pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

DJ-1L166P与DJ-1M26I基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的.     

PMA诱导节律基因表达对细胞紫外线损伤的影响

目的研究诱导NIH3T3细胞节律基因表达对细胞紫外线损伤的影响。方法用体外节律诱导剂乙酰肉豆蔻佛波酯诱导NIH-3T3细胞节律基因表达。分别选择mPer2基因表达的谷值和峰值时刻对细胞进行紫外线照射,以非诱导节律的单纯照射组为对照,通过流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布,平板克隆形成试验检测细胞增殖情况。结果mPer2基因表达峰值时进行紫外线照射的细胞,与mPer2基因表达谷值时和非诱导节律紫外线照射细胞比较,增殖能力强、凋亡率低、G1期阻滞明显。结论节律基因诱导的NIH3T3细胞的紫外线损伤减小,并与mPer2的基因表达相关,其保护作用可能与mPer2基因过表达有关。     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。     

乙型肝炎病毒X基因对正常肝细胞HL7702凋亡影响的初步探讨

目的 研究乙型肝炎病毒X基因(HBX基因)对HL7702肝细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法 用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3.1( )-X瞬时转入HL7702细胞,以转染空质粒pcDNA3.1( )的细胞及未转染的HL7702细胞为对照.转染后72 h收集细胞标本,作以下处理:RT-PCR法检测HBX mRNA的表达,免疫荧光鉴定HBx蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;以β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达量变化.结果 转染72h后,转染pcDNA3.1( )-X真核表达载体的HL7702细胞经RT-PCR扩增出HBX片段,免疫荧光结果 显示细胞内出现HBx蛋白的较强荧光;而转染空质粒组及未转染对照组经RT-PCR法及免疫荧光检测均显示无HBx表达.通过流式细胞术和半定量RT-PCR法检测细胞凋亡情况,结果 显示:转染HBX的细胞凋亡率(3.38%±0.67%)相对于转染空质粒组(1.25%±0.30%)及未转染质粒组(1.40%±0.37%)凋亡率增高, 差异均有显著性意义(P<0.05);转染HBx的细胞Bax mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显降低,差异均有显著性意义(P<0.05).转染空质粒组和未转染质粒组之间,对细胞凋亡率、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA进行比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论成功将HBX转染入HL7702细胞,并在细胞中表达;转染后72 h HBx可上调Bax表达,而下调Bcl-2表达,表明HBx能促进HL7702细胞凋亡.     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞中表达

目的 构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I重组表达载体,为进一步研究DJ-1M26I基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I重组表达载体,采用脂质体转染的方法分别将pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆,对获得的2种转染细胞在DNA水平、转录水平和蛋白质水平鉴定.结果 pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1 M26I质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,经PCR检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1 M26I基因的NIH3T3阳性细胞组增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1 M26I重组表达质载体.     

乙型肝炎病毒X基因在HepG2肝癌细胞的转染及对Fas/FasL表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因在HepG2肝癌细胞中的转染及对Fas/FasL表达的影响.方法用分子克隆方法构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞,以转染空载体pcDNA3的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2为对照,抽提RNA,进行RT-PCR,检测HBV X基因的表达.以β-actin为内参,用半定量RT-PCR法检测三组细胞凋亡相关基因Fas/FasL mRNA相对表达量的变化.结果重组真核表达载体经RT-PCR及DNA测序均检测出HBV X特异性片段,pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.转染HBx的细胞Fas与FasL mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论成功构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,转染入HepG2肝癌细胞,并在该细胞中表达.HBx在肝癌细胞中的表达能上调Fas和FasL基因的表达.     

节律基因mPER1对小鼠Lewis肺癌细胞迁移的影响

目的通过节律基因mPeriod1（mPer1）过表达,研究mPer1对小鼠Lewis肺癌细胞迁移的影响。方法采用脂质体介导法将mPer1基因转染入Lewis细胞。通过RT-PCR检测mPer1在Lewis细胞中的表达;采用Chemico公司QCM（tm）24-Well Colorimetric Cell Migration Assay检测细胞迁移的变化。结果与pcDNA3.1空质粒相比,pcDNA3.1-mPer1转染组mPer1表达增加,其迁移率与对照组比较明显下降。结论节律基因mPer1过表达能够抑制Lewis肺癌细胞的迁移。     

辐射诱导pcDNA3.1-Egr.1p-p16对JF305细胞周期和凋亡的影响

目的 检测pcDNA3.1-Egr.1p-p16质粒对胰腺癌细胞JF305凋亡和细胞周期变化的影响.方法 进行人胰腺癌JF305细胞培养,脂质体LipofectamineTM000转染pcDNA3.1-Egr.1p-p16重组质粒,6MV-X射线4 Gy照射(剂量率2.50 Gy/min),流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡状况.结果 pcDNA3.1-Egr.1p-p16质粒转染组和pcDNA3.1-Egr.1p-p16质粒转染 4 Gy照射组的JF305细胞中早期凋亡细胞分别占6.4%、10.4%,晚期凋亡或继发性死亡细胞分别占16.8%、33.8%,均较阴性对照组显著升高(P＜0.05).质粒转染 4Gy照射组总的凋亡率高于单纯质粒转染组(P＜0.05).辐射明显导致JF-305细胞G2期阻滞.pcDNA3.1-p16质粒和pcDNA3.1-Egr.1p-p16质粒基因转染,可使JF-305细胞阻滞于G1期.当给予细胞4 Gy照射后,两质粒转染组,阻滞于G1期细胞变化不大,阻滞于G2期的细胞有所增加.结论 pcDNA3.1-Egr.1p-p16可致JF-305细胞凋亡,与放射联合增加了细胞凋亡率.转染pcDNA3.1-Egr.1p-p16可使细胞阻滞于G1期,联合辐射,增加了细胞的G2期阻滞.     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

醋柳黄酮缓释片的药动学初步研究

目的:研究醋柳黄酮缓释片在家犬体内的药动学过程,测定其药动学参数,计算缓释片相对于普通片的生物利用度。方法:将实验动物分为两组,分别用醋柳黄酮缓释片和普通片进行口服给药,用高效液相色谱法测定血浆药物浓度,应用3P97软件求算药动学参数。结果:醋柳黄酮缓释片及普通片的tm ax分别为4.87 h和2.87 h,Cm ax分别为每小时0.46μg.L-1和每小时0.56μg.L-1,缓释片的相对生物利用度为111.7%。结论:醋柳黄酮缓释片与普通片均符合一室模型,缓释片与普通片具有生物等效性,且醋柳黄酮缓释片有明显的缓释效果。     

主动脉窦瘤破裂的外科治疗

报告２０例主动脉窦瘤破裂修复术的结果。１７例男性，３例女性。年龄７～５６岁。痊愈１９例，另一例因急性肾功能衰竭一周后死亡。作者就发病机理，诊断和合并畸形的处理进行了讨论。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

扩张兔皮肤超微结构的变化

目的：动态观察扩张兔皮肤超微结构的变化。方法：选用2--3kg新西兰大白兔64只，分为2大组，快速扩张组和常规扩张组，每组32只，每大组再分为4组，为扩张完成后即时、1周、12周、24周组。每组8只，其中4只为实验组，另4只植入扩张器不扩张作为对照组。透射电子显微镜观察各组皮肤超微结构的变化。结果：表皮扩张后经历--由扩张刺激引起的创伤至完全修复的过程。扩张后即时真皮中成纤维细胞大量增生，功能由静止转向活跃，胶原纤维碎裂成片，弹力纤维部分断裂，炎症细胞浸润；扩张后1周常规扩张组基底膜连续性基本恢复。显示成纤维细胞合成功能活跃。扩张后12周、24周，成纤维细胞趋于稳定、形态狭长，部分胶原排列紊乱，部分有似癜痕样改变。结论：扩张刺激可致兔皮肤创伤。扩张后真皮不可完全修复。     

芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用

目的观察芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用。方法30只Long-Evans大鼠用动脉结扎法造成视网膜缺血模型,其中治疗组20只腹腔注射芹黄素,对照组10只注射溶媒二甲基亚酚。用视觉电生理仪检查视网膜功能恢复情况。结果芹黄素治疗组视网膜功能恢复明显好于对照组(P<0.05)。结论芹黄素能促进大鼠缺血视网膜的功能恢复。      

颅咽管瘤切除术后并发症的处理

目的　讨论颅咽管瘤切除术后并发症的处理原则。方法　分析 36例颅咽管瘤切除术后并发症的临床资料。结果　术后并发尿崩症者 14例、高热 11例、电解质紊乱 8例、消化道出血 3例、癫痫 5例 ,死亡2例。结论　颅咽管瘤术后并发症较多 ,加强早期监测和处理 ,可进一步提高该病的治愈率     

阴道炎1236例病原检查分析

对１２３６例阴道炎患者的阴道分泌物作直接镜检和病原菌分离培养检查；结果，细菌感染９００例，念珠菌２３４例，滴虫１０２例。９００例细菌经鉴定；葡萄球菌３００例，阴道加特纳菌２７６例，淋病奈瑟菌１７０例，其它细菌１２４例。结果表明，葡萄球菌，阴道加特纳菌，淋病奈瑟菌是细菌性阴道炎最常见的致病菌。