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1.
目的克隆转录因子Oct-4基因、构建原核表达载体。方法从人胚胎标本中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Oct-4基因的cDNA,再通过基因重组技术将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,纯化后SDS-PAGE分析表达产物。结果电泳证实RT-PCR扩增产物与预期长度一致,测序结果与GenBank公布的Oct-4基因序列一致较好,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量47KD左右出现目的蛋白表达条带。结论成功构建了pET-Oct-4原核表达载体,表达并纯化出Oct-4蛋白,为进一步研究Oct-4蛋白打下了实验基础。 相似文献
2.
目的 扩增人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4(desmoglein 4,Dsg4)胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4的核酸序列,为寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris, PV)发病机制的研究提供依据.方法 根据GenBank中的Dsg4序列(登录号为AY177664)分析,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人正常皮肤组织中抽提RNA,逆转录合成cDNA,聚合酶链反应(PCR)扩增皮肤组织桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4目的基因;应用基因重组技术将目的基因分别与质粒pET32a在T4 DNA连接酶作用下相连接,转化E.coli DH5α感受态细菌,用含氨苄青霉素的LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子DNA序列测定鉴定;重组融合蛋白经ELISA法与PV患者、正常对照组血清进行反应.结果 RT-PCR扩增产物经凝胶电泳得到均约为350 bp的4条条带;质粒载体pET32a连接的目的基因经序列测定后与在GenBank登录的Dsg4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4核酸序列完全一致,4个Dsg4胞外区域cDNA读码框架正确;Dsg4 EC1、EC2、EC3和EC4与患者血清反应,而不与正常对照组血清反应.结论 Dsg4胞外区域多肽片断在PV发病中可能有作用. 相似文献
3.
目的 克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体.方法 设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3 cDNA.经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3.结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白.结论 获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础. 相似文献
4.
目的:采用RT-PCR法获取TIMP-4基因,并通过原核表达获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法:从SD大鼠心肌组织中提取总RNA,利用RT-PCR法扩增出TIMP-4基因,经基因序列分析后构建表达载体PET-28a(+)-TIMP-4,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TIMP-4的表达。利用N2+-NTA纯化和复性后,根据其骨肉瘤细胞迁移能力的影响检测其活性。结果:克隆到编码序列完全正确的大鼠TIMP-4基因,能在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物占全菌总蛋白的23.5%,N2+-NTA纯化和复性后,纯度达90%以上。纯化后的融合蛋白使骨肉瘤细胞株的迁移能力得到显著抑制。结论:通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。 相似文献
5.
目的: 克隆人Bcl-w基因并原核表达Bcl-w融合蛋白。方法: 提取人胃癌组织总RNA;采用RT-PCR方法扩增Bcl-w基因编码区,构建重组质粒pet28a/Bcl-w,转化大肠埃希菌ROS,测序鉴定后经增菌培养,30℃诱导6 h表达Bcl-w蛋白,免疫印迹法鉴定主要以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白。结果: 从人胃癌组织中扩增得到Bcl-w基因,其编码区长582 bp,编码193个氨基酸,与基因库中发表的序列同源性100%;成功构建了原核表达载体pet28a/Bcl-w,并在工程菌ROS中获得大量表达。结论: 获得了人Bcl-w基因,成功制备出人Bcl-w融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献
6.
目的 从纯化鼻咽组织全基因组表达谱数据中筛选出鼻咽癌发病相关的候选靶基因桥粒芯糖蛋白3(DSG3),利用半定量逆转录(sqRT)-PCR进一步研究DSG3基因在纯化鼻咽部组织中反义RNA(aRNA)中的表达。方法采用RNA保护技术保存组织标本(22例鼻咽癌患者及12例鼻咽部正常或存在炎性黏膜上及组织者),显微切割获得鼻咽癌组织标本中的癌细胞、鼻咽部非癌组织标本中的黏膜上皮细胞,提取每一例纯化组织标本RNA,线性扩增获得足量aRNA,通过sqRT-PCR进一步研究候选靶基因DSG3在两种不同鼻咽纯化细胞aRNA中的表达。结果在纯化鼻咽癌组织和鼻咽部非癌组织全基因组表达谱中,DSG3基因表达值分别为2、06±1、60和0.48±0.23,表达相差4.24倍,两组比较差异有统计学意义(df=16,t=2.145,P=0.048)。sqRT-PCR检测纯化鼻咽癌组织及非癌组织aRNA中DSG3基因的表达,分别为3.54±2.69和0.95±0.23,两组差异亦有统计学的意义(df=32,t=3.307,P=0.002)。结论 利用全基因组芯片构建基因表达谱结合sqRT-PCR等实验研究,可筛选出与鼻咽癌发病相关的候选靶基因,DSG3基因高表达是鼻咽癌发生发展过程中的再要促瘤因素。 相似文献
7.
人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化 总被引:4,自引:0,他引:4
目的:克隆人热休克蛋白72(HSP72)基因,原核表达并纯化蛋白产物,以探讨其生物学功能。方法:从热休克的人肝癌细胞株SMMC-7721中,用RT-PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中,在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和SephacrylS200凝胶过滤纯化,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,用anti-HSP72单抗作探针,进行Western blot鉴定。结果:克隆的基因序列分析结果与有关报道一致,所构建的pQTE-30HSP72载体 大肠杆菌中表达出与预大小相符的Mr为72000的蛋白,经鉴定确系HSP72蛋白。结论:克隆了人HSP72基因,并对该基因进行了原核表达与纯化,为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础。 相似文献
8.
目的 :克隆牛蛙核糖核酸酶 (RC RNase)基因 ,构建重组原核表达载体 ,利用大肠杆菌系统表达RC RNase蛋白。 方法 :采用RT PCR的方法从牛蛙肝脏中克隆RC RNase基因 ,并进行序列测定 ;将RC RNase基因插入到 6×His表达载体 pRSET A中 ,构建成表达质粒pRSET RC RNase ,用异丙基巯基半乳糖 (IPTG)在大肠杆菌BL2 1(DE3)中诱导表达 ,并以免疫印迹法对表达蛋白进行鉴定。 结果 :扩增出一条约 380bp的基因片段 ,双酶切鉴定和序列测定的数据与预期结果一致。经IPTG诱导 ,融合蛋白 (His) 6 RC RNase在大肠杆菌中得到成功表达 ,SDS PAGE上出现相对分子质量约为 16 0 0 0的一条新生蛋白带 ,经蛋白印迹验证为表达蛋白。薄层扫描显示 ,表达产物占菌体总蛋白的 12 .5 % ,主要以包涵体形式存在。 结论 :正确克隆出RC RNase基因 ,并在大肠杆菌中得到成功诱导表达 ,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了基础。 相似文献
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人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达 总被引:3,自引:2,他引:3
目的:克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因,构建重组表达载体并对其诱导表达.方法:通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因,克隆于载体pGEM—T easy,测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2,测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导4h后可表达M,约56000的融合蛋白GST—HMGl.结果:克隆了人HMG—1的编码基因,构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl,表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测,占全菌总蛋白的0.23.结论:获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物,对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义. 相似文献
10.
目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础. 相似文献
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目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coliBl21(Gold)中,诱导表达survivin蛋白。通过DEAESepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Westernblotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coliBl21(Gold)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上。Westernblotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。 相似文献
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CUI Yu-bao CAI Hong-xing LI Li ZHOU Ying GAO Cui-xiang SHI Wei-hong YU Ming 《中华医学杂志(英文版)》2009,122(21):2657-2661
Background The dust mites, which are mostly represented by Dermatophagoides spp. (Acari: Pyroglyphidae), are the major sources of indoor allergens. Identification and characterization of these mite allergen molecules are an important step in the development of new effective diagnostic procedures and possible therapeutic strategies for allergic disorders associated with dust mites. Methods Total RNA was extracted from Dermatophagoides farinae. The gene coding for Der f 3 was amplified by RT-PCR with the primers designed based on previous sequence published in GenBank. The target gene was cloned intermediately into pMD19-T plasmid and finally into plasmid pET28a (+), expressed in E. coil BL21 at the aid of the inducer isopropyI-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The physicochemical properties, spatial structure of the allergen were analyzed with bioinformatics software. Results The cDNA coding for group 3 allergen of Dermatophagoides farinae from China was cloned and expressed successfully. Sequencing analysis showed that there were nineteen mismatched nucleotides in five Der f3 cDNA clones in comparison with the reference (GenBank Accession No. AY283291), which resulted in deduced amino acid sequence incompatibility in eleven residues. Bioinformatics analysis revealed that the Der f 3 pro-protein was an extracellular hydrophobic protein, consisting of 259 amino acids with a 16 amino acid signal peptide. The protein was deduced to have three chymotrypsin active sites (53-68 AA, 108-122 AA and 205-217 AA), one N-glycosylation site, one cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site, four protein kinase C phosphorylation sites, two casein kinase II phosphorylation sites, and five N-myristoylation sites. Conclusions Der f3 is an extracellular hydrophobic protein which possesses multiple activation and phosphorylation sites. Polymorphism may exist in the Der f3 gene but this needs to be further confirmed in the future. 相似文献
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颗粒酶B的表达纯化和鉴定 总被引:2,自引:1,他引:1
目的:克隆颗粒酶B(GraB),构建GraB的原核表达载体,从而建立其原核表达体系,获得高效表达的重组GraB。方法:抽提人外周血淋巴细胞总RNA,进行RT-PCR克隆GraB cDNA,构建GraB原核表达载体,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定;异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。表达产物亲和层析纯化并用免疫印迹法鉴定,以GraB底物测定其活性。结果:表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中,具有良好的抗原性和特异性,并能作用于GraB特异性底物。结论:建立了GraB原核表达系统。 相似文献
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利用基因重组技术构建了人干扰素α8(IFN-α8)高表达菌株E.coliXLl-Blue/pBm,经酶切鉴定、DNA测序、SDS-PAGE、Westernblotting及生物活性测定等分析,表明能特异性地表达具有生物活性的IFN-α8,表达量达到总菌体蛋白的23%,经复性后比活为4.8×107IU/mg,具有良好的应用前景。 相似文献
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人单核细胞趋化蛋白1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引:2,自引:1,他引:1
目的:克隆表达具有重要生物功能的人单核细胞核细胞趋化蛋白1(huMCP-1)。方法:从人外周血单核细胞(PBMC)中提取poly(A)^+RNA,用RT-PCR法扩增出huMCP-1cDNA。将huMCP-1cDNA插入融合表达载体pGEXIN,1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得高效表达。结果:Western blot证明与huMCP-1单克隆抗体有明显交叉反应。结论 相似文献
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目的克隆小鼠白细胞介素-35(IL-35)基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b(+),并转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b(+)-IL-35在BL21(DE3)中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。 相似文献
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19.
Cloningandhigh-levelexpressionofhumaninterferonalpha-8inE.coliZhangPingwu(张平武);WangYilun(王易伦);LuDeru(陆德如);LiYuyang(李育阳)(Insti... 相似文献
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幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性.方法 用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21 (DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21 /UreI.不同温度条件下用1.0 mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer 4分析重组蛋白的表达,并用Western blotting对其免疫原性进行分析.结果 克隆到约650 bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%.工程菌BL21 /UreI含完整的ureI基因.在37℃、1.0 mmo1/LIPTG诱导14 h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%.分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性.结论 成功构建了Hp ureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础. 相似文献