随机引物PCR检测人DNA指纹条件的优化

[目的]探讨随机引物PCR检测人DNA指纹技术的最优化条件。[方法]应用随机引物PCR技术，用一对经筛选的短引物，对扩增人DNA指纹的条件进行了优化。[结果]实验结果显示：DNA模板应新鲜，质量浓度在50－550mg/L1均有扩增产物，dNTP的浓度0.2mmol/L最宜。Mg^2 浓度5.0mmol/L效果最佳。循环参数以两个三步PCR，变性温度分别用94℃、90℃，时间各为30s，退火温度用43℃、48℃，时间分别为40s、50s，延伸温度为72℃，时间分别为1min、1min20s。[结论]按照优化的实验条件，得出的DNA指纹图重复性好，个体特异性高，为APHDF的推广提供了实验基础。     

两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化

【目的】建立适合两面针简单重复序列—聚合酶链反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序。【方法】采用改良的高盐低pH法提取两面针基因组DNA,通过单因素试验和正交试验相结合对ISSR反应体系中的主要成分(Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板)进行筛选和优化,并考察退火温度对扩增结果的影响。【结果】最佳的PCR反应体系为:总体积为25μL,含1.50 mmol/L Mg2+、150μmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶、0.60μmol/L引物、2.40 ng/μL DNA模板。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,51.4℃退火45 s,72℃延伸2 min;35个循环;72℃再延伸10 min。【结论】优化了两面针ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为两面针ISSR遗传多样性分析打下基础。     

红景天属植物DALP反应体系的建立

目的 利用直接扩增片段长度多态(DALP)这一新分子标记技术建立一套稳定的红景天属植物的DALP反应体系。方法 以红景天基因组DNA为模板,对DALP反应程序的一些重要参数进行摸索和优化试验。结果 建立了一套稳定性强、可靠性高的DALP应用反应体系;经过大量重复性实验,反应体系为20μL,Mg2 浓度为2.5 mmol/L,dNTPs浓度为1.25 mmol/L,模板DNA的量为60 ng,5 pmol/L选择性引物1μL,5 pmol/L反向引物3 μL,引物浓度比为1:3,Taq酶2 U。反应过程为:95℃预变性5 min、94℃变性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min;30个循环,再72℃延伸10 min,完成整个PCR反应。结论 该体系可有效地应用于红景天属药材的分类鉴定和地道性鉴定。     

香加皮ISSR—PCR条件体系的优化

采用正交设计法、均匀设计法,对影响香加皮IssR—PCR43体系的引物、Mg2＋、dNTP、TaqDNA聚合酶浓度进行优化,通过两种方法的比较建立了适合香加皮ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,含Mg2＋1mmol／L、dNTP0．15mmol／L、引物1．0μmol／L、TaqDNA聚合酶1U、buffer2．5μL和模板DNA约50ng。在此基础上对扩增程序中的退火温度进行筛选,通过比较将退火温度定为50℃,最终扩增程序定为：94℃预变性4min接着进行40个循环：94℃变性30S,50~C退火1min,72℃2延伸90s;循环结束后72℃延伸10min。     

人源细粒棘球蚴的RAPD分析体系建立

目的建立PCR—RAPD反应体系，提升细粒棘球蚴随机扩增多态性DNA（RAPD）遗传多态性研究的稳定性，为研究细粒棘球蚴的分类学以及包虫病的分子流行病学奠定基础。方法采用改进的酚-氯仿抽提法提取细粒棘球蚴基因组DNA，用单因素筛选方法建立PCR—RAPD分析体系。结果采用改进的酚／氯仿抽提方法提取细粒棘球蚴基因组DNA质量高，适用于PCR—RAPD扩增分析；在25μL体系中，RAPD—PCR扩增反应各成分的最佳浓度为：dNTP0．2—0．3mmol／L、Taq酶2．5U、随机引物0．8—1．4μmol／L，模板为60ng。PCR扩增最佳条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s、32℃退火45s、72℃延伸1min、共35个循环；最后72℃延伸10min；初步从20条引物中筛选出11条带型丰富的随机引物。结论酚-氯仿适用于提取细粒棘球蚴基因组DNA，优化的RAPD反应体系和筛选出的随机引物适合进行细粒棘球蚴RAPD遗传多态性分析。     

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2＋浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2＋浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

白芷ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的:建立白芷的ISSR最佳反应体系及PCR扩增参数,为今后利用ISSR标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序.方法:以白芷基因组DNA为模板,分析了ISSR反应体系中模板DNA、Mg2 、dNTPs、引物浓度,TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响.结果:建立了重复性好,分辨率高的ISSR反应体系,即在25μL反应体系中,模板DNA浓度为10～30 ng,2.5μ10×PCR buffer(Mg2 free),MgCl2 2.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.6 pμmol/L;扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,引物在筛选后的最佳退火温度退火45 s,72℃延伸2min,共计39个循环,循环结束后在72℃延伸5 min.结论:建立了适用于白芷的ISSR反应体系.为今后利用ISSR标记技术开展白芷遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础.     

PCR扩增肺癌组织puma基因第四外显子的实验研究

目的探讨PCR扩增肺癌组织中puma基因第四外显子（GC含量76．44％）的最适实验条件．方法通过改变PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,探讨PCR反应体系最适浓度和反应条件．结果PCR反应体系为dNTP200μmol／L,普通MgCl2 1．0mmol／L,引物500nmol／L,TaqDNA聚合酶0．1U／μL,模板量不低于4000ng,普通10×扩增体系缓冲液5μL,总体积50μL.反应条件为94℃预变性5min,94℃ 45s、61℃ 45s、72℃ 45s循环33次,最后72℃延伸5min．结论确立了puma基因第四外显子的PCR扩增条件,为后续的突变研究奠定了基础．     

RAPD的建立及优化研究

目的：建立优化的RAPD反应条件,为进一步进行遗传监控研究奠定基础。方法：按常规方法制备小鼠基因组DNA,在一定的RAPD－PCR反应条件下分别改变各组份浓度及退火温度。扩增产物在含溴化乙锭的1．5％琼脂糖凝胶中电泳,紫外透射仪上观察照相。结果：当Mg^2 浓度为1．5mmol/L,4种dNTPs各为150μmol/L,Taq酶为1．5U,引物为0．2mol/L,模板DNA为50ng,退火温度为38℃,RAPD－PCR扩增效果好。结论：在优化的条件下规范操作,RAPD的稳定性、重复性好。     

黄花蒿ISSR-PCR反应体系的优化

目的:建立黄花蒿(Artemisia annuaL.)的ISSR最佳反应体系及PCR扩增参数,为今后利用ISSR标记技术开展黄花蒿种间遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法:以黄花蒿DNA为材料,分析了ISSR反应体系中的DNA、Mg2 、dNTPs浓度,TaqDNA聚合酶用量以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果:建立了重复性好,分辨率高的ISSR反应体系,即在25μL反应体系中,模板DNA浓度为15~45 ng,2.5μL的10倍Buffer(Mg2 free)缓冲液,MgCl22.0 mmol/L,dNTPs为0.15 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物1.0μmol/L;扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,引物在筛选后的最佳退火温度退火45 s,72℃延伸2 min,共计40个循环,循环结束后在72℃延伸5 min。结论:建立了适用于黄花蒿的ISSR反应体系,为今后利用ISSR标记技术开展黄花蒿种间遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础。     

蠕形螨ISSR-PCR的反应体系优化及引物筛选

目的以蠕形螨的DNA为模板,对蠕形螨简单重复序列锚定PCR(ISSR-PCR)反应体系优化并对ISSR引物进行筛选,为ISSR分析奠定基础。方法用自然沉降法收集山羊蠕形螨,用基因组DNA提取试剂盒提取山羊蠕形螨DNA,并以此为模板,以(CA)8RG(R为1分子的嘧啶)为引物,利用正交实验法,从Mg2+浓度、引物用量、dNTPs、DNA模板用量和TaqDNA聚合酶以及退火温度对蠕形螨ISSR-PCR反应体系进行优化,并以优化的反应体系筛选ISSR-PCR的引物。结果 ISSR-PCR 25μL最佳反应体系包括:0.4 mmol/L Mg2+、30 pmol引物、30～60 ng模板DNA、2u Taq酶,最佳退火温度为49℃、循环35次。筛选出10条条带清晰、多态性好、重复性高的引物。结论筛选出蠕形螨ISSR-PCR最佳反应体系和理想的引物,为蠕形螨的分子生物学研究奠定了基础。     

药用植物诃子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化药用植物诃子的ISSR-PCR反应体系.方法 以诃子叶片为实验材料,采用CTAB法提取诃子DNA为模板,通过单因素和双因素实验,研究诃子ISSR-PCR反应体系中DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs等的用量,以及退火温度对扩增结果的影响.结果 建立了适合诃子ISSR分析的反应体系...     

医源性低钠血症对慢性心力衰竭的预后价值

目的探讨慢性心力衰竭患者医源性低钠血症的预后价值。方法对2004年1月至2009年12月我院心内科入院资料完整的慢性心力衰竭患者进行回顾性分析,除外入院即刻血清钠离子浓度135mmol/L的患者,共786例,根据入院24h、48h血清钠离子浓度最低值分为三组:A组Na+≥135mmol/L;B组Na+120～135mmol/L;C组≤120mmol/L。比较各组心功能、血清钾离子浓度、住院病死率等指标。结果住院期间存活714例,死亡72例,存活组与死亡组血清钠离子浓度分别为(134.00±5.83)mmol/L和(121.00±7.15)mmol/L,差异有统计学意义(P0.01),而血清钾离子浓度分别为(4.4±0.6)mmol/L和(4.3±0.8)mmol/L,没有统计学差异(P0.05)。三组住院病死率分别为:A组7.8%(36/461),B组8.0%(23/289),C组36.1%(13/36),C组分别与A组和B组比较,均有统计学差异(P0.01)。结论医源性低钠血症是慢性心力衰竭患者预后不良的重要危险因素之一,应采取积极措施避免其发生。     

半巢式PCR检测FOXC2基因多态性实验条件研究

目的:研究半巢式PCR方法检测FOXC2基因5’非翻译区C-512T多态性的实验条件。方法:对实验研究中的主要影响因素设置各系列浓度和梯度,进行PCR反应后观察电泳结果,选取最适条件。结果:最适温度为58℃,最适Mg2+浓度为3.0mmol/L,最适dNTP浓度为2.5mmol/L。最适扩增循环为第一次扩增35个循环,第二次扩增30个循环。结论:摸索最适实验条件是进行批量实验的前提和关键。     

去甲二氢愈创木酸抑制骨肉瘤Mg63细胞生长的研究

【目的】 探讨去甲二氢愈创木酸对骨肉瘤细胞Mg63的生长抑制作用及其机制. 【方法】 应用四甲基偶氮唑蓝(MTT法)和克隆形成法测定去甲二氢愈创木酸对Mg63细胞的生长抑制作用,检测其抑制骨肉瘤细胞生长的时间效应和剂量效应;用流式细胞技术进行细胞周期分析;用Western blot法检测药物对Mg63细胞mTORC1信号通路活性的影响.【结果】 去甲二氢愈创木酸对Mg63细胞具有明显的生长抑制作用,且呈时间依赖和剂量依赖关系,72 h IC50值为(48 ± 2)μmol/L?10?20?50 μmol/L可显著抑制Mg63克隆形成数量,且随剂量增加抑制作用明显增强?细胞周期阻滞于G0/ G1 期,mTORC1信号通路蛋白p-S6和p-4E-BP1与对照组相比明显下调. 【结论】 去甲二氢愈创木酸明显抑制骨肉瘤细胞mg63增殖,诱导细胞周期阻滞于G0/ G1 期,这一作用可能是通过对mTORC1信号通路的抑制完成.     

硫化氢抑制骨肉瘤U2OS细胞的体外生长

【目的】 探讨硫化氢单独及与顺铂联用对骨肉瘤细胞生长的影响及其可能机制?【方法】 分别用0.2?0.4?0.6?0.8?1.0?2.0?3.0?4.0?5.0 mmol/L NaHS(硫化氢载体)单独或与20 mg/L顺铂共同作用骨肉瘤U2OS细胞24 h,CCK-8比色法法检测细胞存活率;分别用0.4及1.0 mmol/L NaHS作用骨肉瘤U2OS细胞24 h,1.0 mmol/L NaHS单独或与20 mg/L顺铂联用作用骨肉瘤U2OS细胞24 h,细胞单克隆形成法检测各组单克隆数;1.0 mmol/L NaHS与20 mg/L顺铂共同作用骨肉瘤U2OS细胞24 h,Western-Blot法检测Bcl-2?Bax?NFκB蛋白的表达?【结果】硫化氢对U2OS细胞生长的影响:0.2?0.4?0.6?0.8 mmol/L NaHS作用U2OS细胞24 h,细胞存活率与对照组比较,差异无统计学意义(P > 0.05); 1?2?3?4?5 mmol/L NaHS作用U2OS细胞24 h,细胞存活率分别为(90.01 ± 7.49)%?(88.00 ± 4.12)%?(87.26 ± 4.05)%?(85.40 ± 4.39)%和(82.99 ± 4.65)%,与对照组比较,能不同程度抑制U2OS细胞的生长(P 0.05)?NaHS与顺铂联用对骨肉瘤细胞的影响:分别用0.8?1?2?3?4?5 mmol/L NaHS联合20 mg/L顺铂共同作用U2OS细胞24 h,细胞存活率分别为(54.13 ± 4.03)%?(54.09 ± 1.13)%?(50.37 ± 4.56)%?(41.44 ± 3.95)%?(40.00 ± 4.34)%和(36.35 ± 3.90)%,与单用顺铂组(59.76 ± 3.15%)比较,存活率下降(P < 0.05)?NaHS+顺铂组细胞单克隆数为231.00 ± 13.52,与顺铂组(285.67 ± 11.59)比较,细胞单克隆数下降(P < 0.01); NaHS+顺铂组NFκB蛋白表达及Bcl-2/Bax蛋白表达比值较顺铂组下降?【结论】 1 mmol/L浓度以上的NaHS能抑制骨肉瘤细胞的生长,0.8 mol/L浓度以上的NaHS通过减少NFκB入核,增加细胞的凋亡,从而增强顺铂对骨肉瘤细胞的抑制作用?     

PCR-RFLP技术检测SUMO4基因163A/G多态性的实验条件研究

目的确定PCR-RFLP技术检测小泛素样修饰蛋白4（SUMO4）163A/G多态性的最适实验条件.方法对影响SUMO4基因PCR反应的主要因素设定系列浓度梯度分别进行研究.结果最适变性温度为94℃;最适退火温度为55℃;最适引物浓度为0.25μmol/L;最适Mg2＋浓度为1.5mmol/L;最适dNTP浓度为0.25mmol/L;以2.5U为最适Taq酶量;酶切体系为31μL体系中加10μL产物用10U的酶消化.结论最佳实验条件的摸索是进行糖尿病实验研究的关键.     

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)动力学方法的初步研究

目的 建立一种简便、快捷、准确的GAPD的检测方法,为以后的临床推广奠定基础.方法 以三乙醇胺作为缓冲液(PH为7.4),1,3-二磷酸甘油酸为底物,偶联3-磷酸甘油酸激酶,还原型辅酶Ⅰ(NADH)被氧化成氧化型辅酶Ⅰ (NAD+),在波长340nm处检测吸光度的变化值,在一定范围内,吸光度的下降与GAPD的活性成正...