重组空肠弯曲菌蛋白疫苗免疫 BA LB／c小鼠的研究

目的探讨重组空肠弯曲菌rLTB-PEB1蛋白疫苗的免疫机制。方法经口服免疫 BALB/c 小鼠后，ELISA 法检测特异性抗体IgG 、IgA 水平；ELISPOT 法检测派伊尔结特异性抗体分泌细胞；实时荧光定量PCR 检测IFN-γ、IL-4 mRNA 表达的差异。计算疫苗保护率。结果免疫组小鼠派伊尔结特异性抗体、IFN-γ、IL-4 mRNA 水平明显增高（ P ＜0．05）。免疫组的疫苗保护率为89．3％～93．7％，可维持30周。结论重组空肠弯曲菌rLTB-PEB1蛋白疫苗口服免疫小鼠可有效预防空肠弯曲菌的感染，其免疫机制可能为诱导了TH1/TH2型免疫应答。     

空肠弯曲菌粘附蛋白PEB1原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】克隆、表达空肠弯曲菌表面蛋白PEB1,并制备针对该蛋白的多克隆抗体。【方法】采用PCR方法从空肠弯曲菌Penner19标准株基因组中扩增出PEB1蛋白基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后,再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHTb中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的PEB1蛋白,并经Western-blotting证实。然后,在非变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化目的蛋白。用纯化的PEB1蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。【结果】在非变性条件下用Ni2＋-NTA亲和色谱柱纯化PEB1融合蛋白,纯化获得的蛋白纯度大于90%。用该融合蛋白免疫小鼠后,得到抗PEB1抗体,效价达1：2×105。【结论】成功构建了空肠弯曲菌PEB1基因原核表达载体,并获得了高纯度的PEB1蛋白及其高效价多抗,对进一步制备肠粘膜高亲和力的过敏原重组BCG打下了坚实的基础。     

表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫原性

目的:研究表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对结核分枝杆菌(MTB)感染小鼠的保护能力.方法:以100 μg重组质粒pcDNA-e6c10接种BALB/c小鼠腓前肌,共免疫3次. 末次免疫结束2 wk后,检测免疫小鼠特异性抗体滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤效应以及诱导IFN-γ和IL-2水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠以1×105 MTB毒株H37Rv经尾静脉进行攻击,4 wk后计数脾脏细菌负荷数,观察免疫小鼠对MTB抵抗作用.结果:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 800. 淋巴细胞刺激增殖指数为2.42±0.13,显著高于生理盐水对照组;免疫小鼠诱导IFN-γ含量(2449±12)ng/L与卡介苗(BCG)组无明显差异,IL-2含量(198±16)ng/L不及BCG免疫组,但显著高于生理盐水对照组;同时融合蛋白诱导的CTL杀伤率为42%. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,DNA疫苗免疫的BALB/c小鼠对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有较明显抵抗作用(细菌负荷4.51±0.23,P＜0.05),但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷无明显减少.结论:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗能在结核病预防中有一定免疫治疗作用.     

Epstein-Barr病毒LMP1 DNA免疫小鼠免疫效果的测定

[目的]探讨EBV-LMP1重组体DNA免疫小鼠后的免疫效果.[方法]将已构建的EBVLMP1基因(EBVLMP1)重组质粒pcDNA3-BLMP1肌肉注射免疫Balb/c小鼠,在免疫后的不同时间分别用ELISA、流式细胞仪及LDH法检测免疫小鼠体内特异性EBVLMP1抗体滴度、CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群的数量变化以及EBVLMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性.用pcDNA3质粒及PBS作为阴性对照及空白对照.[结果]重组质粒免疫Balb/c小鼠后,可在外周血液血清中检测到特异性的EBVLMP1抗体;其脾细胞中CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群数量明显高于阴性对照及空白对照,且可检测到EBVLMP1特异性的CTL存在.以上结果在免疫16周之内无明显改变.[结论]EBV-LMP1质粒重组体可刺激小鼠产生特异性的体液和细胞免疫,并且可维持一定的时间,具有较好的免疫原性,是一种有效、制备方便的EBV候选疫苗.     

Epstein—Barr病毒LMP1 DNA免疫小鼠免疫效果的测定

目的：探讨EBV－LMP1重组体DNA免疫小鼠后的免疫效果。方法：将已构建的EBV LMP1基因（EBV LMP1）重组质粒pcDNA3－BLMP1肌肉注射免疫Balb/c小鼠,在免疫后的不同时间分别用ELISA、流式细胞仪及LDH法检测免疫小鼠体内特异性EBV LMP1抗体滴度、CD4^ /CD8^ T淋巴 细胞亚群的数量变化以及EBV LMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。用pcDNA3质粒及PBS作为阴性对照及空白对照。结果：重组质粒免疫Balb/c小鼠后,可在外周血液血清中检测到特异性的EBV LMP1抗体;其脾细胞中CD4^ /CD8^ T淋巴细胞亚群数量明显高于阴性对照及空白对照,且可检测到EBV LMP1特异性的CTL存在。以上结果在免疫16周之内无明显改变。结论：EBV－LMP1质粒重组体可刺激小鼠产生特异性的体液和细胞免疫,并且可维持一定的时间,具有较好的免疫原性,是一种有效、制备方便的EBV候选疫苗。     

柯萨奇病毒A16粘膜疫苗的制备及其免疫效果研究

目的利用同源重组技术将柯萨奇病毒A16型(Coxsachievirus A16,CA16)VP1基因重组入枯草芽孢杆菌基因组,进而将VP1蛋白展示在芽孢表面制备CA16粘膜疫苗。将疫苗滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清中VP1特异性抗体滴度,体外中和实验检测抗体的保护作用。方法将枯草芽孢杆菌CotB基因与VP1基因连接后插入整合质粒pDG1662得到重组质粒pDG1662-CotB-VP1,电转化法将线性化重组质粒转化枯草芽孢杆菌1A771,抗生素抗性筛选,PCR、Western-Blot、免疫荧光鉴定VP1基因重组及蛋白表达情况。将该疫苗滴鼻免疫小鼠,ELISA法检测血清抗体滴度,体外中和实验分析该抗血清的中和活性。结果 VP1基因成功重组入枯草芽孢杆菌基因组中并将蛋白展示在芽孢表面。该疫苗免疫小鼠后有效的诱导了小鼠体液免疫反应,并且该抗血清在体外中和实验中表现了较好的中和活性。结论 CA16 VP1蛋白展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面制备的疫苗能刺激小鼠产生具有保护作用的中和抗体,为研制CA16粘膜疫苗奠定了基础。     

空肠弯曲菌口服全菌佐剂疫苗的初步研究

目的本研究采用明胶为空肠弯曲菌菌苗的佐剂,灌胃免疫小鼠,评价佐剂全菌苗的免疫原性.方法采用明胶为佐剂的全菌疫苗灌胃免疫Balb/c小鼠.加明胶为佐剂全菌疫苗灌胃免疫Balb/c小鼠为实验组,全菌疫苗肌注和全菌疫苗灌胃免疫为实验对照组,PBS灌胃免疫为正常对照组,未作任何处理的Balb/c小鼠为阴性对照组;接种3次,间隔7d,末次接种1wk后收集小鼠血清和小肠粘液.采用ELISA间接法检测血清抗体IgG、IgA、IgM和肠道粘液抗体SIgA水平.结果各组血清抗体IgG、IgA、IgM和肠道粘液抗体SIgA水平,加佐剂组明显高于未加佐剂组,有统计学差异(P＜0.05),肌注组与加佐剂组间没有统计学差异(P＞0.05).结论本研究显示佐剂疫苗口服有良好的免疫原性,明胶可作为口服疫苗的候选佐剂.     

空肠弯曲菌外膜蛋白福氏佐剂疫苗免疫小鼠后的抗体应答

目的 探讨空肠弯曲菌甘氨酸提取物28～31 kd外膜蛋白福氏佐剂疫苗免疫小鼠后的抗体应答效果.方法 将30只BALB/c小鼠随机分为5组,每组6只,采用空肠弯曲菌甘氨酸提取物28～31 kd外膜蛋白以不同剂量疫苗组,分别在第0、7、14、21、28天,通过背部及腹部皮下多点注射免疫小鼠;空白组、对照组分别采用0.4 mL生理盐水(NS)、0.4 mL福氏完全佐剂.在末次免疫10 d(即第38天),分别应用双向免疫琼脂扩散试验法、试管凝集法检测血清特异性抗体效价, ELISA检测血清和肠液中的特异性IgG、IgA、.结果 末次免疫10 d后,各疫苗组中,双向免疫琼脂扩散试验法、试管凝集法检测血清特异性抗体效价分别达到1:4～1:16和1:320～1:1 280,ELISA法检测血清、肠液中IgG、IgA、的水平与空白组、对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);空白组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 空肠弯曲菌甘氨酸提取物28～31 kd外膜蛋白佐剂疫苗能够诱导BALB/c小鼠较好的体液免疫应答和高水平的肠液抗体,将为空肠弯曲菌亚单位疫苗的深入研究奠定重要的实验依据.     

融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠的免疫应答及其保护力

目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。结果融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6 400。淋巴细胞刺激增殖指数为2.8,明显高于生理盐水组(0.90);IFN-γ和IL-2的含量分别为2230±11 pg/mL和221±17 pg/mL,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时重组耻垢分枝杆菌诱导的脾细胞杀伤率为45%。结论融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,可作为结核新型疫苗使用。     

HIV-2 gp105重组疫苗联合免疫引起小鼠更强的免疫应答

目的：探讨应用prime-boost免疫策略进行HIV-2外膜蛋白重组鸡痘病毒与重组DNA疫苗联合免疫引起小鼠的免疫应答。方法：将HIV-2 gp105重组DNA疫苗与重组鸡痘病毒以prime-boost免疫策略,免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾CD4⁺、CD8⁺ T细胞亚群的数量、脾特异性CTL杀伤活性和血清抗 体滴度。结果：重组DNA疫苗和重组鸡痘病毒prime-boost免疫策略和两种疫苗单独免疫均刺激小鼠产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性及特异性抗体,联合免疫组特异性CTL杀伤活性及特异性抗体水平高于单独免疫组(P<0.05)。结论：以HIV-2 gp105重组DNA疫苗进行基础免疫、以HIV-2 gp105重组鸡痘病毒进行加强免疫的prime-boost免疫策略能诱导小鼠产生更强的特异性细胞和体液免疫应答。     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

T细胞疫苗诱导异种胰岛移植免疫耐受的实验研究

目的体外制备供体特异性T细胞疫苗（T cell vaccine）,探讨T细胞疫苗免疫（T cell vaccination）诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的作用。方法腹腔注射链脲佐菌素诱导建立Balb／c小鼠Ⅰ型糖尿病模型,用酶消化法和密度梯度离心法无菌分离纯化Wistar大鼠胰岛细胞。制备Balb／c小鼠针对Wistar大鼠的T细胞疫苗：实验随机分为三组,G1：糖尿病小鼠对照组;G2：胰岛细胞移植组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞移植＋1640培养液（对照组）;G3：胰岛细胞移植加T细胞疫苗免疫组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞＋T细胞疫苗（实验组）,于d1,d7,d14,d21实验组Balb／c小鼠接种TCV（1×107／mL）,对照组用1640替代。接种前和每次接种后第5d分别进行混合淋巴细胞反应。胰岛细胞移植：将Wistar大鼠的胰岛按1200。1500IEQ／kg经肝门静脉导入小鼠体内,移植后观测血糖和体重变化。结果异种胰岛细胞移植可以诱导I型糖尿病小鼠血糖降至正常水平且维持一段时间,对照组小鼠移植后（5．12±1．36）d即发生排斥,实验组移植物存活时间达（20．25±3．45）d。结论TCV能够有效延长异种胰岛移植物的存活时间,是一种潜在诱导异种胰岛移植免疫耐受的方法。     

内置式佐剂LTB对空肠弯曲菌重组蛋白疫苗免疫增强作用的研究

目的 构建空肠弯曲菌(CJ)外膜蛋白(PEB1)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其免疫原性.方法 应用重组PCR技术将PEB1和LTB序列连接,构建PEB1-LTB融合基因,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS- PAGE电泳表达,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.肌注方式免疫小鼠,末次免疫2周后,测定小鼠血清中IgG、IgA及黏膜冲洗液中sIgA抗体水平.结果 PCR扩增分别获得约787、372 bp产物,二者融合后获得一约1180 bp目的基因；该重组蛋白可具有良好的免疫原性,肌注小鼠后其血清IgG、IgA及黏膜冲洗液中sIgA含量均显著增高(P ＜0.01).结论 构建PEB1-LTB融合蛋白可有效增强小鼠免疫应答水平.     

空肠弯曲菌口服全菌佐剂疫苗研究

目的采用明胶为空肠弯曲菌死疫苗的佐剂,灌胃免疫小鼠,评价佐剂全菌死疫苗的免疫原性。方法采用空肠弯曲菌全菌死疫苗肌肉注射(A组),用明胶为佐剂全菌死疫苗(B组),全菌死疫苗(C组)及PBS(正常对照组)灌胃免疫Balb/c小鼠;接种3次,间隔7d,末次接种1周后收集小鼠血清和小肠粘液。采用ELISA间接法检测各组血清抗体IgGI、gAI、gM和肠道粘液抗体SIgA水平。结果A、B、C组血清抗体IgGI、gAI、gM和肠道粘液抗体SIgA水平均高于正常对照组,B组明显高于C组有统计学差异(P<0.05),A组与B组间没有统计学差异(P>0.05)。结论明胶作佐剂的全菌死疫苗口服具有良好的免疫原性,可作为口服疫苗佐剂后选。     

重组MUC1-MBP融合蛋白联合R848对小鼠T细胞免疫活性的诱导作用

目的：研究MUC1-MBP联合TLR7/8激动剂R848对小鼠T细胞免疫活性的诱导作用,为寻找重组MUC1-MBP融合蛋白的合适佐剂提供实验依据。方法：21只C57BL/6小鼠随机分为对照组（注射生理盐水）、MUC1-MBP+ R848组（注射MUC1-MBP+ R848）和MUC1-MBP+卡介苗（BCG）组（注射MUC1-MBP+ BCG）,每组7只。第2次免疫后第4~7天无菌取脾脏组织,测定脾指数;淋巴细胞增殖反应测定各组小鼠的刺激指数（SI）;ELISA法测定小鼠脾细胞培养上清中肿瘤坏死因子γ（TNF-γ）和 白细胞介素4（IL-4）水平;流式细胞术检测小鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群比例。结果：与对照组比较,MUC1-MBP+R848组和MUC1-MBP+BCG组小鼠脾指数均升高（P<0.01）,SI升高（P<0.05）,TNF-γ水平升高（P<0.05或P<0.01）;且MUC1-MBP+R848组小鼠上述指标高于MUC1-MBP+BCG组（P<0.05或P<0.01）;IL-4水平略微升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较,MUC1-MBP+ R848组和MUC1-MBP+ BCG小鼠脾细胞中CD3⁺细胞、CD4⁺细胞和CD8⁺细胞比例明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论：MUC1-MBP 融合蛋白联合R848或BCG均能诱导小鼠倾向于Th1的细胞免疫应答反应,R848是良好的MUC1-MBP候选佐剂分子。     

鼠抗沙眼衣原体Tarp蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗衣原体Tarp蛋白的单克隆抗体,为探讨Tarp蛋白的生物学特性及功能提供实验工具.方法 克隆表达沙眼衣原体血清型D重组Tarp融合蛋白,并以其为免疫原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行常规融合,应用间接免疫荧光法筛选阳性克隆和有限稀释克隆化,获得鼠抗沙眼衣原体血清型Dtarp蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA法鉴定单克隆抗体的抗Tarp特异性.并应用问接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的亚类和衣原体种属特异性.结果 成功克隆表达了重组GST-Tarp融合蛋白,其相对分子质量约为136 000;成功地建立了7株稳定分泌抗Tarp蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株;7株单克隆抗体均特异性的识别Tarp蛋白而不识别其他衣原体性蛋白;2株单克隆抗体(R586.2和R8G7.2)的免疫球蛋白亚类为IgG2a,其余5株单克隆抗体(R4D5,R2HI.2,R12812,R2H7和RSG8.1)的免疫球蛋白亚类均为IgG1;7株单克隆抗体全部特异性识别衣原体血清型A、D、L2,而不识别MoPn、6BC和AR39.结论 获得了特异性识别沙眼衣原体血清型Dtarp蛋白的单克隆抗体,为Tarp蛋白的结构及生物学功能研究莫定了基础.     

改良卵黄培养基培养空肠弯曲菌的生物学性状初步研究

目的探索改良弯曲菌卵黄培养基对空肠弯曲菌生长以及生物学性状的影响.方法采用改良布氏无血琼脂培养基以及改良弯曲菌蛋黄培养基在相同条件下培养空肠弯曲菌,观察其生长状况及生物学性状.结果改良弯曲菌卵黄培养基培养的空肠弯曲菌生长良好,性状典型.结论改良弯曲菌卵黄培养基可用于空肠弯曲菌的大量繁殖,可供疫苗生产候选.     

The Immunity Induced by Recombinant Spike Proteins of SARS Coronavirus in Balb/c Mice

The immune effect of two recombinant protein fragments of spike protein in severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS CoV) was investigated in Balb/c mice. Two partial spike gene fragments S1 (322-1464 bp) and S2 (2170-2814 bp) of SARS coronavirus were amplified by RT-PCR, and cloned into pET-23a prokaryotic expression vector, then transformed into competent Escherichia E.coli BL21 (DE3)(pLysS) respectively. Recombinant proteins were expressed and puri- fied by Ni2 immobilized metal ion affinity chromatography. The purified proteins mixed with com- plete Freund adjuvant were injected into Balb/c mice three times at a two-week interval. High titer antibody was detected in the serum of immunized Balb/c mice, and mice immunized with S1 protein produced high titer IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3, while those immunized with S2 protein produced high titer IgG1, IgG2a, but lower titer IgG2b and IgG3. Serum IFN-γ concentration was increased significantly but the concentrations of IL-2, IL-4 and IL-10 had no significant change. And a marked increase was observed in the number of spleen CD8 T cells. The results showed that recombinant proteins of SARS coronavirus spike protein induced hormonal and cellular immune response in Balb/c mice.