日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达

目的　构建日本血吸虫 14kDa脂肪酸结合蛋白 (Sj14FABP)和细胞因子IL 12共表达质粒 ,并观察其能否在小鼠体内获得表达。方法　TRIzol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA ,采用RT PCR方法逆转录Sj14FABP编码基因序列 ,经过双酶切后定向克隆到载体pVIVO2 IL12中 ,通过PCR、酶切及测序进行鉴定。大量制备重组质粒 pVIVO2 IL12 Sj14FABP并免疫BALB/c小鼠 ,取注射部位肌肉组织进行间接免疫荧光试验。结果　RT PCR扩增出一条大小为 4 4 0bp的片段 ;经PCR、酶切及测序鉴定表明所构建的重组质粒中含有Sj14FABP基因 ;间接免疫荧光试验结果为阳性。 结论　本试验成功构建重组质粒 pVIVO2 IL12 Sj14FABP ,并在小鼠体内获得表达。     

日本血吸虫DNA多价疫苗pVIVO_2SjFABP-23的构建及其保护性免疫

目的构建日本血吸虫多价DNA疫苗pVIVO2SjFABP-23,并观察其在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用。方法根据Sj FABP和Sj23的基因序列合成两对特异性引物,利用重组PCR技术将日本血吸虫Sj FABP和Sj23的基因片段进行拼接,得到融合基因SjFABP-23,再将该片段重组于p GEM-T载体中,进行PCR扩增及DNA序列测定。然后经双酶切将目的片段SjFABP-23克隆到pVIVO2的一个多克隆位点上转化E.coliGT 110获得重组质粒pVIVO2SjFABP-23,免疫小鼠进行免疫保护性实验。结果PCR扩增出一条大小约为1.1Kb的目的片段。免疫小鼠获得52.14%减虫率(P<0.01)和60.93%的减卵率(P<0.01),且均高于单价疫苗pVIVO2Sj23(P<0.05)。结论PCR成功扩增SjFABP-23的基因片段,血吸虫DNA多价疫苗pVI-VO2SjFABP-23构建成功,该疫苗在小鼠抗血吸虫感染中具有比单价疫苗pVIVO2Sj23更好的免疫保护作用。     

白细胞介素-12在日本血吸虫脂肪酸结合蛋白诱导小鼠保护性免疫力中的佐剂作用

目的 研究白细胞介素-12（IL-12）对日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（Sj14FABP）DNA疫苗的免疫增强效果。方法　 分别构建pVIVO2-Sj14FABP 和pVIVO2-IL12-Sj14FABP疫苗，鉴定构建成功后免疫小鼠。48只雄性BALB/c小鼠随机分为A、B、C和D等4组, 分别用0.9% NaCl（对照组）、pVIVO2、pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj14FABP肌注免疫1次（100 μg/只）。免疫后30 d各组小鼠感染40±2条尾蚴, 感染后45 d剖杀, 计数成虫及肝内虫卵；同时用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体水平，用双夹心ELISA法检测脾淋巴细胞经伴刀豆球蛋白A（ConA）和可溶性虫卵抗原（SEA）刺激后培养上清中白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）含量。 结果 经PCR和酶切鉴定，成功构建pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj14FABP重组质粒；C、D组免疫后分别获得24.1%和39.4%的减虫率、27.2%和32.8%的减卵率；细胞因子检测结果，D组经ConA和SEA诱生的IL-2和IFN-γ水平显著增高（P　<　0.01），而IL-4水平显著降低，差异有统计学意义（P　<　0.01）；免疫后30 　d小鼠血清IgG水平无明显升高，各实验组间差异也无统计学意义(P　>0.05)。 结论 Sj14FABP DNA疫苗可诱导BALB/c小鼠产生部分抗血吸虫感染保护作用, 细胞因子IL-12能够诱导机体免疫反应向Th1型优势分化，并增强血吸虫病DNA疫苗免疫保护性效果。     

日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的初步研究

目的了解日本血吸虫促凋亡基因Sj BAD的生物学、免疫学和转录表达特征,评估Sj BAD重组蛋白作为日本血吸虫病疫苗候选分子的潜力。方法根据Sj BAD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增Sj BAD基因,构建重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD。采用实时定量PCR检测Sj BAD基因在日本血吸虫不同发育期及42 d雌、雄虫体内的转录水平;应用Western blotting和间接ELISA法分析Sj BAD重组蛋白的抗原性和免疫原性。用重组抗原Sj BAD免疫BALB/c小鼠,通过计算减虫率及肝脏减卵率,评估重组抗原作为血吸虫病候选疫苗分子的潜力。结果成功克隆了日本血吸虫Sj BAD基因,构建了重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD,并在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白分子量约为22 k Da。Western blotting表明Sj BAD具有较好的抗原性和免疫原性,间接ELISA法检测表明重组蛋白免疫小鼠产生了高水平的特异性抗体Ig G。实时定量PCR检测发现Sj BAD基因在日本血吸虫的各个发育阶段均有转录,以14 d表达量最高,且在雄虫体内的表达量高于雌虫。两次动物免疫试验表明,重组蛋白Sj BAD在BALB/c小鼠体内诱导了30.82%和27.87%的减虫率,及42.52%和45.84%的肝脏虫卵减少率,均显著高于PBS对照组(P均0.05)。结论成功克隆、表达了日本血吸虫促凋亡相关基因Sj BAD,该基因在日本血吸虫不同发育期虫体内均有表达。纯化的重组Sj BAD蛋白在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因;将该基因克隆至原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj32并转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为42ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获Sj26GST和Sj32抗原编码基因;采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因;将融合基因克隆至原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32并转化大肠埃希菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1 991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pQE30中,SDS-PAGE显示表达产物为分子质量单位约为61 ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的18%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj32)疫苗构建及鉴定

目的 构建和鉴定日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)pGEX-Sj32疫苗.方法 从重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所构建的重组大肠埃希菌BL21 (pET28α-Sj32)中抽提质粒pET28α-Sj32,通过PCR扩增Sj32抗原编码基因;将Sj32基因定向克隆至大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj32,将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞(DE3),抽提质粒后进行双酶切鉴定;采用电穿孔法,将重组质粒pGEX-Sj32转化至Bb,构建Bb(pGEX-Sj32)疫苗,再从该疫苗中抽提重组质粒pGEX-Sj32,以其为模板进行PCR鉴定.结果 从抽提质粒pET28α-Sj32中PCR扩增出长度约为1 270 bp的Sj32基因片段;重组质粒pGEX-Sj32经双酶切鉴定,获得长度为4 947 bp的载体片段和长度为1 270 bp的Sj32基因片段;以抽提的疫苗质粒pGEX-Sj32为模板进行PCR扩增,得到了长度约为1 270 bp的Sj32基因片段,与预期结果相符.结论 成功构建了日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗.     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的原核表达

目的 进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因,将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1,转化感受态BL21/DE3菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆,IPTG诱导pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌,用SDS-PAGE和Wester-blot分析表达产物。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌经IPTG诱导可表达与GST融合的蛋白（约40kDa）,抗GST抗体能特异性识别该蛋白。结论 成功原核表达了Sj16蛋白,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下了基础。     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶重组质粒的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)重组质粒pET32α-Sj26GST,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建pET32α-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot 对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET32α(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为49×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了pET32α-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

日本血吸虫DNA疫苗proVAX/GMCSF-SjFer的构建及免疫保护性效果的观察

目的 构建日本血吸虫铁蛋白proVAX/GMCSF-SjFer DNA疫苗,观察其诱导小鼠产生抗攻击感染的免疫保护性效果. 方法 小量制备pGMC/SjFer重组质粒DNA,PCR扩增GMCSF-SjFer基因,将此目的 片段亚克隆到真核表达载体proVAX中,构建重组真核表达质粒proVAX/ GMCSF-SjFer.雌性昆明鼠随机分为对照组、免疫组和空质粒组.空质粒组小鼠股四头肌注射proVAX,免疫组同法注射重组质粒proVAX/GMCSF-SjFer,对照组注射生理盐水.按0、2、6周设计接种3次.末次接种后第2周,感染血吸虫尾蚴(40±2)条/鼠.感染后第42 d剖杀小鼠,灌注法冲虫,计数虫荷和克肝卵数.免疫前和免疫后2周留取小鼠血清,用ELISA法检测抗血吸虫成虫抗体水平. 结果 经PCR和双酶切鉴定,获得1条约为960 bp的目的 片段和2条酶切片段.免疫组小鼠的减虫率及减卵率分别为22.46%和29.40%,空质粒对照组分别为3.11%和7.79%,差异有统计学意义(P<0.05).ELISA检测免疫组小鼠血清特异性IgG抗体水平增高. 结论 构建的DNA疫苗proVAX/GMCSF-SjFer能诱导小鼠产生一定水平的保护性免疫.     

日本血吸虫新基因Sj Dad1的DNA免疫动物保护性实验研究

目的　观察日本血吸虫未知基因SjDad1的DNA免疫保护动物实验效果 ,探讨其作为疫苗候选分子的可能性。方法　构建SjDad1的真核表达载体 pEGFP -N3 -SjDad1,两次质粒DNA免疫BALB/c小鼠后给予小鼠日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,设置生理盐水对照组 (NS)和pEGFP -N3 对照组 ,攻击感染后 4 2天处死小鼠 ,计算减虫率和减卵率。结果　双酶切和PCR反应以及测序结果证实重组真核表达载体 pEGFP -N3 -SjDad1构建成功 ,DNA免疫动物的保护实验证明 pEGFP -N3 -SjDad1与生理盐水组相比对小鼠没有显著的减虫作用 (P >0 0 5 ) ,减卵效果具有显著性意义 (P <0 0 1) ,减卵率是6 5 74 %。结论　日本血吸虫 pEGFP -N3 -SjDad1有抗血吸虫生殖作用 ,具有疫苗研究开发价值。     

日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的为了进一步研究日本血吸虫(中国大陆株)Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识.方法根据曼氏血吸虫Sm1 6基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pcDNA3,转化感受态DH5a菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆.以重组pcDNA3-Sj16质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列,应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较.结果从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3-Sj16;Sj16基因开放读码框有354碱基,编码¨7氨基酸,N端18个氨基酸可能为信号肽序列;Sj16与Sm16有高度同源性,只存在一个氨基酸的差异.结论成功克隆了Sj16基因的真核表达载体,并测定、分析了Sj16基因序列,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础.     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因,克隆至大肠埃希菌原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹法对表达产物进行分析和鉴定.结果 基因拼接法扩增出长度约1991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约69×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的25%;Western印迹法鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.

Abstract：

Objective To construct and express the recombinant plasmid pET28α-Sj26GST-Sj32 of Schistosoma japonicum(Sj) in Escherichia coli BL21 (DE3). Methods Total RNA was extracted from Sj adult worms by ultrasound-breaking, Sj26GST and Sj32 antigen gene was respectively amplified by RT-PCR from the total RNA; Sj26GST-Sj32 fusion gene obtained with gene splicing by overlap extension(SOEing) was cloned into prokaryotic expression plasmid pET28α and transformed into Escherichia coli BL2 (DE3) to construct pET28α-Sj26GST-Sj32;BL21 (pET28α-Sj26GST-Sj32) was induced with isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), and the expressed products were analyzed and identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis (SDS-PAGE)and Western blotting. Results The 1991 bp Sj26GST-Sj32 fusion gene was successfully amplified by gene SOEing and cloned into pET28α by restriction analysis and PCR identification, the recombinant plasmid pET28α-Sj26GST-Sj32 was successfully constructed; the relative molecular mass of the expressed recombinant protein was approximately 69 × 103 by SDS-PAGE, and the amount of the expressed protein was 25% of the total bacterial proteins; the fusion protein could be recognized by sera from rabbits infected with Sj by Western blotting.Conclusions The recombinant plasmid pET28α-Sj26GST-Sj32 is successfully constructed and highly expressed in Escherichia coli in fused form with His-tag, and the expressed fusion protein shows specific antigenicity.     

血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗的研究

目的 构建日本血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗pIRES-Sj97-Sj14-Sj26,并研究其免疫原性及免疫保护作用。 方法 构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（Sj14）、谷胱甘肽-S-转移酶（Sj26）和副肌球蛋白（Sj97）的跨膜共表达质粒pIRES?鄄Sj97-Sj14-Sj26,转染HeLa细胞。通过RT?鄄PCR法检测Sj14、Sj26和Sj97 mRNA的表达,免疫荧光（IFA）检测Sj14、Sj26和Sj97蛋白的表达。用纯化的该质粒免疫BALB／c小鼠（100 μg/只）,设生理盐水和空载体对照组,20只/组,每隔2周加强免疫1次,共免疫3次。末次免疫2周后,每组取10只小鼠,眼球取血并断颈处死,取脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞。分别检测免疫小鼠血清中总IgG抗体及脾淋巴细胞培养上清干扰素-γ（IFN-γ）水平,淋巴细胞刺激指数（SI）及 NO释放量,并分析脾淋巴细胞亚群。各组中余下小鼠每只经腹部感染40±1条尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫数及肝卵数,计算减虫率和减卵率。结果 构建的质粒可在体外表达。疫苗组、生理盐水组和空白质粒组血清总IgG抗体含量分别为（5.62±0.64）、 （1.22±0.20）及（1.48±0.36） mg/ml,疫苗组与各对照组差异均具有统计学意义（P<0.01, P<0.05）。疫苗组、生理盐水组和空白质粒组小鼠腹腔巨噬细胞NO含量分别为（321.19±18.03）、 （184.12±11.05）及（213.51±15.93） nmol/ml,疫苗组与生理盐水组间差异有统计学意义（P<0.05）。疫苗组、生理盐水组、空白质粒组小鼠脾淋巴细胞刺激指数分别为（2.25±0.29）、（1.18±0.07）及（1.22±0.09）,疫苗组显著升高（P<0.01）。疫苗组INF-γ水平与各对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.01）;CD4+和CD8+T细胞百分比明显升高。疫苗组减虫率和肝减卵率分别为39.9％和43.94％。 结论 pIRES-Sj97-Sj14-Sj26疫苗具有较强的免疫原性,可对日本血吸虫感染的小鼠产生一定保护作用。     

日本血吸虫Sj23DNA突变体疫苗的构建与鉴定

目的对日本血吸虫Sj23DNA进行缺失突变,构建Sj23DNA突变体疫苗,为寻求更佳免疫效果的疫苗奠定基础。方法利用重叠PCR技术将Sj23DNA上与ME491同源的部分碱基缺失,获得Sj23DNA的突变体,将其克隆入真核表达载体pcDNA3的多克隆位点上,构建重组质粒pcD-NA3-Sj23突变体,进行酶切和测序鉴定,并用CLUSTALX和primerpremier软件将测序的结果与Sj23DNA序列进行分析。结果序列分析显示pcDNA3-Sj23突变体缺失序列与原设计一致,双酶切pcDNA3-Sj23突变体获得预期大小的DNA片段。结论成功构建了缺失与ME491同源部分碱基的质粒pcDNA3-Sj23突变体。