为（94±3）％,半效应浓度（EC50）为（1．3±0．03）μM。这种作用可被CB2／CB2激动剂CP55、940、内源性大麻素类AEA和2-AG所模拟,但是CB2受体选择性激动剂JWH133没有作用。CB2受体拮抗剂AM251（1μM）也可减少细胞外高K＋诱导的Ca2＋反应,但不能防止ACEA（3μM）诱发的抑制效应。然而,ACEA和AEA减少去极化诱导的Ca2＋瞬变的能力在CB2受体敲除小鼠和经百日咳毒素预处理的少突胶质细胞中明显降低。内流性K＋通道阻断剂BaCl2（300μM）和CsCl2（1mM）降低电压诱导的Ca2＋内流并部分阻断ACEA的抑制效应。本文表明,大麻素抑制少突胶质细胞中去极化诱导的Ca2＋瞬变是通过包括PTX-敏感的G1／0蛋白和阻断K＋内流通道的CB2受体依赖性和非依赖性机制。     

内皮素受体B对培养鼠肝星状细胞收缩功能的影响

目的观察内皮素受体B(ETB)激动后对培养鼠肝星状细胞收缩功能以及胞内钙(Ca2+)的影响。方法分离培养大鼠HSC,采用胶原晶格法观察ETA和ETB受体激动剂ET-1及选择性ETB受体协同剂IRI-1620对肝星状细胞收缩的影响。采用Fura-2/AM钙荧光指示剂测定HSC细胞内Ca2+浓度,并观察ETB对其影响。结果选择性内皮素B受体协同剂IRL-1620在1μmol/L浓度时即能明显抑制较低浓度的ET-1引起的肝星状细胞的收缩同时导致HSC细胞内Ca2+浓度的下降(P<0.05)。结论ETB被激动后可以抑制HSC的收缩,这种效应与ETB降低HSC细胞内Ca2+浓度有关。     

Na+/H+交换器-1抑制诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的可能机制

背景肺动脉平滑肌细胞( pulmonary artery smooth muscle cells,PASMC)的增殖在缺氧肺动脉高压肺血管重构中起重要作用.解放军第三军医大学附属新桥医院全军呼吸研究所在前期实验中通过构建 Na+ /H+交换器- 1( sodium/proton exchanger isoform-1, Na+ /H+ exchanger isoform-1, Na+ /H+ antiporter isoform-1, NHE-1)特异性核酶基因逆转录病毒载体,转染入体外培养的大鼠 PASMC内表达,发现 NHE-1抑制可诱导细胞内酸化而抑制 PASMC增殖,并促进其凋亡.但这种促凋亡作用是通过什么途径来完成,尚不清楚.目的探讨 Bcl-2、 Bax蛋白表达在 NHE-1抑制而诱导大鼠 PASMC凋亡中的作用.设计分组对照实验.地点和材料实验在解放军第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所完成.转染表达 NHE-1特异性核酶基因的体外培养大鼠 PASMC( PRZ细胞)、转染 PLXSN空载体的大鼠 PASMC( PX细胞)、未处理大鼠 PASMC细胞( PA细胞)为前期实验所制备.干预已构建 NHE-1特异性核酶基因逆转录病毒载体,转染入体外培养的大鼠 PASMC内表达,同时转染 pLXSN空载体入另一组大鼠 PASMC内,后者与未转染的大鼠 PASMC细胞为对照组.用荧光指示剂( Fura-2/AM)测定法检测转染 NHE-1特异性核酶基因的大鼠 PASMC内 Ca2+( [Ca2+ ]i)变化; RT-PCR方法检测细胞内 Bcl-2和 Bax mRNA表达变化,免疫组化法检测细胞内 Bcl-2和 Bax蛋白表达变化.主要观察指标①转染 NHE-1特异性核酶基因的大鼠 PASMC内 Ca2+( [Ca2+ ]i)变化.②细胞内 Bcl-2和 Bax mRNA表达变化.③细胞内 Bcl-2和 Bax蛋白表达变化.结果转染 NHE-1特异性核酶基因后,大鼠 PASMC内 [Ca2+ ]i显著升高,细胞内 [Ca2+ ]i在 PA细胞 [(95.94± 6.39) nmol/L]与 PX细胞 [(98.08± 7.37) nmol/L]之间差异无显著性意义( P 》0.05),而 PRZ细胞 [(198.08± 16.59) nmol/L]显著高于 PA细胞及 PX细胞 , 差异有显著性意义( P《 0.001).Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著降低( PA细胞、 PX细胞、 PRZ细胞的平均积分光密度分别为 2.21± 0.18, 2.09± 0.30, 1.45± 0.20), Bax mRNA和蛋白表达显著增加( PA细胞、 PX细胞、 PRZ细胞的 ABax/Aβ-actin分别为 0.17± 0.02, 0.23± 0.06, 0.59± 0.08).结论 NHE-1抑制诱导的 PASMC凋亡与 [Ca2+ ]i增加、 Bcl-2表达降低及 Bax表达增加有关.     

Chlorpromazine at comparatively low concentrations potentiates carbachol-induced tonic contraction of ileal longitudinal smooth muscle of the guinea-pig

The neuroleptic phenothiazine derivative chlorpromazine (CPZ) at high concentration (1 x 10(-5) M) decreased either the phasic or tonic contraction in response to carbachol and the carbachol-induced increase in [Ca2+]i in both phases in ileal muscle. In contrast, CPZ at low concentrations (8 x 10(-7) - 5 x 10(-6) M) decreased only the phasic contraction and potentiated the tonic contraction induced by carbachol. However, CPZ at these concentrations dose-dependently decreased the carbachol-induced increase in [Ca2+]i in both phases. These results suggested that CPZ dose-dependently decreased the initial phasic contraction in response to carbachol by inhibition of Ca2+ release from the intracellular storage sites. CPZ at low concentrations appears to increase Ca2+ sensitivity to contractile proteins in the carbachol-induced tonic phase. CPZ dose-dependently reduced the 60 mM K(+)-induced phasic and tonic responses and a concomitant decrease in [Ca2+]i in ileal muscle.     

alpha1-adrenergic receptor activation of c-fos expression in transfected rat-1 fibroblasts: role of Ca2+.

alpha1-Adrenergic receptors mediate mitogenic responses and increase intracellular free Ca2+ ([Ca2+]i) in vascular smooth muscle cells. Induction of c-fos is a critical early event in cell growth; expression of this gene is regulated by a number of signaling pathways including Ca2+. We wondered whether Ca2+ signaling plays a critical role in the induction of c-fos gene by alpha1-adrenergic receptors. Using stably transfected rat-1 fibroblasts, we confirmed that PE induced c-fos mRNA expression in a time- and dose-dependent manner, and also increased [Ca2+]i (measured with Fura-2 AM). These responses were blocked by the alpha1-adrenergic receptor antagonist doxazosin. Both intracellular Ca2+ chelation (using BAPTA/AM) and extracellular Ca2+ depletion (using EGTA) significantly inhibited PE-induced c-fos expression by alpha1A and alpha1B receptors. Brief (1-min) stimulation of alpha1A and alpha1B receptors with PE did not maximally induce c-fos expression, suggesting that a sustained increase in [Ca2+]i due to Ca2+ influx is required. The calmodulin (CaM) antagonists, R24571, W7, and trifluoperazine, but not the CaM-dependent protein kinases inhibitor KN-62, significantly inhibited c-fos induction by alpha1A and alpha1B receptors. Neither inhibition of protein kinase C nor inhibition of adenylyl cyclase modified c-fos induction by PE. These results suggest that alpha1-adrenergic receptor-induced c-fos expression in rat-1 cells is dependent on a Ca2+/CaM-associated pathway.     

电磁脉冲对海马神经元的损伤及其对[Ca2+]i的影响

背景:电磁脉冲照射可影响实验大鼠的学习记忆功能,并造成大鼠海马组织损伤和超微结构改变。目的:观察电磁脉冲对离体培养的海马神经元的损伤效应及其对[Ca2 ]i的影响,以深入分析电磁脉冲致脑损伤的可能机制。设计:随机对照动物实验。单位:承德医学院病理教研室。材料:Wistar乳鼠若干只,雌雄各半。电磁脉冲辐射源:高场强电磁脉冲模拟源。方法:实验于2004-03/12分别在军事医学科学院和承德医学院完成。Wistar乳鼠若干只,麻醉下断头取脑,分离海马组织,调整细胞悬液浓度至5×108L-1接种。分组:①培养细胞分为对照组和照射组,于照射后即刻(0h)收集细胞进行形态学观察和胞内游离钙离子浓度测定;②另培养细胞分为对照组和照射后0h组和12h组,进行细胞凋亡和坏死率的测定。(培养细胞用量:每项检查每组1个培养瓶,重复3次。)电磁脉冲辐射条件为6×104V/m,脉冲上升时间为20ns,脉宽为30μs,频率为2.5脉冲/min,作用2min。原代培养的海马神经元经电磁脉冲辐射后,倒置相差显微镜下观察照射前后神经元形态学变化;FACS法检测细胞凋亡和坏死;Fluo-3-AM荧光探针负载、激光共聚焦显微镜扫描测定神经元胞内游离钙离子浓度[Ca2 ]i。主要观察指标:神经元形态学变化;细胞凋亡率和坏死率;胞内游离钙离子浓度[Ca2 ]i。结果:①电磁脉冲辐射后即刻,神经细胞逐渐发生液化,神经元突起回缩、变性。②电磁脉冲辐射后12h凋亡率较辐射后即刻有所恢复,但与对照组相比均显著增加[(59.27±1.27)%,(72.17±6.21)%,(17.45±5.63)%,P<0.05]。③在辐射后即刻和12h坏死率比对照组升高,但差异无统计学意义[(13.71±2.31)%,(11.96±1.04)%,(8.45±0.67)%,P>0.05]。④电磁脉冲辐射后即刻[Ca2 ]i荧光强度显著高于对照组(107.34±26.14,54.93±16.08,P<0.05)。结论:电磁脉冲致海马神经元形态学损伤、坏死与凋亡率增加,神经元内的Ca2 荧光强度明显增加。     

不同浓度离子作用于颈动脉小体对血压的影响

背景:颈动脉窦存在压力感受器,是离子对血压调节最敏感的部位,在血压的调节中起到重要的作用,但不同离子通过颈动脉窦对血压的调节作用还不十分清楚。目的:观察用不同浓度、不同离子浸泡颈动脉窦后血压的变化。设计:自身对照实验。单位:解放军第四军医大学基础部教学实验中心。材料:实验于2000-12/2001-06在解放军第四军医大学基础部教学实验中心机能实验室完成。选取纯种新西兰兔18只,实验动物标准为二级,雌雄不限,体质量(2.0±0.2)kg,由解放军第四军医大学动物实验中心提供。方法:采用随机数字表法将白兔分为Na 组、K 组和Ca2 组,每组6只。将家兔麻醉后,气管插管,分离两侧颈动脉,一侧分离出颈动脉窦,另一侧进行血管插管并记录血压,用加液枪于颈动脉窦外分别由低浓度到高浓度滴加Na 、K 和Ca2 溶液,将颈动脉窦完全浸泡;记录每次加液前血压的基础值和加液后血压变化的峰值。主要观察指标:家兔颈动脉血压的基础值和加液后血压变化的峰值。结果:0.15,1.5mol/L的高浓度Na 加液后血压为(97±12),(83±17)mmHg,与基础值(106±14),(105±12)mmHg比较有显著的降血压作用(t=2.946,P<0.05);0.4mol/L的高浓度K 有显著的降血压作用[(106±12),(64±13)mmHg,(t=13.496,P<0.01)],其他浓度的K 降血压作用不明显(P>0.05);0.07mol/L的低浓度Ca2 加液后血压为(113±16)mmHg,与基础值(103±12)mmHg比较有显著的升血压作用(t=-3.627,P<0.01)。结论:Na 、K 和Ca2 可以通过直接作用于颈动脉窦调节血压。高浓度的Na 、K 具有降压作用,低浓度的Ca2 具有升压作用,这可能是血压调节的一种重要机制。     

促肾上腺皮质激素释放激素对下丘脑神经元胞浆内环磷酸腺苷和Ca2+浓度的调节作用

背景:在应激反应中,下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的激活对下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素表达的增加起着关键的作用。然而关于通过何种途径调控下丘脑神经元表达促肾上腺皮质激素释放激素的神经内分泌活性,促肾上腺皮质激素释放激素能否激活下丘脑神经元,尚不十分清楚。目的:通过外源性促肾上腺皮质激素释放激素刺激培养下丘脑神经元,以观察细胞内环磷酸腺苷和胞浆内钙离子浓度的变化。设计:观察对比实验。单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所,首都医科大学附属天坛医院神经外科。材料:实验于1999-12/2002-03在解放军第三军医大学大坪医院完成。取孕17d胎鼠下丘脑分散培养下丘脑神经元。方法:用外源性促肾上腺皮质激素释放激素刺激培养下丘脑神经元,促肾上腺皮质激素释放激素1受体特异性拮抗剂CP-154526预先处理下丘脑神经元。将培养的细胞分组:①促肾上腺皮质激素释放激素(10-12,10-10,10-8,10-6mol/L)刺激组。②预先用CP-154526(500μmol/L)处理再用促肾上腺皮质激素释放激素(10-12,10-10,10-8,10-6mol/L)刺激组。③分别设置相应的正常对照组,正常对照组用等渗盐水刺激。用PTI荧光成像系统测量和分析外源性促肾上腺皮质激素释放激素对培养下丘脑神经元胞浆内游离钙浓度变化,用放射免疫方法测定神经元内环磷酸腺苷含量。主要观察指标:①下丘脑神经元胞浆内游离钙浓度。②下丘脑神经元内环磷酸腺苷含量。结果:正常对照组的下丘脑神经元胞浆内游离钙浓度和环磷酸腺苷含量较低,外源性促肾上腺皮质激素释放激素刺激后,胞浆内游离钙浓度立即升高,神经元胞浆内环磷酸腺苷生成明显增加[(240±22),(153±11)nmol/L;(3.26±0.19),(0.44±0.02)pmol/dish,P<0.01];CP-154526可明显抑制促肾上腺皮质激素释放激素(10-6mol/L)刺激的下丘脑神经元胞浆内游离钙浓度和环磷酸腺苷含量的生成[钙离子浓度:(240±22),(171±16)nmol/L;环磷酸腺苷含量:(3.26±0.19),(2.33±0.21)pmol/dish,P<0.01]。结论:促肾上腺皮质激素释放激素可通过与其1受体结合直接作用于下丘脑神经元,使神经元胞浆内游离钙浓度和环磷酸腺苷含量明显增加,在调节下丘脑神经元激活过程中下丘脑合成和分泌的促肾上腺皮质激素释放激素可能起了重要作用。     

Fat-storing cells as liver-specific pericytes. Spatial dynamics of agonist-stimulated intracellular calcium transients.

Liver perisinusoidal fat-storing cells (FSC) show morphological and ultrastructural characteristics similar to pericytes regulating local blood flow in other organs. In the present study we have analyzed whether FSC respond to local vasoconstrictors such as thrombin, angiotensin-II, and endothelin-1 with an increase in intracellular free calcium concentration ([Ca2+]i) coupled with effective cell contraction. All agonists tested induced a rapid and dose-dependent increase in [Ca2+]i followed by a sustained phase lasting several minutes in confluent monolayers of Fura-2-loaded human FSC. Pharmacological studies performed using different Ca2+ channel blockers indicated that, at least for thrombin and angiotensin-II, the sustained phase is due to the opening of voltage-sensitive membrane Ca2+ channels. To analyze the temporal and spatial dynamics of Ca2+ release in response to these agonists, we performed experiments on individual Fura-2-loaded human FSC using a dual wavelength, radiometric video imaging system. The rise in [Ca2+]i was exclusively localized to the cytoplasm, particularly in the branching processes. Increases in [Ca2+]i more than four-fold were associated with a simultaneous and transient reduction of cell area indicating reversible cell contraction. Our results indicate that the Ca(2+)-dependent contraction of human FSC in vitro may reflect a potential role in regulating sinusoidal blood flow in vivo.     

不同浓度尿酸对体外培养人脐静脉血管内皮细胞增殖过程的影响

背景:近年对尿酸特别是其与心血管疾病的研究较多,但多集中在流行病学领域,从细胞学角度探讨尿酸对内皮细胞影响的研究并不多见。目的:观察不同浓度的尿酸对体外培养的人脐静脉内皮细胞株(ECV304)丙二醛,一氧化氮及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐的影响。设计:以人脐静脉内皮细胞为观察对象,随机对照实验。单位:解放军第四军医大学西京医院内分泌科。材料:脐静脉内皮细胞株ECV304由解放军第四军医大学免疫教研室提供;DMEM低糖培养基,美国Gibco公司生产;胎牛血清,北京元亨圣马生物技术研究所生产;胰蛋白酶,美国Gibco公司生产;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,华美公司生产;二甲基亚砜(DM-SO),分析纯,天津博迪化工有限公司生产;尿酸,Sigma公司生产。一氧化氮测试盒,丙二醛测试盒,南京建成公司生产。普通倒置显微镜、酶联免疫检测仪IX70型倒置显微镜,日本Olympus生产;酶联免疫检测仪,华东电子管厂生产。方法:实验于2003-12/2004-04在第四军医大学内分泌科和烧伤科进行。内皮细胞的复苏、培养、传代、接种均参考司徒镇强等主编的《细胞培养》中的方法进行。用无血清DMEM培养24h使细胞同步化于G0/G1期,分4组实验,分别为对照组,低浓度尿酸组,中浓度尿酸组和高浓度尿酸组,每组分为24h,48h和72h3个时间点,每个时间点8个样本。对照组,低浓度尿酸组,中浓度尿酸组和高浓度尿酸组分别加入含有0mmol/L,0.1mmol/L,0.2mmol/L,0.4mmol/L尿酸的5%的血清培养液,然后将培养板放入37℃,体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育。在24h后检测丙二醛,一氧化氮及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,48h及72h分别再检测3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐。主要观察指标:各组人脐静脉内皮细胞增殖情况及一氧化氮和丙二醛的含量。结果:随尿酸浓度增高,ECV304产生丙二醛的含量逐渐下降,分别为(2.97±0.05),(2.89±0.09),(2.78±0.10),(2.44±0.03)μmol/L。ECV304产生一氧化氮的量分别为(6.86±1.41),(12.5±2.7),(18.9±1.8),(21.1±1.4)μmol/L,ECV304产生一氧化氮的量和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐吸光度逐渐增加,细胞增殖以48h增加最为明显。结论:尿酸有抗氧化性,可促进血管内皮细胞的增殖及一氧化氮的释放。     

Phospholipase C activation by Na+/Ca2+ exchange is essential for monensin-induced Ca2+ influx and arachidonic acid release in FRTL-5 thyroid cells.

BACKGROUND: Monensin, a Na+ ionophore, can increase cytosolic Ca2+ ([Ca2+]i) by reversing the Na+/Ca2+ exchange mechanism. This study provided additional insights into the mechanism of this Na+ ionophore-induced increase in [Ca2+]i, and emphasized the critical role of phospholipase C (PLC) in amplifying Na+/Ca2+ exchange-induced Ca2+ influx and subsequent arachidonic acid (AA) release in FRTL-5 thyroid cells. The possible involvement of protein kinase C (PKC), mitogen-activated protein kinase (MAPK), and GTP-binding (G) protein in mediating monensin-induced AA release was also explored. METHODS: FRTL-5 thyroid cells were maintained in Coon's modified Ham's F-12 medium supplemented with a 6-hormone (6H) mixture. Cytosolic Ca2+ was measured by using indo-1 AM and a dual-wave-length spectrofluorometer. Release of 3H-labeled inositol trisphosphates and arachidonic acid were determined by a scintillation counter. RESULTS: In Hank's balanced salt solution with Ca2+ (HBSS+), monensin (100 mumol/L) induced a 2.3-fold sustained Ca2+ increase associated with IP3 generation and a 6-fold increase in AA release. Deletion of extracellular Ca2+, or replacement of Na+ by choline chloride in the medium, reduced the [Ca2+]i increase by 77% and completely prevented the monensin-induced rise in AA release. Similar inhibitory effects were observed in cells pretreated with a Na+ channel blocker, or Na+/Ca2+ exchange inhibitors. In HBSS without Ca2+ (HBSS-), monensin induced a 1-fold transient [Ca2+]i increase but did not increase the AA. This Ca2+ increase was not suppressed by U-73122, a PLC inhibitor. In HBSS+, U-73122 did not affect the monensin-induced initial transient peak increase of [Ca2+]i, but reduced the sustained second phase of [Ca2+]i from 400 nmol/L to 250 nmol/L, and completely blocked AA release. A phospholipase A2 (PLA2) inhibitor blocked the monensin-induced AA release without affecting the [Ca2+]i increase. Inhibition of PKC prevented 87% to 94% of the monesin-stimulated AA release. The monensin-induced AA release was also inhibited 94% by pertussis and 51% by a MAP kinase cascade inhibitor. CONCLUSIONS: The results suggest that monensin initiates an increase in [Ca2+]i via a Na+/Ca2+ exchange mechanism that triggers more pronounced and sustained [Ca2+]i increase via activation of PLC and Ca2+ influx. The PLC activation, followed by sustained Ca2+ influx and PKC activation, is a prerequisite for PLA2-mediated processes in monensin-challenged FRTL-5 thyroid cells.