转化生长因子β1基因对骨髓基质干细胞增殖分化的影响

目的 观察转化生长因子β1（TGF－β1）基因能否转入骨髓基质干细胞（MSCs)，并探讨经TGF－β1基因转染后的MSCs增殖和分化情况。方法 取新西兰雄性大耳白兔的骨髓，得骨髓源MSCs体外培养。将重组TGF－β1和空载pcD-NA3基因分别转染MSCs后，免疫组化（SABC）法检测TGF－β1转染是否成功，用透射电镜和流式细胞仪观察两组MSCs的增殖和分化情况。结果 SABC法证明TGF－β1瞬间转染成功；转染48h后，实验组MSCs增殖较对照组显著；实验组MSCs具有一定的分化趋势。结论 重组TGF－β1基因转入骨髓源MSCs的方法是可行的，瞬间TGF－β1转染对MSCs的增殖和分化有显著促进作用。     

转染TGF—β1基因对大鼠树突状细胞成熟分化的影响

目的：建立大鼠骨髓DC的分离和体外扩增方法，构建TGF－β1重组质粒并转染DC，检测TGF－β1基因对DC分化成熟的影响。方法：分离大鼠骨髓造血前体细胞，在GM－CSF作用下经手法筛选，纯化、培养并扩增DC。构建TGF－β1－pcDNA3质粒，并以脂质体介导转染DC。以Dil荧光法和免疫细胞化学染色检测转染DC的TGF－β1和RT1B的表达。结果：TGF－β1-pcDNA3质粒可转染未成熟DC并有效抑制DC表面RT1B的表达，并能抑制DC对LPS的反应。结论：TGF－β1基因能有效抑制DC成熟，并诱导机体免疫耐受。     

TGF-β1基因转染间充质干细胞的量效关系及安全性研究

为探讨能获得最佳转染效率和促增殖分化效应的TGF-β1基因转染条件、剂量及基因治疗的安全性,体外将TGF-β1基因转入骨膜源间充质干细胞(MSCs),用水貂肺上皮细胞生长抑制法、透射电镜及软琼脂培养等方法检测.结果发现转基因MSCs表达的TGF-β1具有生物学活性.当3μl脂质体介导1μgTGF-β1基因转染时,能获得最佳转染效率和促MSCs增殖及向成软骨方向定向分化效应;转基因细胞无恶性转化倾向.从而把组织工程学与分子生物学有机结合成为分子组织工程学,为高质量地修复关节软骨缺损奠定了良好的基础.     

TGF-β_1基因转染间充质干细胞的量效关系及安全性研究

为探讨能获得最佳转染效率和促增殖分化效应的 TGF-β1 基因转染条件、剂量及基因治疗的安全性 ,体外将TGF-β1 基因转入骨膜源间充质干细胞 ( MSCs) ,用水貂肺上皮细胞生长抑制法、透射电镜及软琼脂培养等方法检测。结果发现 :转基因 MSCs表达的 TGF-β1 具有生物学活性。当 3μl脂质体介导 1μg TGF-β1 基因转染时 ,能获得最佳转染效率和促 MSCs增殖及向成软骨方向定向分化效应 ;转基因细胞无恶性转化倾向。从而把组织工程学与分子生物学有机结合成为分子组织工程学 ,为高质量地修复关节软骨缺损奠定了良好的基础。     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

目的 将大鼠转化生长因子β1(TGF—β1)基因转染成骨细胞后，研究转基因细胞表达TGF—β1的情况。方法 通过Lipofectamine介导将TGF—β1基因导人大鼠成骨细胞，转染24h后通过SABC法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况。采用G418筛选转染细胞2周，获得阳性细胞克隆，用SABC法检测转染细胞稳定表达TGF—β1的情况。结果 转染24h后，成骨细胞就有明显的TGF—β1蛋白和mRNA高表达。G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的TGF—β1表达。结论 TGF—β1基因转染成骨细胞后可获得稳定的高表达，采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性。     

重组TGFβ1基因转染后细胞上清的检测

目的:观察TGFβ1基因转入能否成功.方法:用pL(TGFβ1)SN经脂质体转染包装细胞,G418筛选,对阳性病毒上清检测TGFβ1表达蛋白及Neo基因,转染后的SMMC7721细胞进行免疫组化染色.结果:阳性上清ELISA检测,TGFβ1含量为16～41ng/ml;套式RT-PCR检测Neo基因,第2轮后全部出现290bp条带;TGFβ1免疫组化染色显示:空白对照±,正义转染++.结论:TGFβ1基因转染效果确实可靠.     

TGFβ1基因codon10(Leu＞Pro)变异对肝脏细胞功能的影响

目的观察TGFβ1基因codon10(Leu>Pro)的单核苷酸多态性(SNP)对肝脏细胞功能的影响。方法构建含codon10(Leu>Pro)的TGFβ1(LAP+成熟态单体)真核表达重组体CMV-Leu、CMV-Pro。在HepG2、LX-2细胞中转染pcD-NA3.1空载体、CMV-Leu、CMV-Pro,培养24h后,ELISA检测细胞培养上清液中TGFβ1的分泌量。MTT实验观察HepG2细胞转染后的增殖情况,流式细胞术检测LX-2细胞转染后CD83的表达。结果转染CMV-Leu和CMV-Pro能增加HepG2、LX-2细胞的TGFβ1分泌量,且转染CMV-Pro的细胞TGFβ1分泌量比转染CMV-Leu的细胞高(P<0.05)。转染CMV-Pro能明显增高HepG2细胞的增殖活性(P<0.01),而转染CMV-Leu能明显增加LX-2细胞CD83的表达率(P<0.01)。结论TGFβ1基因codon10(Leu>Pro)的SNP对肝脏细胞TGFβ1的分泌、细胞增殖活性及CD83的表达具有明显影响。     

转化生长因子β1基因修饰的间充质干细胞／仿生基质材料的体外复合培养

目的 探讨转化生长因子β1（TGF－β1)基因转染对间充质干细胞（MSCs)增殖分化的影响,评价涂覆多聚赖氨酸（PLYS）的聚DL乳酸（PDLIA）仿生基质材料能否作为关节软骨组织工程学研究的支架材料。方法 将组织工程学与分子生物学有机结合,体外将具有多重生物学效应的TGF－β1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞－－间充质干细胞（MSCs）,并与表面涂覆PLYS的PDLLA可降解三维多孔基质材料体外复合培养。以单纯空载体转染MSCs为对照,通过扫描电镜等方法观察种子细胞的粘附、增殖及分化等情况。结果 基质材料孔隙率为88％,其中孔径为150－200μm的有效孔占80％。所有细胞增能很好地粘附于基质材料上,其中TGF－β1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。结论 利用扮子组织工程学原理可使TGF－β1持续高效发挥作用,使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。涂覆PLYS的PDLLA仿生基质材料不仅具有良好的生物相容性和结构相容性,而且具有更好的表面相容性和生物学活性,在一定程度上解决了细胞－－基质材料之间非的界面不相容问题,是关节软骨缺损修复的良好基质材料。     

维拉帕米阻断TGF-β1诱导的α1(Ⅰ)胶原基因启动子的激活

目的：探讨维拉帕米对α1(Ⅰ）胶原基因启动子活性的影响。方法：将人α1(Ⅰ）胶原基因启动子重组体pCOLH1.5、pCOLH2.5转染至大鼠肾小球纱膜细胞，分别经不同浓度的转化生长因子β1(TGF-β1）和纺拉帕米处理后，ELISA法测定细胞CAT表达水平。结果：TGF－β1作用后，pCOLH1.5和pCOLH2.5的CAT活性明显增加，分别为对照组的1.498和1.551倍；维拉帕米对两上重组体的CAT表达均有抑制作用，与单纯TGF－β1组比较，维拉帕米加TGF－β1组pCOLH2.5的CAT活性明显降低（维拉帕米低浓度组P＜0.05，高浓度组P＜0.01）。结论：维拉帕米不仅直接抑制启动子的活性，而且还部分阻断TGF－β1诱导的α1(Ⅰ）胶原基因启动子激活。     

Smad7对转化生长因子β1诱导的肺泡上皮细胞向间质细胞转变的影响

目的检测转化生长因子（TGF）β1能否在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变（EMT）,以及Smad7基因转染能否阻止此种转变及相关信号转导机制。方法采用脂质体法转染Smad7基因到大鼠肺泡Ⅱ型上皮（RLE-6TN）;实时荧光PCR及免疫印迹法检测转染前后上皮细胞标志物（E—cadherin,CK19）、间质细胞标志物（FN、Vimentin及α—SMA）及Smad信号通路相关蛋白表达变化;相差显微镜观察TGFβ1诱导的肺泡上皮细胞形态改变,其超微结构改变采用透射电镜观察。结果成功转染Smad7到RLE-6TN;转染前,在TGFβ1作用下,RLE-6TN间质标志物的表达在mRNA和蛋白水平上调,而上皮标志物表达下调;转染后,其间质标志物下调的同时上皮标志物上调;转染前RLE-6TN在TGFβ1作用下p-Smad2／3表达上调,转染后其表达无明显改变;形态学上,TGFβ1能诱导肺泡上皮发生EMT,Smad7转染则能阻止EMT;超微结构上,TGFβ1能诱导肺泡上皮特有板层小体变性、肿胀并随其时间延长最终完全消失。结论TGFβ1能在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮向间质细胞转变,其机制部分与Smad信号转导途径相关,Smad7转染能在一定程度上阻止该转变。     

Survivin、TGFβ3与TIMP-1慢病毒载体的构建及其人髓核细胞表达

目的构建人生存素（Survivin）、转化生长因子03（TGFtβ3）与基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）三基因过表达慢病毒载体,通过一次转染,实现Survivin、TGFβ3、TIMP-1三基因在人退变椎间盘髓核细胞的稳定转染,为逆转或延缓椎间盘退变的基因治疗提供实验基础。方法应用Survivin、TGFβ3、TIMP-1慢病毒载体联合转染人退变髓核细胞,应用Real—TimePCR技术检测转染后基因表达情况。结果人退变椎间盘髓核细胞在转染后1周,Survivin、TGFβ3、TIMP-1三基因在基因水平均获得稳定过表达,并且其表达能维持细胞传至第3代或更久。Real—TimePCR检测结果显示,目的病毒组Survivin、TGFβ3、TIMP-1均过表达,其相对表达量与空白组比较,差异有显著性（F=12．96～3889．70,P〈O．05）。结论Survivin、TGFβ3与TIMP-1慢病毒载体能够稳定转染人退变椎间盘髓核细胞,并且能长时间维持其表达,从而发挥生物学效应。     

携TGFβ 1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的 :构建携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体。方法 :以逆转录病毒 pRevTRE为载体 ,采用平末端连接法获得含人TGFβ1cDNA3’ -端活性肽编码基因正、反向插入的重组病毒质粒 ,脂质体介导转染包装细胞PA317,获得含TGFβ1正、反义RNA的复制缺陷型逆转录病毒载体 pRevTβ和 pRevTβ-AS ,感染NIH3T3细胞 ,测定病毒滴度。分别转染膀胱癌EJ细胞 ,通过Southern -blot和半定量RT -PCR方法评价载体整合及表达效率。结果 :pRevTβ、pRevTβ-AS载体病毒滴度分别为0.84、0.88×105CFU/ml,EJ细胞外源基因的整合率为100 %,正、反义基因转染细胞内TGFβ1mRNA的相对转录水平为1.89和0.35。结论 :构建的携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体符合细胞体外转染要求 ,能与肿瘤细胞高效整合 ,有效表达。     

TGF—β1对大鼠系膜细胞增殖和纤溶酶原激活物及其抑制剂表达的影响

目的：通过对大鼠系膜细胞转染TGF－β1基因和反义TGF－β1基因,观察该细胞增殖和纤溶酶原激活物及其抑制剂表达的影响。方法：采用MTT、细胞计数和流式细胞仪检测检测细胞增殖;Northernblot和Western blot法检测其纤溶酶原激活性物质抑制－1（PAI－1）的表达,酶谱分析法检测其纤溶酶原激活物（tPA)活性。结果：过表达TGF－β1的系膜细胞生长受抑制,其PAI－1mRNA和蛋白表达增强,而tPA酶活性则降低;而低表达TGF－β1的系膜细胞增殖加速,其PAI－1mRNA和蛋白表达降低,tPA酶活性增强。结论TGF－β1可通过对大鼠系膜细胞增、纤拳激活性及其抑制因子表达的影响,而促进肾小球纤维化的发性。     

转染人TGF-β1基因对大鼠系膜细胞酸性核糖体蛋白P0表达的影响

目的筛选转染人转化生长因子β1(TGFβ1)基因的大鼠系膜细胞相关反应性基因,并观察TGFβ1对其中之一的酸性核糖体蛋白P0的影响。方法筛选经SSHPCR和反向杂交法构建的大鼠系膜细胞TGFβ1相关反应性基因cDNA消减杂交库,并进行测序及与GenBank资料作同源性比较;分别用NorthernBlot、半定量RTPCR观察TGFβ1、酸性核糖体蛋白P0基因在培养的大鼠系膜细胞和动物模型体内表达的变化。结果经筛选获得的28个反应性基因cDNA片段,长度为59～535bp,其中7个片段均和已知酸性核糖体蛋白P0基因同源性一致。在转染TGFβ1的大鼠系膜细胞中P0基因mRNA表达增强;在大鼠抗Thy1系膜增生性肾小球肾炎模型的病变肾组织中,P0基因mRNA和TGFβ1基因mRNA的上调表达趋势一致。结论酸性核糖体蛋白P0是一个与TGFβ1基因表达密切相关的基因,可能参与TGFβ1介导的肾小球肾炎和肾小球硬化的发生机制。     

反义寡核苷酸抑制TGFβ1诱导人肾小管上皮细胞表达CTGF

目的研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,AS)转染人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC)后对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导CTGF表达的抑制作用.方法采用脂质体转染试剂DOTAP,包裹针对CTGF的反义寡核苷酸转染HKC.用MTT比色法检测DOTAP对细胞增殖的影响,用荧光显微镜和荧光分光光度计检测5′异硫氰酸荧光素(5′FITC)标记的AS在细胞内的分布,用RT-PCR和免疫组化分别检测TGFβ1和AS对CTGFmRNA和蛋白表达的影响.结果MTT比色:不同浓度(0、3.3、6.7、10μl/ml)的DOTAP对细胞增殖的影响无明显差异(P＞0.05).荧光检测:DOTAP能高效地介导AS转染入HKC.RT-PCR和免疫组化:浓度为40μg/ml的TGFβ1能诱导HKC表达CTGFmRNA和蛋白,同时加入DOTAP-AS复合物后(DOTAP浓度为6.7μl/ml,AS浓度为1μg/ml),CTGFmRNA和蛋白的表达明显下降(P＜0.01).结论DOTAP能高效低毒地把CTGF反义寡核苷酸转染入HKC,进而能有效地封闭TGFβ1所诱导的CTGF表达.     

肝外胆管癌中TGF-β1, TGF-β2, TGF-β RI和TGF-β RⅡ的表达及意义

目的：探讨TGF－β1，TGF－β2，TGF－βRI及TGF－βRⅡ在肝外胆管癌中的表达及其与肿瘤的临床分期、病理分级的关系。方法：用抗TGF－β1，TGF－β2，TGF－βR I及TGF－βRⅡ的多克隆抗体，进行免疫组化染色，分别检测38例肝外胆管癌、14例非肿瘤胆管组织（8例胆总管囊肿、6例正常胆管)中TGF－β1，TGF－β2，TGF－βR I及TGF－βRⅡ的表达。结果：(1)TGF－β1及TGF－β2的阳性表达率增高（94．75％与92．11％）；TGF－βR I及TGF－βⅡ的阳性表达率明显降低（31．58％与28．95％）。（2）TGF－βRI，TGF－βRⅡ的阳性表达率在转移组中明显低于未转移组（12．5％，14．29％，33．33％对66．67％及18．75％，14．29％，0对58．33％）。结论：TGF－β1，TGF－β2，TGF－βRI及TGF－βRⅡ在肝外胆管癌中的异常表达，提示它们在肝外胆管癌的发生中起着重要作用，对其进行检测可作为肝外胆管癌的辅助诊断参考指标之一，并可为肝外胆管癌自然病程的判断和治疗方法的选择提供部分依据。     

基因转染3T3细胞的hTGFβ1表达

目的：鉴定重组pcDNA3.1-TGFβ1载体在真核细胞中的表达，为其在软骨组织工程中的基因转染创造条件。方法：利用脂质体Fugene6将GFβ1真核表达载体转染至NIH3T3细胞，RT-PCR、ELISA检测h TGFβ1基因的表达，并利用CCL/64细胞株鉴定重组hTGFβ1的生物学活性。结果：质粒转染3T3细胞后，hTGFβ1mRNA及其蛋白的表达均显著增强，且分泌表达的hT GFβ1能明显抑制CCL/64细胞的生长。结论：重组载体在3T3细胞中能表达具有一定生物学活性的hTGFβ1。     

人TGFβ1cDNA高表达重组质粒的构建

目的为了得到基因工程制备的人重组TGFβ1,构建人TGFβ;cDNA高表达重组质粒。方法从人血小板中提取总RNA,经RT－PCR得到TGFβ;cDNA基因,并克隆到表达质粒pBLMVL2中,构建了在PL启动控制基因表达质粒pBLMVL2－TGFβ;,使其在大肠杆菌中进行温敏诱导表达。结果RT－PCR得到的TGFβcDNA经DNA序列分析与文献报道一致,pBLMVL2－TGFβ1在大肠杆菌中表达产物人重组TGFβ1经还原型SDS－PAGE电泳,呈一条蛋白条带,分子量12．5kd,表达产物约占全菌蛋白20％。结论构建的重组质粒pBLMVL2－TGFβ1能高表达人重组TGFβ1。     

Rho／Rock 信号通路在 TGF －β1刺激大鼠颈内动脉平滑肌细胞表型转化中的作用及可能机制

目的：探讨Rho／Rock信号通路在TGF－β1刺激大鼠颈内动脉平滑肌细胞（ ISMC）表型转化中的作用及可能机制。方法 ISMC随机分为两组：空白对照组和TGF－β1刺激组,以不同浓度（1、5、10、20、50 ng／mL） TGF－β1刺激细胞24 h,用荧光实时定量PCR法检测转凝蛋白（ SM22α）和骨桥蛋白（ OPN） mRNA的表达;再以上述得出的最佳TGF－β1浓度刺激细胞,在不同时间（6、12、24、48 h）收集细胞,采用同样方法检测SM22α、OPN mRNA的表达水平;经无血清DMEM高糖培养基静止培养24 h后,随机分为以下各组：空白对照组、TGF－β1（10 ng／mL）刺激组及TGF－β1（10 ng／mL）＋法舒地尔（Fasudil）（10、30、50μmol／L）组,分别采用FQ－RT－PCR法检测SM22α、OPN、RhoA、Rock－1 mRNA的表达;Western blot法检测SM22α、OPN蛋白表达水平;根据实验结果用透射电镜观察各组细胞超微结构的相应变化。结果10 ng／mL TGF－β1刺激大鼠ISMCs 24 h达顶峰。 TGF－β1＋Fasudil组SM22αmRNA和蛋白表达水平较TGF－β1刺激组高（P＜0．01）,且在Fasudil浓度为30μmol／L时达到高峰,随后下降;TGF－β1＋Fasudil组OPN mRNA表达水平较TGF－β1刺激组低,呈浓度依赖性,至30μmol／L达最低（ P＜0．05）,后又呈上升趋势。 Western blot结果显示TGF－β1＋Fasudil组的OPN蛋白表达水平较TGF－β1刺激组低,至Fasudil浓度为30μmol／L达最低（ P＜0．05）。同时FQ－RT－PCR结果显示TGF－β1刺激组的RhoA和Rock－1 mRNA表达水平较空白对照组高（P＜0．01）,在Fasudil浓度为30μmol／L时TGF－β1＋Fasudil组的RhoA和Rock－1mRNA表达水平较TGF－β1刺激组低（ P＜0．05）。电镜下观察各组细胞显示,空白对照组（×20000） ISMC高尔基体肥大,线粒体及粗面内质网正常,10 ng／mL TGF－β1刺激后细胞内线粒体增多,在上述基础上加入30μmol／L Fasudil后电镜下观察细胞又回到正常成熟结构状态。结论10 ng／mL TGF－β1刺激大鼠ISMC 24 h可成功刺激其表型转化,且该过程可能通过Rho／Rock信号通路实现;Rho／Rock信号通路抑制剂Fasudil可增加TGF－β1刺激的SM22α的表达,下调OPN的表达水平,抑制大鼠ISMCs表型转化。     

MIP—1β，TGF—β抗体对人基质细胞支持的脐血CD34^＋细胞扩增的作用

目的：研究MIP－1β,TGF－β抗体对人基质细胞支持的脐血CD34^ 细胞扩增的作用。方法：免疫磁珠法分选脐血中CD34^ 细胞,接种到预先照射的基质层上。分为4组：MIP－1β（300ng/ml)组,TGF－β抗体（20μg/ml）组,MIP－1β TGF－β抗体（5μg／ml）组和对照组（不加细胞因子）。第5天半换液并加入MIP－1β,TGF－β抗体（20μg/ml）和MIP－1β＋TGF－β抗体（5μg/ml）。第10天结束培养。第5、10天收获细胞分别做细胞计数,集落培养法检测造血祖细胞数量,流式细胞术检测CD34^ 细胞数。结果：MIP－1β组第5、10天有核细胞数,造血祖细胞数,CD34^ 细胞数与对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。TGF－β抗体组（20μg/ml）及MIP－1β＋TGF－β抗体（5μg/ml）组第5天有核细胞数与对照组相比差异无显著性（P＞0.05）,第10天有核细胞数与对照组相比差异显著（P＜0.05）。第5、10天造血祖细胞数,CD34^ 细胞数与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。结论：与对照组相比,MIP－1β对人基质细胞支持的脐血CD34^ 细胞可在10d内扩增1－3倍。MIP－1β和TGF－β抗体间存在协同或相加作用。