人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术研究

目的：利用人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术（2-DE）建立正常精子的蛋白质图谱。方法：比较不同蛋白质提取方法和上样量、不同的第一向等点聚焦方法所得图谱的差别,并初步建立人类正常精子的蛋白质图谱。结果：用蛋白质提取方法一制得的样本电泳后有670-703个蛋白质斑点;方法二所得样本电泳后仅有194-210个蛋白质斑点。蛋白质提取方法一所制样本进行载体两性电解质pH梯度-SDS电泳技术（ISO-DALT）得到约280-300个蛋白质斑点,用固相pH梯度-SDS电泳技术（IPG-DALT）得到多达700个蛋白质斑点。结论：采用蛋白质提取方法一制备精子蛋白质进行IPG-DALT电泳的方法租用于建立精子全细胞蛋白质谱。     

子宫肌瘤蛋白质组研究中二维电泳方法的建立

目的:建立并优化用于子宫肌瘤蛋白质组分析的二维电泳技术,提高其分辨率和重复性.方法:以固相pH梯度等电聚焦为第一向,采用垂直十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向,并对关键步骤如样品的溶解、上样量、电泳参数和染色方法进行一系列的优化.结果:获得质量较好的子宫肌瘤和正常肌层的二维电泳图谱.结论:采用蛋白溶解度增强的裂解液分步提取组织的蛋白质,有利于二维电泳图谱的完整性;RC DC蛋白定量方法是二维电泳较为理想的蛋白定量方法,直接关系到上样量;质谱兼容银染法并不降低蛋白斑点的分辨率;窄范围(pH 4～7)的IPG胶条较宽范围(pH 3～10)的IPG胶条具有较高的分辨率.     

大肠侧向发育型肿瘤细胞株双向电泳技术成功建立

目的:建立侧向发育型肿瘤细胞(LST)株双向电泳技术.方法:提取LST细胞株总蛋白质,采用不同pH范围IPG胶条进行LST细胞株总蛋白质双向电泳,并对实验步骤进行一系列的调整优化.结果:获得了较为清晰的LST细胞株双向电泳图谱,采用pH 3～10线性IPG胶条分离出1356±43个蛋白质斑点;pH 4～7 IPG胶条两种上样量(250μg和150μg)分别分离出了1285±51和989个蛋白质斑点.结论:通过相关条件的调整优化,成功建立了双向电泳技术,为研究LST特殊性生物学行为相关蛋白质奠定了坚实的基础.     

二维凝胶电泳分离结核分枝杆菌胞外蛋白和膜蛋白

目的 :建立二维凝胶电泳分离结核分枝杆菌 (M .TB)胞外蛋白和膜蛋白的方法。　方法 :M .TBH37Rv菌株在苏通液体培养基培养 3周后获得胞外蛋白和膜蛋白 ,第一相电泳用 pH 3～ 10线性IPG预制胶条进行等电聚焦 ,第二相电泳用SDS PAGE凝胶再分离蛋白。银染PAGE凝胶、干燥 ,用ImageScanner扫描凝胶 ,ImageMaster 2DElite 3 .10 (图像分析软件 )分析 2D图像。　结果 :胞外蛋白和膜蛋白的蛋白质斑点数分别为 90 7和 681,两组蛋白的斑点大部分在酸性区域 (pH <7.0 )。在极碱性区域 ( pH >9.0 ) ,胞外蛋白只有 10个蛋白质斑点 (占1.1% ) ,而膜蛋白有 5 2个蛋白质斑点 (占 7.6% ) ;在极酸性区域 ( pH <4 .0 ) ,膜蛋白只有 15个蛋白质斑点 (占2 .2 % ) ,而胞外蛋白有 99个蛋白质斑点 (占 10 9% )。约 5 0 %的胞外蛋白和膜蛋白相对分子质量 <3 0 0 0 0。　结论 :二维凝胶电泳分离M .TB蛋白是研究M .TB蛋白质组学的重要途径之一。     

乳小鼠培养肝细胞蛋白质双向电泳技术的建立

目的 :建立培养乳小鼠肝细胞蛋白质的双向电泳技术。方法 :取乳小鼠肝脏组织 ,进行肝细胞原代培养 ,提取肝细胞蛋白 ,以固相pH梯度 (IPG)等点聚焦为第一向 ,垂直SDS -PAGE为第二向进行双向电泳 ,并对样品处理方式、蛋白上样量、IPG等电聚焦和SDS -PAGE电泳参数设置、凝胶浓度等关键因素和环节进行了比较研究。结果 :通过实验条件的筛选和优化获得了较满意的双向电泳图谱。结论 :本文建立乳小鼠双向电泳分离技术 ,具有较高的分辨率和重复性 ,为研究肝脏不同条件下特异性蛋白的表达及分子标记奠定了基础     

鼻咽癌细胞株HNE-1蛋白质二维电泳图谱的建立

目的建立及优化聚丙烯酰胺二维凝胶电泳技术,结合分析软件,全面展示鼻咽癌细胞株HNE-1的蛋白质表达谱,为进一步开展鼻咽癌的蛋白质组学研究奠定了基础。方法大规模培养HNE-1细胞,利用优化的蛋白质抽提技术获得HNE-1细胞的总蛋白。选用线性及非线性的不同pH梯度固相(IPG)干胶条对细胞总蛋白等电聚焦以及聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,初步建立了HNE-1细胞株总蛋白质的二维电泳(2-DE)图谱。结果采用不同pH梯度范围的IPG胶条和优化的2-DE技术能够有效展示HNE-1细胞全蛋白质表达谱。结论重叠窄pH梯度范围的IPG胶条提高了2-DE中蛋白质的分离效果。     

鼻咽癌细胞株HNE-1蛋白质二维电泳图谱的建立

目的 建立及优化聚丙烯酰胺二维凝胶电泳技术，结合分析软件，全面展示鼻咽癌细胞株HNE—1的蛋白质表达谱，为进一步开展鼻咽癌的蛋白质组学研究奠定了基础。方法 大规模培养HNE—1细胞，利用优化的蛋白质抽提技术获得HNE—1细胞的总蛋白。选用线性及非线性的不同pH梯度固相(IPG)干胶条对细胞总蛋白等电聚焦以及聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，初步建立了HNE—1细胞株总蛋白质的二维电泳(2—DE)图谱。结果 采用不同pH梯度范围的IPG胶条和优化的2—DE技术能够有效展示HNE—1细胞全蛋白质表达谱。结论 重叠窄pH梯度范围的IPG胶条提高了2—DE中蛋白质的分离效果。     

结肠癌蛋白质双向电泳技术的建立

目的:建立结肠癌双向电泳技术.方法:利用不同体积的裂解液提取结肠癌中的蛋白质,并通过不同的蛋白质上样量(1mg,2mg,3mg),不同样品制备方式,进行双向电泳,考马斯亮蓝染色,图谱分析.结果:在等电点3～10,分子量6.5～200ku范围内分离得到蛋白质斑点为,1mg蛋白质上样量为658个蛋白质斑点,2mg为820个,3mg为845个斑点.2mg蛋白质上样量的双向电泳图谱更清晰,分离更好.制备方式2可以满足双相电泳的需要.结论:成功建立了结肠癌蛋白质的双向电泳技术.     

人白细胞蛋白质的提取及双向电泳分析

目的 :建立人白细胞蛋白质提取及双向电泳分析方法 ,为构建白细胞在不同生理或病理条件下的蛋白质表达谱或进行蛋白质表达的差异分析奠定基础。方法 :取人全血 ,分离白细胞 ,提取蛋白质 ,双向电泳分离 ,考马斯亮蓝R - 2 5 0染色获得蛋白质的电泳分离图谱 ,利用PDQuest2D分析软件进行图像分析 ,结合SWISSSPORT蛋白质数据库对白细胞蛋白质斑点进行初步鉴定。结果 :所得双向电泳图谱中各点分离清晰 ,无明显横向或纵向拖尾 ,分析显示图谱上有 2 12个蛋白质斑点 ,主要集中在pH4 .75～ 6 .81之间 ,其中高丰度蛋白斑点有 36个点 ,低丰度的蛋白质斑点约 176个 ,对其中 6个高丰度蛋白质斑点初步鉴定可知这些蛋白质为 :CAN2 (MW :77975 .95pI:4 .84 )、I17R(MW :94 4 15 .6 3pI:4 .90 )、CARF(MW :5 130 2 .6 5pI:5 .82 )、FIG1(MW :6 8184 .0 6pI:6 .2 9)、PIGR(MW :82 96 9.32pI:5 .2 2 )、F16P(MW :36 781.2 8pI:6 .18)。结论 :本实验建立了人白细胞蛋白质的双向电泳分析方法 ,图谱分离、染色效果好 ,能满足 2 -DE专业软件分析的要求 ,为后续白细胞的蛋白质组研究奠定了基础。     

微波辐射后晶状体上皮细胞与未辐射晶状体上皮细胞蛋白质组双向电泳图谱比较

[目的]比较正常晶状体上皮细胞与微波辐射后晶状体上皮细胞蛋白质组双向电泳图谱差异,从蛋白质组水平初步探索微波辐射对人眼晶状体的损伤。[方法]体外培养人晶状体上皮细胞株,随机分为实验组和对照组,实验组用SAR值为4.0 W/kg的1800 MHz制式微波辐照2 h,对照组同一辐射箱培养但不辐射。辐照后立即提取总蛋白质,固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向凝胶电泳进行蛋白质分离,银染显色的凝胶通过GS-800扫描仪获取图像,使用PDQuest专业图像分析软件分析电泳图像。[结果]正常晶状体上皮细胞与微波辐射后晶状体上皮细胞分别检出897个和981个蛋白质斑点。对2张电泳图进行匹配后,发现有4个蛋白质点在辐射后细胞蛋白质组图谱中上调表达,3个蛋白质点下调表达。[结论]初步建立了人晶状体上皮细胞比较蛋白质组学的实验方法;差异蛋白质的发现为深入理解辐射性白内障发病机制提供了有益的线索。     

肺癌组织蛋白质组双向凝胶电泳方法的建立和优化

目的建立和优化肺癌组织蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术,获取高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱。方法提取肺癌组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为第二向,在上述过程中分别对蛋白提取、等电聚焦电泳和凝胶染色进行控制和优化,利用ImageMaster 2Dplatinum 6.0分析软件获得二维凝胶图像。结果实验重复3次,共获15幅二维凝胶图像,平均蛋白质点数为1 137±57;随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅图像中蛋白点进行匹配,匹配率为90.4%。结论优化肺癌组织蛋白质组2-DE技术可获得高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱,为开展肺癌组织蛋白质组学研究打下基础。     

血清双向凝胶电泳体系的建立

目的:建立血清双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)技术体系.方法:用Proteoprep blue albumin depletion kit将血清中高峰度蛋白去除.预冷丙酮沉淀蛋白质后,加入样品溶解液充分溶解,进行等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elecrophoresis,SDS-PAGE),行硝酸银染色后,运用ImageMaster软件行初步分析.结果:通过调整,优化2-DE技术条件,建立了稳定的2-DE技术.结论:建立了相对稳定的人血清蛋白质2-DE技术,其稳定性、重复性好,为开展疾病蛋白质组学的研究奠定了基础.     

脑脊液双向电泳技术体系的建立

目的:建立用于脑脊液(CSF)蛋白分离的双向电泳(2-DE)技术体系,寻找多发性硬化患者和对照组脑脊液蛋白质差异,从分子水平探讨多发性硬化患者脑脊液蛋白整体变化规律。方法:分别取对照组及多发性硬化患者的脑脊液,用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质后,加入适量裂解液使蛋白质充分裂解,离心后取上清液上样。进行第1向等电聚焦(IEF)电泳和第2向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),染色脱色后,分析所得蛋白质斑点。结果:对照组和多发性硬化患者脑脊液2-DE图谱上均可得到近200个蛋白质斑点,其中2个蛋白质在多发性硬化患者脑脊液中含量增加,4个蛋白质在多发性硬化患者脑脊液中含量减少,12个蛋白质斑点为多发性硬化患者脑脊液特有。结论:对照组和多发性硬化患者脑脊液的双向电泳图谱存在明显差别,这些发现可为研究多发性硬化疾病机制提供线索。     

HeLa细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的:建立和优化HeLa细胞蛋白质组分析所需的样品处理方法和双向电泳技术.方法:用三种不同配方的裂解液提取HeLa细胞中的蛋白质,进行双向凝胶电泳,用Amersham ImageMaster VDS-CL型凝胶成像系统获取凝胶图像,以PDQuest(7.4.0)软件进行比较分析.结果:联合使用硫脲和尿素有利于蛋白质的提取,增加碱性蛋白点的检出数量;广谱蛋白酶抑制剂的使用可大大增加双向电泳可检出的蛋白点数,同时使可检出的碱性蛋白点明显增加.结论:本文建立了HeLa细胞双向电泳分析方法,提高了2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性,获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱,为其蛋白质组学进一步研究奠定了基础.     

两种样品制备方法对血清蛋白质双向凝胶电泳分离效果的影响

目的 评价两种样品制备方法对血清蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)分离效果的影响,建立高分辨率、高重复性的血清2-DE图谱,为鉴定疾病相关血清蛋白质奠定基础.方法 分别用热SDS法和直接溶解法处理大肠癌血清样品,采用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离总蛋白质,图像软件分析后,对其中3个差异蛋白质点行基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱鉴定.结果 应用热SDS法处理血清总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人血清双向电泳图谱.对直接溶解和热SDS法处理的蛋白样品进行3次重复性检测,凝胶的平均蛋白质点数为675±46和702±49,平均匹配点数为573±42和623±52,匹配率为85.3%和89.6%,分析3块不同胶间蛋白质点在IEF方向的位置偏差为(0.85±0.30)mm和(0.81±0.28)mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为(1.02±0.18)mm和(0.97±0.12)mm.热SDS处理的2-DE胶蛋白质点质谱可获得高质量质谱图,并可以检测到相对低丰度的血清蛋白质.结论 热SDS法是一种更有效的血清蛋白质样品制备方法,我们利用热SDS法处理血清样品建立了分辨率较高且重复性好的人血清蛋白质双向凝胶电泳图谱.     

鼻息肉的2-DE图谱建立和蛋白质组学分析

目的:建立鼻息肉及鼻黏膜双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)图谱,鉴定差异表达蛋白质。方法:收集鼻息肉及鼻黏膜样本各7例,采用固相pH梯度2-DE,凝胶银染,扫描图像,ImageMaster2-DE软件比较分析等方法,识别差异表达蛋白质,通过质谱分析得到相应肽质指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF),采用PeptIdent软件查询Swiss-Protand TreMBL数据库,鉴定差异表达蛋白质。结果:建立了鼻息肉和鼻黏膜蛋白质的2-DE图谱。鼻息肉和鼻黏膜3块凝胶的平均蛋白质点数分别为825±78和936±62;平均匹配点数为682±96和821±78,匹配百分率为82.7%和87.7%;同一鼻息肉的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在等电聚焦(IEF)方向偏差为(1.06±0.14)mm,在SDS-PAGE方向偏差为(1.45±0.21)mm。比较分析两种组织各7例样本的2-DE图谱,鼻息肉和鼻黏膜蛋白质点数为1458个和1617个,平均匹配点数为1026个。质谱分析差异蛋白质点40个,获取34张PMF,查询数据库鉴定出蛋白质24个。结论:建立了分辨率高和重复性好的鼻息肉及鼻黏膜2-DE图谱,识别鉴定出一些与鼻息肉病变相关的蛋白质。     

人支气管上皮蛋白质样品制备方法及其癌变各阶段组织2-DE图谱的建立

目的： 改良、优化支气管上皮组织的蛋白质样品制备方法,建立人支气管上皮癌变过程各阶段组织的2-DE图谱,为识别鉴定肺鳞癌癌变相关蛋白质奠定基础。方法：收集、筛选人支气管正常上皮、鳞状化生、不典型增生和上皮浸润癌组织标本。改良的脱氧胆酸-三氯醋酸(deoxycholate-trichloroaetic acid,DOC-TCA)法提纯支气管上皮总蛋白质,应用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各阶段组织的总蛋白质,凝胶经银染显色后,用ImageMaster 2D软件分析双向电泳图谱。结果：应用改良的DOC-TCA法提纯的支气管上皮总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人支气管上皮组织的双向电泳图谱。正常上皮、鳞状化生、不典型增生和浸润癌4种组织凝胶的蛋白质点数依次为1 190±63,1 227±69,1 272±71,1 326±82。选取同例鳞状上皮化生组织进行3次重复性检测,3块凝胶的平均蛋白质点数为1 216 ±75 ,平均匹配点数为1 082±67,匹配率达 89.3% , 且3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0.835±0.247） mm ,在SDS-PAGE方向上的偏差为（0.921±0.104） mm。结论：改良的DOC-TCA沉淀法是一种较好的支气管上皮组织蛋白质样品制备法,初步建立了分辨率较高且重复性好的人支气管上皮癌变各阶段组织的双向凝胶电泳图谱。     

重症肌无力胸腺组织蛋白质组双向电泳方法的建立

目的:建立和优化重症肌无力(MG)胸腺组织蛋白质组双向电泳技术方法.方法:提取MG患者(n=3)增生型胸腺组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳为第二向.在以上过程中分别对蛋白提取、等电聚焦程序(A、B、C、D)和凝胶染色方法等各个实验环节进行控制和优化,利用PDQuest 7.1.1软件分析获得的二维凝胶图像.结果:①采用一步法提取胸腺组织蛋白质,第一向等电聚焦采用7cm IPG胶条,聚焦程序选择B,硝酸银染色.3例标本重复4次,共获12幅二维凝胶图像.随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅中的蛋白点进行匹配,匹配率为82.1%;3份样品共12幅凝胶图像的对比,获得3个共同存在的标志蛋白点,相对分子质量和等电点分别为:A点(82 700,7.0)、B点(50 700,5.76)和C点(33 300,5.02).②进一步优化上述实验条件,选择1例标本,采用两步法提取胸腺组织蛋白质,选用17 cm IPG胶条,聚焦采用程序D,考马斯亮蓝染色,获得的二维凝胶图像与一步法(其他条件相同)比较.一步法可检测到蛋白质点326个,两步法可检测到562个蛋白点.结论:①建立了MG胸腺组织蛋白质组提取的方法.采用两步法可以更有效地提取胸腺组织蛋白质组.②利用优化后的实验方法,获得了MG胸腺组织蛋白二维凝胶图像,为开展MG胸腺组织蛋白质组学研究打下了基础.     

Differential analysis of two-dimensional gel electrophoresis profiles of spermatozoa protein in human normal motility sperm and idiopathic asthenospermia

Objective: To evaluate the application of two-dimensional electrophoresis in the research of differentially expressed proteins in the human asthenospermia. Methods: Two-dimensional gel electrophoresis was performed on 4 normal sperm samples from healthy men and 4 sperm samples from 4 asthenospermia patients. After silver staining, the differential expression proteins were analyzed by PDQuest 2D analysis software. Results: Six differential protein spots were identified. Four spots showed increased expression in the control gels compared with the patient gels. Conclusion: The protein profiles of differential expression between the normal spermatozoa and idiopathic asthenospermia were established and some differential proteins were found. The data of this study would establish the better fundament for further isolation and identification of differentially expressed proteins in human asthenospermia sperm.