龟鹿二仙胶汤含药血清对兔体外BMSCs向软骨细胞分化的干预作用

目的:探讨龟鹿二仙胶汤含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化的干预作用。方法:抽取兔骨髓液,经体外分离、纯化、培养获得兔BMSCs,将第2代兔BMSCs分为龟鹿二仙胶汤中药含药血清组、软骨细胞组、单纯诱导剂组及空白对照组,进行培养1、2、3周后,通过细胞染色、透射电子显微镜、免疫组化等实验技术,观察各组对BMSCs诱导成软骨细胞的影响。结果:在转化生长因子-β(3TGF-β3)等诱导下龟鹿二仙胶汤中药血清可以明显促进软骨表型化BMSCs的GAG分泌及Ⅱ型胶原mRNA的表达,与软骨细胞组和单纯诱导剂组有显著性差异(P<0.01)。结论:龟鹿二仙胶汤含药血清可促进BMSCs向软骨细胞转化,优化骨组织工程的种子细胞体系,改善软骨组织的质量,延缓软骨的退化过程。     

透骨消痛胶囊含药血清对退变关节软骨细胞表达TNF-α、IL-1β的影响

目的观察透骨消痛胶囊含药血清对体外培养的大鼠退变软骨细胞表达肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）的影响,探讨透骨消痛胶囊防治骨性关节炎的作用机制。方法 4周龄SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,采用Ⅱ型胶原原位杂交法对第3代软骨细胞进行鉴定。用10 ng.mL-1IL-1β干预第3代软骨细胞复制退变软骨细胞模型。模型复制成功后,随机分为模型组和透骨消痛胶囊含药血清组,分别在培养24、48、72 h后用TaqMan real-time PCR法检测各组mRNA表达。结果透骨消痛胶囊含药血清组TNF-αmRNA、IL-1βmRNA相对表达量随着干预时间的延长逐渐下降,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论透骨消痛胶囊治疗骨性关节炎的部分作用机制是有效抑制退变软骨细胞TNF-α、IL-1β的表达。     

透骨消痛胶囊含药血清对退变软骨细胞表达caveolin-1、p38MAPK的影响

目的观察透骨消痛胶囊含药血清对体外培养大鼠退变软骨细胞表达caveolin-1、p38MAPK的影响,探讨透骨消痛胶囊防治骨性关节炎的作用机制。方法 4周龄SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,采用Ⅱ型胶原原位杂交法对第3代软骨细胞进行鉴定。用10 ng/mL IL-1β干预第3代软骨细胞复制退变软骨细胞模型。模型复制成功后,随机分为模型组和透骨消痛胶囊含药血清组,分别在培养24 h、48 h、72 h后用TaqMan real-time PCR和Western Blot法检测各组mRNA和蛋白的表达。结果透骨消痛胶囊含药血清组caveolin-1和p38MAPK基因、蛋白相对表达量随着干预时间的延长逐渐下降,统计均有显著性差异(P0.05)。结论透骨消痛胶囊治疗骨性关节炎的部分作用机制是有效抑制退变软骨细胞caveolin-1、p38MAPK的表达。     

Effect of Serum Containing Tougu Xiaotong Capsule on Activity of Chondrocyte

目的 观察透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞活性的影响. 方法 SD大鼠膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,第3代软骨细胞同步化后进行干预,分别确定含药血清的有效干预时间及干预浓度.各组合药血清在有效浓度作用下干预软骨细胞,在有效干预时间点采用MTT法. 结果 干预后,软骨细胞OD值干预72 h明显高于干预24 h、48 h、96 h(P＜0.05);10％含药血清浓度组明显高于5％、20％含药血清浓度组(P＜0.01).确定72 h为有效作用时间,10％为有效作用浓度.在10％含药血清浓度的作用下干预72 h,第3代软骨细胞OD值,透骨消痛胶囊实验组明显高于空白组(P＜0.01),实验2组增殖效果最明显(P＜0.05). 结论 透骨消痛胶囊含药血清能加速软骨细胞增殖,维持软骨细胞活性,其促进软骨细胞增殖作用与药物浓度有关,以中剂量药物浓度(含透骨消痛胶囊29 mg/d)为最佳.     

透骨消痛颗粒对兔软骨细胞周期的影响

目的 观察透骨消痛颗粒对兔软骨细胞周期的影响. 方法 采用流式细胞仪检测透骨细胞颗粒干预后兔软骨细胞周期的变化. 结果 含药血清能够刺激软骨细胞由G0/G1期进入S期和G2/M期,干预48 h后,G0/G1期细胞比例降低,S期与G2/M期细胞之和增加,与空白组比较有显著性差异(P＜0.05). 结论 透骨消痛颗粒含药血清能有效地促进软骨细胞的增殖.     

透骨消痛胶囊对TNF-α诱导关节软骨细胞Rho/Rock信号通路的影响

目的观察透骨消痛胶囊对TNF-α诱导体外培养大鼠关节软骨细胞Rho/Rock信号通路的影响,探讨其防治骨性关节炎的作用机制。方法采用4周龄SD大鼠膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,选取第3代软骨细胞进行实验,20 ng/mL的TNF-α诱导体外培养软骨细胞的凋亡,诱导成功后,给予透骨消痛胶囊(500、100、20μg/mL)孵育24 h后,用流式细胞仪检测软骨细胞Annexin-Ⅴ观察细胞凋亡情况,采用RT-PCR和Western Blot测定各组软骨细胞RhoA、Rock1和PKN等mRNA和蛋白表达。结果 TNF-α组细胞凋亡明显增多,透骨消痛胶囊各组能减少软骨细胞的凋亡,TNF-α组的RhoA、Rock1、PKN、MKK3、ERK6、Cbfα1等mRNA和蛋白表达较空白组上升,而透骨消痛胶囊各组对RhoA/Rock信号传导通路关键信号分子RhoA、Rock1、PKN及Cbfα1等的mRNA和蛋白的表达有抑制,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论透骨消痛胶囊可减轻TNF-α所致的软骨细胞凋亡,其机制可能与抑制软骨细胞的RhoA/Rock信号通路有关。     

补肾行气活血法对骨髓基质干细胞诱导成软骨细胞作用的影响

[目的]观察补肾行气活血法对诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)成软骨细胞作用的影响.[方法]将传至第3代的BMSCs分为阴性对照组和治疗组,分别采用软骨细胞诱导培养基加体积分数为10%的空白对照血清和诱导培养基加体积分数10%的骨炎定含药血清培养诱导成软骨细胞,观察软骨细胞的生长状况及细胞表型特征.[结果]治疗组在细胞贴壁、生长形态及成软骨特性方面明显优于对照组,细胞表型的免疫组化染色均为阳性.[结论]以补肾行气活血法为组方依据的骨炎定含药血清既可促进BMSCs的增殖,又可促进诱导的软骨细胞分化.     

透骨消痛胶囊干预膝骨性关节炎早期COX-2炎症途径的实验研究

目的探讨透骨消痛胶囊对膝骨性关节炎早期COX-2炎症途径的影响,从炎症途径阐明透骨消痛胶囊治疗膝OA的作用机制。方法改良Hulth法建立骨关节炎动物模型,随机分为6组,模型组、对照组(壮骨关节丸组)、实验Ⅰ组(透骨消痛胶囊低剂量组)、实验Ⅱ组(透骨消痛胶囊中剂量组)、实验Ⅲ组(透骨消痛胶囊高剂量组)及正常组,灌胃给药4周后处死动物取材,行关节内COX-2、PGE2浓度检测。结果骨性关节炎关节局部表达COX-2,透骨消痛胶囊可降低关节液中PGE2含量以及滑膜、软骨中COX-2水平,其中透骨消痛胶囊中剂量组及高剂量组作用更明显,与透骨消痛胶囊低剂量组及对照组比较有显著差异(P<0.05),但两者之间无显著差异。结论关节局部COX-2是引起膝骨性关节炎的重要介质。透骨消痛胶囊通过抑制OA早期滑膜和软骨细胞中COX-2的表达及其诱导产物PGE2的生成,从而达到控制OA早期炎症、缓解疼痛、减轻症状的目的 。     

人骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞过程中免疫原性改变的实验研究

目的 探讨人骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）诱导分化成软骨细胞过程中协同刺激分子的表达及其对细胞免疫原性改变的影响。方法 用密度梯度离心法分离骨髓,体外培养BMSCs,经形态学观察、流式细胞仪鉴定后诱导成软骨样细胞,用流式检测细胞表面协同刺激分子的表达情况;将未分化的BMSCs及诱导后的成软骨样细胞分别与T细胞共培养,采用3H-TdR法检测T细胞的增殖情况。结果 人BMSCs不表达或低表达协同刺激分子CD28、CD80、CD83、CD86,抑制T细胞增殖;而诱导后的成软骨细胞上调表达CD28、CD80、CD83、CD86,并促进T细胞增殖。结论 人BMSCs对T细胞增殖有抑制作用;而诱导后的成软骨细胞免疫原性增强,促进T细胞增殖。     

左归丸含药血清对间充质干细胞向软骨分化过程中骨粘连蛋白基因表达的影响

目的 研究左归丸含药血清对间充质干细胞向软骨分化过程中骨粘连蛋白基因(SPARC)表达的影响.方法 诱导间充质干细胞向软骨分化,诱导同时以左归丸含药血清刺激细胞.分别在在o、7、14、21d通过Real-time PCR检测左归丸含药血清对诱导前后SPARC mRNA表达的影响.构建SPARC启动子报告载体并转染骨髓间质细胞系,双荧光素酶试剂盒检测左归丸含药血清SPARC启动子转录活性的影响.结果 与空白对照组和单纯诱导组相比,在诱导第21天时,左归丸能明显促进诱导细胞中SPARC mRNA的表达(P＜0.05).与空白组比,当予以左归丸含药血清刺激后,SPARC基因启动子转录活性能增强近1倍(P＜0.05).结论 左归丸含药血清能促进间充质干细胞向软骨分化过程中SPARC基因表达,可能主要是通过增强SPARC基因转录活性.     

体外诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）在特定培养条件下向软骨细胞定向分化的情况。方法密度梯度离心法分离兔BMSCs，在体外培养扩增后用含有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP)-2的条件培养液诱导其在体外单层培养模式下向软骨细胞分化。采用甲苯胺蓝染色、Masson染色、免疫组织化学染色、阿利新蓝比色法测定糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）的含量检测BMSCs分化情况。统计学分析比较第2、4、7代（P₂、P₄、P₇）BMSCs诱导后增殖能力及向软骨细胞分化能力的变化。结果定向诱导后BMSCs表现出软骨细胞的特性。P₂、P₄间的细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力比较差异无统计学意义（P＞0.05）；P₇与P₂、P₄相比，细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论BMP-2能诱导兔BMSCs在体外单层培养模式下向软骨细胞分化；细胞传代对BMSCs向软骨细胞分化有重要影响。     

骨形态反应蛋白-2对骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养向软骨细胞分化的影响

目的研究细胞因子骨形态反应蛋白-2(BMP-2)与软骨细胞共同诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化是否有协同作用,并检测BMP-2对BMSCs和软骨细胞共培养诱导分化为软骨细胞的最佳浓度。方法将体外分别培养扩增的兔BMSCs和软骨细胞按相同的比例(7∶3)混合后,均以5.0×107.mL-1的细胞浓度接种混合培养,根据不同的BMP-2浓度分为以下几组,5、10、20、30、40、50 ng/mL组,以单独培养的软骨细胞作为阳性对照组,以单独培养的BMSCs作为阴性对照组,以混合培养后不加BMP-2作为0 ng/mL组。通过MTT、Ⅱ型胶原蛋白表达以及糖胺聚糖蛋白表达的检测,确定BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs是否有协同作用及促进BMSCs向软骨细胞转化的最佳BMP-2浓度。结果单独培养BMSCs的阴性对照组向软骨细胞分化的倾向不明显,而与软骨细胞混合培养的0 ng/mL组软骨细胞增多,添加BMP-2的5、10、20、30、40、50 ng/mL组向软骨细胞分化更加明显。结论 BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs对于其向软骨细胞分化有协同作用,BMP-2的最佳作用浓度为20 ng/mL。     

In vitro chondrogenesis of the goat bone marrow mesenchymal stem cells directed by chondrocytes in monolayer and 3-dimetional indirect co-culture system

Background  Cartilage injury has a very poor capacity for intrinsic regeneration. The cell-based treatment strategy for the cartilage repair using differentiated bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) is, however, a promising approach to the chondral repair. This study was aimed to explore the chondrogenic potential of the goat BMSCs in the Transwell co-culture system and the poly-laetide-co-glycolide (PLGA) scaffolds.

Methods  The BMSCs were isolated from the goat iliac crest while the chondrocytes were obtained from the goat’s last costal cartilage. In the Transwell co-culture system, the BMSCs co-cultured with chondrocytes were designed as group A, whereas the goat’s BMSCs induced with the chondrogenic medium were group B. Both groups A and B were the experimental groups, while group C that only contained BMSCs was the control group. In the PLGA scaffolds co-culture system, BMSCs were seeded into the PLGA scaffolds, which were suspended in the 24-well plate, and the control group was established by presence or absence of chondrocytes at the bottom of the 24-well plate. Toluidine blue staining, Alcian blue staining, collagen II immunofluoresence, collagen II immunochemical staining, collagen I, collagen II, COL2a Q-PCR and osteopontin Q-PCR were used to examine the chondrogenic conditions as well as the expressions of chondrogenic and osteogenic genes.

Results  Cells isolated from the aspirates of the goat bone marrow proliferated rapidly and gained characteristics of stem cells in Passage 4. However, the differentiations of chondrocytes were not apparent in Passage 3. The results from Toluidine blue staining, collagen II immunofluoresence and PCR showed the transformation of BMSCs to chondrocytes in the Transwell co-culture system and PLGA scaffolds. Although the cartilage gene expressions were upgraded in both chondrogenesis group and co-culture system, the osteopontin gene expression, which represents osteogenic level, was also up-regulated.

Conclusions  The Transwell co-culture system and the PLGA scaffolds co-culture system can promote the chondrogenic differentiation of the goat’s BMSCs, while up-regulated osteopontin gene expression in the Transwell co-culture system implies the osteogenic potential of BMSCs.

     

诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外诱导成软骨细胞的生物学特性，为骨组织工程提供实验依据。方法体外培养获取生长状态良好的兔骨髓间充质干细胞，进行成软骨诱导，观察并检测其生物学特性。结果BMSCs在转化生长因子-β1、维生素C的作用下，7d后可见细胞多变为圆形或椭圆形，并聚集形成软骨样结节，阿利辛蓝染色、蕃红花“O”-亮绿染色显示细胞内酸性粘多糖含量高，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，PCR检测有Ⅱ型胶原的表达，表现出软骨细胞的分化特点。结论在特定诱导条件下，兔BMSCs体外可定向诱导分化为软骨细胞，为骨组织工程提供实验依据。     

犬骨髓基质千细胞向软骨样细胞诱导分化的条件研究

目的研究犬骨髓基质干细胞在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的最佳条件。方法从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF．B1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。结果原代培养的基质干细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF．131）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。结论犬骨髓基质干细胞在体外培养在碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF—β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

甲状腺素在骨髓间充质干细胞成软骨诱导过程中的作用

目的探讨甲状腺素在诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)软骨形成的作用。方法在两种条件培养基中培养和诱导猪BMSCs,对照组用成软骨培养基(含10-7 mol/L地塞米松和10 ng/mL TGFβ1),甲状腺素(T3)用成软骨培养基加100 nmol/L T3。MTT法检测BMSCs单层增殖情况。4周后取两组BMSCs Pellets,进行组织学染色和半定量基因表达分析。结果T3组BMSCs增殖明显高于对照组(P˂0.05)。T3组BMSCs Pellets形成典型软骨陷窝样结构,甲苯胺蓝染色阳性,并且优于对照组(P˂0.05)。与对照组相比,T3组第4周软骨生成标志基因Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)和性别决定基因9(SOX9)的表达显著升高(P˂0.05),肥大标志基因Ⅹ型胶原(Col-Ⅹ),基质金属蛋白酶13(MMP13)基因的表达显著升高(P˂0.05),成骨基因Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ),Runt相关转录因子2(RUNX2)表达在两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲状腺素可促进间充质干细胞的增殖和软骨形成,同时诱导间充质干细胞分化的软骨细胞肥大,这些结果为研究软骨组织工程的诱导方案提供了有益的线索。     

Wnt3a在大鼠骨髓源性胆碱能神经元中的表达

目的 通过研究大鼠骨髓基质细胞诱导的胆碱能神经元中Wnt3a的表达变化,了解Wnt3a在胆碱能神经元诱导分化过程中的作用,揭示神经元分化过程中可能的信号通路.方法 取Wistar雄性大鼠的股骨骨髓,培养骨髓基质细胞,经三代纯化CD71免疫细胞化学鉴定后进行分组实验.实验共分四组:骨髓基质细胞组,未加任何诱导因子;胆碱能神经元诱导分化组,加入Shh,RA和bFGF诱导基质细胞向胆碱能神经元分化,并用ChAT鉴定胆碱能神经元;神经干细胞诱导组,加入bFGF、EGF和RA诱导基质细胞为神经干细胞;自然分化组,加入血清诱导分化.提取细胞总RNA,利用RT-PCR进行Wnt3a的半定量分析.结果 与对照的骨髓基质细胞组,神经干细胞诱导组及自然分化组相比,Wnt3a在胆碱能神经元组中表达最高并且有统计学差异.结论 Wnt3a在骨髓基质细胞来源的胆碱能神经元中高表达,提示Wnt3a可能是胆碱能神经元分化的Wnt信号通路中的一个环节.     

共培养大鼠内皮祖细胞对白体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）与自体骨髓基质细胞（BMSCs）共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离、培养大鼠BMSCs和EPCs,培养细胞分为四组：A组（BMSCs组）、B组（EPCs组）、C组（BMSCs成骨诱导组）及D组（BMSCs和EPCs联合培养组）。通过观察细胞克隆形态、免疫细胞化学、细胞增殖、碱性磷酸酶活性,从酶学、组织学及生化等不同方面观察EPCs对BMSCs成骨活性及生长情况的影响。结果免疫细胞化学染色证实C组培养的细胞具有晚期EPCs的特性。倒置相差显微镜、HE染色均证实共培养的BMSCs和EPCs生长良好,并能够形成与单纯成骨诱导培养的BMSCs相似的钙结节。MTr检测结果：各组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）。碱性磷酸酶活性检测结果：C、D组显著高于A、B组（P〈0．05）。结论EPCs和BMSCs联合培养具有良好的细胞相容性,EPCs能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。