锤头状核酶在抗白血病基因治疗中的作用

锤头状核酶是一类具有酶活性的RNA,可以序列特异性地定点切割靶RNA,从而阻断有害基因的表达.在基因调控、抗病毒复制、抑制癌基因方面有较大进展.本文主要阐述锤头状核酶在抗白血病基因治疗中的作用.     

锤头状核酶在白血病基因治疗中的应用

核酶 (ｒｉｂｏｚｙｍｅ)是一类具有生物催化功能的ＲＮＡ ,1 981年Ｃｅｃｈ等[1]在研究四膜虫时发现其大核ｒＲＮＡ的前体具有自我催化和剪切去除内含子的能力 ,从而改变了长期以来“酶是蛋白质”的传统概念。核酶最主要的功能是可以序列特异性的方式切割ＲＮＡ。利用这种特性 ,人们可以人工设计合成具有催化活性的核酶 ,针对特定的ＲＮＡ序列进行剪切 ,使其失活从而抑制有害基因的表达。已经发现的核酶包括Ｉ类内含子、Ⅱ类内含子、ＲＮＡａｓｅＰ、锤头状核酶、发夹状核酶和斧头状核酶。其中对锤头状核酶的研究最为深入 ,其原因是锤头状…     

核酶与抗病毒基因治疗

1　引　言核酶(ribozyme),是1981年由Cech和Alfman在研究四膜虫mRNA前体的剪接中首先发现的。此二人由此获得1989年的诺贝尔奖。核酶是一类具有酶催化活性的RNA分子,可与相应的特异序列的RNA底物结合,具有切割功能[1]。核酶切割RNA的功能特点,是其用于阻断基因表达和抗病毒治疗的主要依据。目前,研究人员多以人工手段合成具有催化活性的RNA小片段(又称人工核酶),再与相应的底物RNA结合,可将底物RNA切割成特异性片段,从而控制多种病毒感染和用于癌症的治疗,具有潜在的基因治疗价值。2　核酶的结构及其作用机制核酶具有锤头状、发夹…     

锤头状核酶抑制CTLL-2细胞凋亡而增强其对Yac-1细胞杀伤活性的实验研究

目的　研究抗fas的锤头状核酶对小鼠细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)系CTLL 2细胞fas基因的表达及其介导的细胞凋亡抑制作用 ,探索供者淋巴细胞输注 (DLI)时增强T细胞抗白血病的新途径。方法设计并合成抗fas的锤头状核酶基因 ,将其导入CTLL 2细胞 ,通过RT PCR、Westernblot和流式细胞仪分别检测核酶对CTLL 2细胞fasmRNA和Fas蛋白表达的抑制 ,以MTT法检测CTLL 2细胞与Fas抗体结合后的增殖活性 ,以半胱天冬酶 3(caspase 3)活性检测试剂盒检测细胞caspase 3蛋白酶活性 ,以流式细胞仪检测细胞凋亡 ,以乳酸脱氢酶法检测CTLL 2细胞的体外杀伤活性。结果锤头状核酶基因导入CTLL 2细胞后 ,可使其表面的Fas表达降低达 5 0 % ,细胞经Fas抗体 (JO2 )处理后 ,与空白对照、转染空载体的细胞相比 ,转染核酶的细胞增殖活性增加了 1倍 ,caspase 3活性降低近 5 0 % ,而细胞的凋亡率显著降低 ,只有 37% ,且CTLL 2细胞的体外杀伤活性为对照组的 2倍。结论该核酶具有切割fas基因的良好活性 ,并可抑制Fas介导的CTLL 2细胞凋亡 ,增加该细胞存活率 ,从而增强对Yac 1细胞的杀伤活性。     

切割瘢痕组织的TIMP－1核酶计算机辅助设计及体外表达载体的构建

目的设计能特异性切割人类瘢痕组织中TIMP－1mRNA的核酶,为解决增生性瘢痕问题寻找新的基因治疗的途径。方法根据Symons的"锤头结构",以人TIMP－1的mRNA为靶RNA,用计算机对其可能成为核酶切割位点的部位进行分析以寻找最佳切点;对底物、核酶及嵌入U6snRNA后核酶的二级结构进行预测;依据分子生物学的克隆技术构建其体外高效表达载体。结果针对第123、299和353位点设计了3个核酶,均能与底物切点两翼碱基结合形成锤头结构,嵌入U6snRNA后,核酶与底物的结合能量变化不大。成功构建了核酶的高效表达载体。结论计算机辅助设计是研究核酶过程中不可或缺的重要步骤;核酶嵌入U6snRNA可能是解决目前核酶研究中存在问题的较好途径;TIMP－1mRNA上第123、299、353位可能是核酶的最佳切割位点。     

抗Fas锤头状核酶阻抑小鼠急性粒-单核白血病细胞免疫逃逸的研究

为了研究抗Fas锤头状核酶对T细胞Fas表达及其凋亡的影响和探讨增强供者淋巴细胞输注时移植物抗白血病（GVL）效应的新策略，构建可有效切割Fas mRNA的锤头状核酶真核质粒，用电穿孔法将其导入小鼠CTL细胞株CTLL-2之后，借助RT—PCR和Western blot检测其Fas的表达，同时检测转染前后其胱冬酶-3（Caspase-3）活性和凋亡（Annexin V—FITC法）的改变，并用MTT法检测空白对照组、空载体转染组及pU6-RZ596转染组CTLL-2细胞的增殖情况和体外杀伤小鼠急性粒-单核白血病细胞（WEHI-3）的活性。结果表明：构建的U6嵌合型锤头状核酶RZ596在细胞内能有效切割Fas，明显降低小鼠活化CTLL-2的Fas水平，与高表达Fas配体的WEHI-3孵育后，其存活率和体外杀伤WEHI-3活性明显高于对照组。结论：抗Fas核酶能显著降低小鼠活化CTLL-2的Fas表达，使其免于WEHI-3的膜Fas配体经Fas途径所致的凋亡，并提高CTL对小鼠急性粒-单核白血病细胞的杀伤力，从而阻抑小鼠急性粒-单核白血病细胞的免疫逃逸。     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体构建及其对K562细胞的影响

目的：研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中的作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法：合成针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头状”核酶的ｃＤＮＡ序列，定向克隆于逆转录病毒载体内，通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将核酶基因导入Ｋ５６２细胞，并通过克隆分析法、流式细胞术（ＦＣＭ）、逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果：①核酶转染Ｋ５６２细胞后４８小时克隆形成抑制率达８５％；②细胞内Ｐ２１０蛋白合成受到明显抑制；③ＲＴＰＣＲ半定量检测ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平明显下降；④核酶处理组Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为：在ＦＣＭ图谱上可见明显的凋亡峰；ＤＮＡ电泳分析出现典型的梯状ＤＮＡ带；电镜观察呈现凋亡早期形态学改变。结论：核酶基因通过逆转录病毒载体导入Ｋ５６２细胞后可成功表达，使Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ及Ｐ２１０蛋白表达水平下降，抑制Ｋ５６２细胞增殖，同时诱导Ｋ５６２细胞发生凋亡。     

靶向C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的探讨靶向作用于乙型肝炎病毒C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的作用。方法设计并应用PCR技术合成M1RNA核酶，应用pEGFP-C1载体构建M1GSRNA核酶的真核表达质粒，应用脂质体Lipofectamine TM 2000转染HepG2．2．15细胞，以ELISA法检测细胞培养液中病毒抗原，以反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测细胞内病毒mRNA，以荧光定量PCR法检测分泌入培养液的HBVDNA含量，用MTT法检测核酶对细胞增殖活性的影响。结果质粒载体表达的M1GS RNA核酶能明显抑制细胞培养液中HBeAg的表达及病毒mRNA的表达，抑制率分别为31．58％，32．5％。但M1GS RNA核酶对培养液中的HBV DNA含量无明显影响，亦不影响HepG2．2．15细胞的增殖活性。结论M1GS RNA核酶能特异性抑制HepG2．2．15细胞内HBV C区基因表达，是一种很有潜力的抗HBV基因治疗方法。     

核酶对白血病耐药细胞株K562/A02耐药性逆转的研究

肿瘤耐药及其逆转是当今肿瘤治疗研究的热点。耐药的发生与多药耐药基因 (ｍｄｒ1)及其编码的Ｐ糖蛋白 (Ｐ ｇｐ)过度表达关系密切。我们采用电击基因导入法将特异切割ｍｄｒ1ｍＲＮＡ的锤头状核酶基因导入白血病耐药细胞株Ｋ5 6 2 Ａ0 2 ,研究该核酶抑制ｍｄｒ1基因及Ｐ ｇｐ表达 ,逆转肿瘤细胞耐药性的作用。材料和方法1　细胞株　Ｋ5 6 2细胞株系人红白血病细胞株[1 ] ,由上海血液学研究所提供。Ｋ5 6 2 Ａ0 2细胞株为阿霉素诱导Ｋ5 6 2细胞建立的多药耐药细胞株 ,由中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所提供。2　质粒　真核…     

RNA干扰与其他阻断基因表达的基因治疗技术的比较

抑制或阻断基因表达的基因治疗技术主要有三种：反义寡核苷酸、核酶和RNA干扰技术。在过去20年左右的时间里，反义核酸及核酶技术在抑制或阻断基因表达方面扮演了重要角色，然而它们封闭蛋白质表达的效果仍难于达到治疗疾病的水平。RNA干扰作为一种基因治疗技术的研究虽然才刚刚开始，但与上述技术相比具有更大的优势，相信随着该项技术的稳定和发展，未来将有越来越多的疾病和疾病相关基因被列入RNA干扰基因治疗的行列。     

核酶技术在白血病基因治疗中作用的研究进展

核酶是具有酶催化活性的RNA分子，可以特异性地结合和切割靶序列，从而在分子水平和细胞水平真正实现对失控基因苛有害基因表达的有效阻断，已大量用于人类疾病诊断治疗方面的研究。本文概述核酶技术在白血病基因治疗中作用的研究进展和应用前景。     

新一代抗肿瘤药物：BCL-2家族配体

Bcl-2在凋亡抑制过程中起关键作用。目前，抑制Bcl-2活性的方法主要有反义寡核苷酸、单链抗体、锤头状核酶和小分子配体。近年采用现代重组技术、计算机筛选途径发现Bcl-2的小分子配体(如HAl4-1)可诱导Bcl-2高表达细胞凋亡，与其他方法联合使用表现出协同阻滞效应。Bcl-2家族配体可能成为新一代抗肿瘤药物。     

抗bcl—2核酶在HL—60细胞中的表达及促进其凋亡的研究

为消除白血病细胞中ｂｃｌ－２基因对细胞凋亡的抑制作用开辟白血病基因治疗的途径。将合成的针对ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ的“锤头型”核酶基因定向克隆于真核表达本ＰＤＯＲ－ｎｅｏ，构ｐＤＯＲ－ＲＺ重组体。通过脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的ＤＮＡ转染法，把ｐＤＯＲ－ＲＺ导入ＨＬ－细胞。     

核酶技术在白血病基因治疗中作用的研究进展

核酶是具有酶催化活性的RNA分子,可以特异性地结合和切割靶序列,从而在分子水平和细胞水平真正实现对失控基因或有害基因表达的有效阻断,已大量用于人类疾病诊断治疗方面的研究。本文概述核酶技术在白血病基因治疗中作用的研究进展和应用前景。     

新一代抗肿瘤药物:BCL-2家族配体

Bcl-2在凋亡抑制过程中起关键作用。目前,抑制Bcl-2活性的方法主要有反义寡核苷酸、单链抗体、锤头状核酶和小分子配体。近年采用现代重组技术、计算机筛选途径发现Bcl-2的小分子配体(如 HA14-1)可诱导Bcl-2高表达细胞捌亡,与其他方法联合使用表现出协同阻滞效应。Bcl-2家族配体可能成为新一代抗肿瘤药物。     

核酶在抗肿瘤血管生成治疗中的应用研究进展

核酶(ribozyme,Rz)是一类具有生物催化活性的RNA分子,能够定点切割特定的mRNA靶分子,从而有效地阻断特定基因的表达,发挥其生物学作用.80年代初期,美国科学家Cech和Altman分别发现RNA本身具有催化活性,这一发现结束了所有酶都是蛋白质这一传统概念,并开辟了RNA研究的新纪元,为此Cech和Altman获得了1989年诺贝尔医学奖的桂冠.在当代生物医学领域,利用核酶技术进行肿瘤的基因治疗已成为一项重要手段.     

抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因抑制白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的探讨抗血管内皮生长因子(VEGF)发夹状核酶基因对白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成的影响。方法采用脂质体介导的方法将抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ 转染白血病细胞系 K562,G418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组 DNA,用 PCR 方法验证核酶基因已转入 K562细胞;荧光定量 PCR 和免疫印迹反应检测白血病细胞中 VEGF mRNA 和蛋白表达量的改变;将白血病细胞皮下接种 BALB/c 裸鼠,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况;组织形态学和免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤微血管密度(MVD)。结果抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体 pcDNA-RZ 转入白血病细胞系 K562(K562/RZ),G418筛选两周获得阳性克隆,PCR 检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组 DNA;与 K562及 K562/PC 细胞(转染空质粒的 K562细胞)相比,K562/RZ 细胞 VEGF mRNA 和蛋白的表达量明显降低。接种 K562、K562/PC 和 K562/RZ 细胞组小鼠肿瘤终体积分别为(3.21±0.89)cm~3,(3.42±1.01)cm~3,(1.71±0.94)cm~3;肿瘤重量分别为(4.43±0.87)g,(3.96±0.94)g,(2.24±0.56)g;瘤体内 MVD 分别为4.70±1.25,4.67±1.31和1.80±1.55。以上各组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)。结论转导抗 VEGF 发夹状核酶基因能减少白血病细胞中 VEGF 的合成,细胞裸鼠致瘤能力明显减弱,瘤体内血管形成能力降低。     

K562细胞血管内皮生长因子自分泌链作用的实验研究

目的探讨抗VEGF抗体及抗VEGF发夹状核酶基因对K562细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响及其分子机制。方法将不同浓度的VEGF抗体作用于K562细胞，应用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ转染K562细胞，采用MTT法、甲基纤维素半固体培养法和细胞周期测定分析抗VEGF抗体及发夹状核酶基因对白血病细胞增殖的影响；DNA凝胶电泳和AnnexinⅤ标记法检测白血病细胞的凋亡程度；RT-PCR法测定K562细胞中相关基因表达的变化。结果抗VEGF抗体能抑制K562细胞生长，促进其凋亡，这一作用呈剂量依赖关系。0．165μg／ml VEGF抗体作用于K562细胞72h，DNA凝胶电泳出现梯状条带，当抗体浓度增加到0．825μg／ml时，梯状条带更为清晰；RT-PCR显示，VEGF抗体作用后，K562细胞MRP、TOPOⅡ基因的表达较对照组下调，而GST基因表达无明显改变。与K562及K562／PC细胞（转染空质粒的K562细胞）相比，转染抗VEGF核酶基因的K562／RZ细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量明显降低；生长曲线提示K562／RZ细胞生长缓慢，甲基纤维素集落形成率较对照组明显下降，对照组集落形成率为（30．5±3．3）％，而K562／RZ组为（16．3±2．8）％，细胞周期动力学分析结果显示K562／RZ细胞G1期细胞增多，S期细胞显著减少；在小剂量As2O3作用下，K562／RZ细胞凋亡数量较对照明显增高（凋亡率对照组为13．4％，K562／RZ组为31．5％）。结论抗VEGF抗体阻断K562细胞VEGF自分泌环路或者抗VEGF发夹状核酶减少K562细胞中VEGF的合成，能抑制K562细胞的增殖，促进K562细胞的凋亡，引起部分与细胞凋亡和多药耐药相关的基因表达改变。     

体外快速获得核酶P中 M1RNA基因的研究

目的在体外转录快速获得原核生物来源核酶P的核心催化亚基M1RNA。 方法以大肠埃希菌DH5α菌液为模板,应用聚合酶链式反应的方法扩增M1RNA基因,并将该基因置于T7启动子下游,其聚合酶链式反应产物经电泳及测序鉴定。以M1RNA基因为模板,以³²P标记,在T7 RNA聚合酶的作用下体外转录M1RNA。将产物以尿素变性聚丙烯酰胺凝胶分离并观察结果。 结果应用聚合酶链式反应的方法从大肠埃希菌基因组扩增M1RNA基因,经凝胶电泳观察及测序鉴定,证实成功在体外扩增M1RNA基因,并置于T7启动子下游。在T7 RNA聚合酶的催化下,应用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产物,结果显示377nt处可见与预期相符的条带,证实成功在体外获得M1RNA。 结论成功在体外快速获得具有独立催化功能的M1RNA,基于此的基因沉默技术具有发展成新型反义核酸药物的良好前景。     

核酶抗白血病作用的研究进展

核酶是具有有酶催化活性的ＲＮＡ分子，可以特异地结合和切割靶序列抑制基因表达，用于人类疾病诊断治疗方面研究。本文概述了核酶对白血病抑制作用的研究进展和应用前景。