内毒素休克大鼠主动脉和心肌蛋白激酶C活性的变化

大肠杆菌内毒素在体外能激活完整红细胞蛋白激酶C.为探讨内毒素在体内对细胞信息传递过程的影响以及蛋白激酶C与休克时心血管功能障碍的关系,本研究观察内毒素休克时大鼠主动脉及心肌蛋白激酶C活性的变化. 实验用Wistar大鼠,由尾静脉注射大肠杆菌内毒素(16mg/kg)建立休克模型,对照组注射等量生理盐水.注射后4h断头取主动脉及心脏,将组织匀浆,经离心及DEAE纤维素柱层析分别提取细胞浆及细胞膜蛋白激酶C,并以组蛋白(Ⅲ-S型)为底物测定酶的活性.正常大鼠主动脉组织细胞浆蛋白激酶C     

脂多糖和同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白1 mRNA表达的影响

目的探讨脂多糖和同型半胱氨酸是否诱导培养的人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白1(MCP-1) mRNA及其机制.方法将生长至汇合的人脐静脉内皮细胞分为对照组、脂多糖组,脂多糖+SB203580组,同型半胱氨酸组,同型半胱氨酸+SB203580组,脂多糖+同型半胱氨酸组.采用斑点杂交和RT-PCR检测其MCP-1 mRNA的表达.用免疫细胞化学法检测对照组、脂多糖组和同型半胱氨酸组P38蛋白激酶蛋白的表达.结果培养的人脐静脉内皮细胞能表达较低水平的MCP-1 mRNA.斑点杂交和RT-PCR均显示各实验组的MCP-1 mRNA明显高于对照组.免疫细胞化学显示,P38蛋白激酶蛋白在对照组的细胞核阳性表达率为9.6%,当人脐静脉内皮细胞暴露于脂多糖或同型半胱氨酸后,细胞核阳性表达率升至46.7%或57.7%.结论脂多糖和同型半胱氨酸能诱导人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白1 mRNA,P38蛋白激酶可能参与了该过程.     

细菌脂多糖诱导THP1细胞丝裂原信号传导通路活化及细胞因子释放

丝裂原活化的蛋白激酶(ＭＡＰＫ)系列包括一蛋白激酶瀑布群,即癌基因ｐ21ｒａｓ和或蛋白激酶Ｃ(ＰＫＣ),ｒａｆ1蛋白激酶,丝裂原活化蛋白激酶的激酶1和2(ＭＥＫ)以及ＭＡＰＫ(也称细胞外信号调节的蛋白激酶ＥＲＫ)。细菌脂多糖是巨噬细胞的强力活化剂,能刺激巨噬细胞释放多种细胞因子和二十烷类免疫反应介质。已有报道,细菌内毒素脂多糖(ＬＰＳ)刺激ＭＡＰＫ磷酸化及活化并诱导肿瘤坏死因子(ＴＮＦα)和ＩＬ1β产生[1]。为明确ＬＰＳ及癌基因ｒａｓ和蛋白激酶ｒａｆ在调节丝裂原信号传导通路活性中的作用,更好了解ＬＰＳ激活单核巨噬细胞的…     

内毒素对人红细胞膜蛋白激酶C活性的影响(简报)

蛋白激酶C是细胞信息传递过程中的重要中间环节。本研究观察内毒素对正常成人新鲜红细胞膜蛋白激酶C活性的影响,以探讨内毒素的毒性作用是否通过蛋白激酶C介导。实验取压积红细胞,加入不同浓度的大肠杆菌内毒素,置37℃,温育45min后,悬于含2mmol/LEDTA、25mmol/L Tris/HCl、50mmol/L巯基乙醇的缓冲液(简称缓冲液B)中匀浆,离心(106000×g,4℃,60min)后取沉淀,加入含0.3％Triton X-100的缓冲液B,在4℃置60min,再离心(106000     

内毒素血症大鼠心肌和主动脉平滑肌蛋白激酶C活力的变化

大鼠注射内毒素后4及8h,心肌细胞细胞浆蛋白激酶C活力明显降低,其细胞膜蛋白激酶C活力显著增加;注射内毒素后0.5及4h,主动脉平滑肌细胞细胞浆蛋白激酶C活力明显低于对照组,而细胞膜蛋白激酶C活力显著增高。提示内毒素休克早期主动脉平滑肌细胞蛋白激酶C被激活,后期心肌细胞蛋白激酶C被激活。     

石上柏和蒲葵子对蛋白激酶C活性的影响

采用DE52柱层析法部分纯化大鼠中的蛋白激酶C，研究了石上柏和蒲葵子醇提物对蛋白激酶C活性的影响。为了证明测定系统的可靠性，观察了多粘菌素B（已知蛋白激酶C抑制剂）对蛋白激酶C活性的影响。表明：石上柏醇提物对蛋白激酶C有强烈的抑制作用，IC502．2μg／ml；100μg／ml的蒲葵子醇提物对蛋白激酶C的抑制率为66．6％，降低药物浓度抑制作用减弱；多粘菌素B对蛋白激酶C有抑制作用，IC5017．7U／ml。     

二甲双胍对脂多糖诱导的大鼠心肌细胞H9C2损伤的保护机制

目的：研究二甲双胍（metformin,Met）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的大鼠心肌细胞H9C2损伤的保护作用及机制。方法：心肌细胞H9C2按照不同处理方式分为对照组、LPS组及3种不同浓度Met与LPS联合培养组。培养24 h后采用MTT法测定各组细胞活力,流式细胞技术检测各组细胞凋亡和活性氧水平,蛋白质印迹法检测各组Caspase3、BCL2、BAX、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5′?monophosphate ?activated protein kinase,t?AMPK）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylated adenosine 5′?monophosphate ?activated protein kinase,p?AMPK）、Beclin1、Parkin的蛋白表达。结果：和LPS单独处理组相比,Met与LPS联合培养降低了LPS诱导的细胞活力增强和细胞凋亡增多,降低了BCL2、BAX蛋白表达,Caspase3表达未降低;p?AMPK、Beclin1、Parkin蛋白表达增加,细胞活性氧水平降低。结论：Met可能通过活化AMPK途径,增加细胞自噬、减少活性氧产生,减轻脂多糖对细胞的损伤,保护心肌细胞。     

蛋白激酶C激活调控Bcl-2与缺血诱导神经元凋亡关系的研究

目的：探讨蛋白激酶C激活参与神经元凋亡的可能机理。方法：采用大鼠全脑缺血模型,观察脑缺血／再灌流后蛋白激酶C活性、Bcl-2表达及神经元凋亡的变化。结果：脑缺血／再灌流可以导致蛋白激酶C的移位激活伴Bcl-2表达及神经元凋亡的增加;用蛋白激酶C抑制剂灯盏花可以阻止上述变化。结论：蛋白激酶C的激活促进Bcl-2表达可能与脑缺血／再灌流诱导的神经元凋亡有关。     

蛋白激酶C在鼻息肉中的表达及意义

目的探讨蛋白激酶C在鼻息肉组织中的表达及其与嗜酸粒细胞凋亡的相关性。方法13例鼻息肉患者给予丙酸氟替卡松喷鼻治疗,采用流式细胞术检测激素治疗前后鼻息肉组织中蛋白激酶C表达及凋亡的嗜酸粒细胞,并与7例健康正常人下鼻甲黏膜进行比较。结果蛋白激酶C主要表达在嗜酸粒细胞,其次在血管内皮细胞、腺体周围的平滑肌细胞;13例鼻息肉组织中嗜酸粒细胞表面均有蛋白激酶C表达(100%),而7例健康下鼻甲黏膜中3例(42.86%)有蛋白激酶C表达,差异有显著意义(P<0.05)。糖皮质激素治疗后的鼻息肉组织中有蛋白激酶C表达的嗜酸粒细胞减少,与激素治疗前相比,差异有显著意义(P<0.05)。结论蛋白激酶C在鼻息肉组织中呈高表达,糖皮质激素可以有效抑制鼻息肉中蛋白激酶C的表达,减少嗜酸粒细胞的浸润。     

脂多糖调控PI3K/Akt通路增强中性粒细胞吞噬功能

目的: 探讨脂多糖对中性粒细胞细菌吞噬功能的影响及可能机制。方法: 取健康人静脉血中性粒细胞,重悬分为对照组、脂多糖10 min、20 min、30 min组,按1 ∶50加入大肠埃希菌GFP(25922GFP),孵育30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测中性粒细胞的吞噬功能;另取中性粒细胞重悬分为对照组、脂多糖组、LY294002(PI3K抑制剂)组、LY294002+脂多糖组,一部分细胞行丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)荧光染料染色,流式细胞术观察与分析细胞中F actin,荧光显微镜观察中性粒细形态;另一部分细胞按1 ∶50加入25922GFP,孵育30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测中性粒细胞的吞噬功能。免疫印迹法检测各组细胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和磷酸化磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)的表达。结果： 与对照组比较,脂多糖10 min、20 min、30 min组中性粒细胞25922GFP荧光表达逐渐增强,p-PI3K和p-Akt表达逐渐增加;脂多糖组荧光强度和p-PI3K和Akt表达明显高于对照组(P均＜0.05)。与对照组比较,脂多糖组F-actin表达增加,细胞形态改变,LY294002组和LY294002+脂多糖组细胞形态无明显改变,LY294002+脂多糖组F-actin表达明显低于脂多糖组(P＜0.05);对照组、LY294002组和LY294002+脂多糖组p-Akt表达明显低于脂多糖组。结论： 经脂多糖刺激后中性粒细胞吞噬功能增强,其机制可能与脂多糖促进PI3K/Akt通路磷酸化有关。     

冠心病患者红细胞蛋白激酶C活性变化

目的：探讨蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）在冠心病发病中的作用。方法：测定心绞痛患者、急性心肌梗塞患者、正常对照者的红细胞胞膜、胞浆ＰＫＣ活性。结果：心绞痛及急性心肌梗塞患者红细胞胞膜中ＰＫＣ活性均显著高于正常对照者，且差异具有显著性（Ｐ＜０．０１），心绞痛患者略高于急性心肌梗塞患者，但差异不显著；心绞痛及急性心肌梗塞患者红细胞胞浆中ＰＫＣ活性均显著高于正常对照者，且差异具有显著性（Ｐ＜０．０１）。心绞痛略高于急性心肌梗塞组，但差异不显著。结论：ＰＫＣ可能参与冠心病的发病     

RAPID ALTERATIONS IN PROTEIN KINASE C ACTIVITY AND INTRACELLULAR DISTRIBUTION DURING PHORBOL ESTER-INDUCED HL-60 CELL MICROPHAGE-LIKE DIFFERENTIATION

Alterations of protein kinase c activity were studied in the human leukemic cell line, HL-60, during induction of macropahge-like differentiation by tetradecenoyl phorbol 13-acetate (TPA). TPA added to intact HL-60 cells caused a concentration-dependent decrease in the total detergent-solubilized protein kinase C activity within an hour. This decrease in protein kinase c acticity in extracts of the cells did not appear to be due to an inhibitor of the kinase induced by TPA. DEAE-cellulose chromatography showed that the total decrease was caused by a decrease in the level of protein kinase C activity in the cytosol, since a higher peak of activity eluted at NaCl concentration greater than 0.125 M was found in the particulate preparation. Trifluoperazine, an inhibitor of protein kinase C activity in cell extracts, was however found to raise the protein kinase C activity when added to intact HL-60 cells. Nevertheless, trifluoperazine, when added in combination with TPA, did not overcome the TPA-induced decrease in protein kinase C activity.     

Observation on the specific binding site of p195 protein on human erythrocytes using colloidal gold labelling

Plasmodiumfalc1Parumisestimatedtobere-sponsiblefor2milliondeathsintheworldannual-ly.Invasionofmerozoitesofhumanmalariapara-site,P.falciParam,isspecifictohumanerythro-cytes'Itisthereforelikelythattheerythrocyteshavesfirfacereceptorsthatarespecificallyrecog-nizedbyparasiteligands-ThemajorerythrocytereceptorforP.falciParummerozoiteshasbeeni-dentifiedasglycophorin['J.Themajorsurfacepro-teinofthemerozoitesofP.falciParumisapro-cessingproductofp195,a195-kilodalton(kD)pre-cursorprotein-Antibodiesr…     

Influence of berberine on protein tyrosine kinase of erythrocyte insulin receptors from type 2 diabetes mellitus

Objective： Bererine has been used to treat type 2 diabetes mellitus in Chinese traditional medicine because of its hypoglycemic effect. In this report, we compared the intrinsic tyrosine kinase activities of erythrocyte insulin receptors from type 2 diabetes mellitus with or without stimulation by berberine in vitro. Methods- Preparations containing insulin receptors were obtained from soluble human erythrocytes, and the insulin receptors were partially purified by affinity chromatography. The tyrosine kinase activity was measured by the exogenous substrate phosphorylation. Results： Both the membrane tyrosine kinase activity and the purified receptor tyrosine kinase activity from diabetics decreased significantly compared with those of normal individuals （reduced by 67.4% and 47.2%, respectively）. After incubation with berbefine, there is a statistical difference in the activity of membrane tyrosine kinase for diabetic patients （ a 150% increase）. Berefine had no effect on the tyrosine kinase activity of purified insulin receptors. Conclusion： We concluded from these results that berbefine was able to improve the insulin sensitivity by increasing the protein tyrosine kinase activity of membrane-bound insulin receptors from type 2 diabetes mellitus.     

用胶体金标记法观察P195蛋白与人红细胞特异性结合区域

寻找恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白Ｐ１９５中的红细胞结合位点，为设计疫革阻断裂殖子红细胞提供实验依据：方法在大肠杆菌中分８段表达Ｐ１９５蛋白，用镍亲和层析柱分离这些蛋白。各段蛋白经复性后用胶体金标记、。标记后的蛋白与人红细胞共孵育，经固定，切片后在电镜下观察。     

木犀草素对人白血病HL-60细胞内蛋白激酶C的抑制作用

目的　观察木犀草素对HL- 60细胞内蛋白激酶C活性的影响。方法　采用台盼蓝拒染法,在不同条件下测定细胞增殖的抑制率。PKC活性通过测定转移到CK2 底物上的[γ 32P]ATP的32P的放射性活度来检测。结果　木犀草素能够显著地抑制HL- 60细胞内PKC的活性并呈剂量依赖性关系,其IC50为2.38μmol/L,作用效果强于阳性对照槲皮素(IC50=2.54μmol/L)。结论　木犀草素作为一种细胞内的PKC抑制剂具有潜在的抗肿瘤临床应用价值。     

人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的 诱导人腺苷激酶组组蛋自在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化.方法 将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a(+)连接构建的重组蛋白表达载体pET30a(+)/ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞.1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达.离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体.用含2 mol/L和4 mol/L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白.随后用含8 mol/L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀.用Ni-NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8 mol/L尿素的洗脱缓冲液洗脱.收集样品透析复性.结果 成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的 蛋白以包涵体形式表达.经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85%以上的重组蛋白.结论 人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化.为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础.     

DMSO诱导下蛋白激酶C与HL—60细胞分化的关系

HL-60细胞在DMSO诱导下沿粒细胞方向分化,120h NBT~ 细胞达84％。细胞经诱导24h蛋白激酶C活性增加,72h为未诱导细胞的2.7倍。酶活性的增加,主要是由于细胞浆部分而不是细胞膜部分可溶性酶活性改变的结果。分化诱导剂DMSO本身不能直接激活蛋白激酶C,提示DMSO对酶活性的影响是间接的。     

Src激酶和p38激酶在乙酰肝素酶促进人胃癌细胞迁移和侵袭中的作用及相互关系

目的 探讨Src激酶和p38激酶在乙酰肝素酶促进人胃癌细胞迁移和侵袭中的作用及相互关系.方法 实验设正常对照组(细胞未作其他处理)、人乙酰肝素酶重组蛋白处理组(5、10 μg/ml)以及提前3 h加入Src激酶特异性抑制剂pp2(5 μmol/L)或p38激酶特异性抑制剂SB 203580(1 μmol/L)再加入人乙酰肝素酶重组蛋白(10 μg/ml)作用24 h组.利用划痕损伤实验和Transwell小室基质侵袭实验分别检测各处理组对人胃癌MGC-803细胞迁移和侵袭能力的影响;Western blot法检测各处理组对人胃癌MGC-803细胞、高表达乙酰肝素酶的人胃癌SGC-7901细胞和乙酰肝素酶表达被下调的SGC-7901-Heparanasel(-)细胞中Src激酶、p38激酶、磷酸化Src激酶(p-Src)和磷酸化p38激酶(p-p38)蛋白表达的影响.结果 与正常对照组比较,5和10 μg/ml人乙酰肝素酶重组蛋白均能明显增强人胃癌MGC-803细胞迁移和侵袭能力(P<0.05);与未加抑制剂的人乙酰肝素酶重组蛋白比较,抑制剂pp2和SB 203580均能削弱人乙酰肝素酶重组蛋白增强的人胃癌MGC-803细胞的迁移和基质侵袭能力(P<0.05).10 μg/ml人乙酰肝素酶重组蛋白促进人胃癌MGC-803细胞Src激酶和p38激酶的磷酸化,而SGC-7901-Heparanasel(-)细胞中磷酸化的Src激酶和p38激酶表达水平较SGC-7901细胞明显下调(P<0.01);抑制剂pp2和SB 203580对人胃癌SGC-7901细胞中乙酰肝素酶蛋白表达无明显影响;在人胃癌SGC-7901细胞和MGC-803细胞中,Src激酶的抑制剂pp2抑制磷酸化p38蛋白的表达,而p38激酶的抑制剂SB 203580对磷酸化Src蛋白表达无明显影响.结论 乙酰肝素酶可能通过促进Src激酶磷酸化或p38激酶的磷酸化或先促进Src激酶磷酸化再促进p38激酶的磷酸化,从而促进人胃癌细胞迁移和侵袭能力.乙酰肝素酶-Src激酶磷酸化-p38激酶磷酸化可能是人胃癌细胞内存在的与细胞迁移和侵袭有关的信号转导通路.