腺病毒5型E1A基因转染前后乳腺癌细胞相关指标水平的变化

目的 本研究旨在探讨E1A基因对乳腺癌细胞凋亡的影响，为乳腺癌E1A基因治疗的可行性提供理论和实验依据。方法 ①构建E1A基因真核表达质粒pEGFP-E1A：通过酶切反应获得E1A基因，琼脂糖凝胶回收后，连接入pEGFP-C1载体EcoR Ⅰ和BamHⅠ位点中。②E1A基因转染乳腺癌细胞系：脂质体介导将E1A基因转入乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞株，经筛选获得稳定表达E1A基因的转染试验组细胞。③RT-PCR检测E1A基因的mRNA表达、west—ern-blot检测E1A蛋白表达。流式细胞仪观察细胞凋亡率、免疫组化法检测HER-2／neu基因的表达水平，对比各组间的差异。结果 与对照组、空载体组相比，转染E1A基因后，E1ARNA和蛋白表达明显增高。SK-BR-3肿瘤细胞HER-2／neu的表达明显降低，凋亡率增高。结论 本实验成功构建并稳定表达了E1A基因质粒，明显抑制乳腺癌细胞的生长，说明E1A基因在乳腺癌基因治疗中有重要意义，为其临床应用提供了理论和实验依据。     

病理性瘢痕组织中E2F1基因的表达及其意义

目的：检测E2F1基因在病理性瘢痕组织中的表达，以正常皮肤和正常瘢痕组织作对照，初步探讨E2F1在病理性瘢痕形成中的生物学作用。方法：应用RT—PCR方法检测正常皮肤，正常瘢痕，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中E2F1mRNA的水平。结果：增生性瘢痕、瘢痕疙瘩组织中E2F1mRNA水平显著高于正常皮肤、正常瘢痕组织，有统计学意义（P〈0．01）。结论：E2F1基因在病理性瘢痕组织中增高，促进瘢痕组织中修复效应细胞的增生，对病理性瘢痕的形成可能起着重要作用。     

苯乙酸对胶质瘤细胞HOXA1-A4基因mRNA表达的影响

目的观察苯乙酸（PA）诱导分化胶质瘤细胞C6过程中，同源盒基因HoxA1，A2，A3和HoxA4基因mRNA水平表达的变化。方法应用逆转录PCR（RT-PCR）及图像分析法，分组检测原代培养的大鼠星形胶质细胞及应用PA前后胶质瘤细胞C6中HoxA，A2，A3和HoxA4基因mRNA水平表达。结果HoxA1和A4基因在正常大鼠脑组织中弱表达，在胶质瘤C6细胞中存在明显表达；HoxA2基因在正常大鼠脑组织中未见表达，在胶质瘤C6细胞中存在明显表达；HoxA3基因在正常大鼠脑组织和应用PA前后的胶质瘤C6细胞中，均存在明显表达。应用PA处理后，胶质瘤C6细胞中HoxA1、A2基因未见表达，与未用药的C6细胞比较，图象分析显示差异有显著性（P〈0．01）；应用PA处理后，HoxA3、A4基因明显表达，与未用药的C6细胞比较，图象分析显示差异没有显著性（P〉0．05）。结论苯乙酸抑制胶质瘤细胞增殖的作用机理可能与降低胶质瘤细胞HoxA1和HoxA2基因mRNA水平表达有关。     

小鼠腭裂相关基因的克隆及基因表达的意义

目的：筛选外克隆正常组小鼠腭突与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因，探讨它们在腭裂发生过程中表达的意义。方法：建立C57BL／6N小吸腭裂模型，分别提取胚胎12d的正常组及维甲酸处理组小鼠腭突组织中的mRNA，利用PCR的改良消减杂交技术，筛选并克隆小鼠腭突正常发育时期与腭裂形成过程中差异表达的基因及测序。结果：共获得差异表达的基因40个，2个为新基因。结论：克隆的新基因及fau基因对能对腭突间充质细胞的生长、分化具有重要的调控作用。     

冠心病合并阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者纤维蛋白原Bβ448基因多态性分析

目的：研究冠心病(CHD)合并或不合并阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)患者纤维蛋白质(Fg)含量与FgBβ448位点基因多态性及表达的关系。方法：经冠状动脉造影证实为CHD或发生心肌梗死6～12个月的息者，依据睡眠呼吸监测的结果分为合并OSAHS组(CHD OSAHS组)和不合并OSAHS组(CHD组)；另从健康查体人群中选出年龄与上述两组匹配的无CHD和其他相关性疾病者60例，依据睡眠呼吸监测的结果分为正常对照组与OSAHS组。分别测定其血浆Fg含量(Clauss法)、FgBβ448位点基因多态性(RFLP)及mRNA表达(cDNA合成)，并用SPSS软件包行统计学分析。结果：CHD OSAHS患者A／A基因型出现频率显著低于对照组，‘A／L L／L’基因型出现频率显著高于对照组。不同基因型对mRNA表达有不同的影响，其中L／L基因型mRNA表达最高，其次为A／L基因型，A／A基因型mRNA表达聂低。mRNA的表达量与血浆Fg水平呈显著正相关。结论：FgBβ448的基因型与其mRNA的表达、Fg的水平之间关系密切。CHD OSAHS患者具有较高的L／L、A／L基因频率，具有较高的mRNA表达水平，Fg含量较高，提示OSAHS患者罹患CHD和其他心血管疾病的机率更高。     

急性髓系白血病E-cadherin基因表达和CpG岛甲基化状态的研究

目的 探讨急性髓系白血病（AML）患者中上皮钙黏附素（E-cadherin）基因表达及其甲基化状态。方法 分别用RT-PCR和流式细胞术方法检测55例AML患者骨髓细胞和7份正常对照骨髓细胞中E—cadherin基凶和蛋白的表达，并用甲基化特异性PCR方法分析E—cadherin基因5’端CpG岛的甲基化状况。结果 55例AML患者骨髓细胞中E-cadherinmRNA和蛋白表达阳性率分别为23．6％和18．2％，较正常对照组明显下调（P值均〈0．01）；E—cadherin基因5’端甲基化的阳性率为69．1％。E-cadherin mRNA和蛋白表达阴性的31例患者中，29例（93．5％）E—cadherin甲基化阳性，其蛋白水平和mRNA表达水平与启动子甲基化呈明显负相关（P〈0．01）。7份正常对照骨髓细胞E—cadherin mRNA和蛋白表达均为阳性，E—eadherin基因的CpG岛无明显甲基化。结论 AML的粒系分化成熟障碍可能与E—cadherin基因表达下调有关。5’端CpG岛的甲基化可能影响E-cadherin基因表达。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法：采用新近建立的抑制消减杂交方法，哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料，分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T／A连接构建文库，将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选。随机挑取100个白色克隆用茵落PCR进行鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色阳性克隆，随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增，90％的克隆中均有200～600bp的插入片段，这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论：用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库，该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

强力霉素调控小NEIA激活基因阻遏子表达NIH3T3细胞系的建立

背景：前期研究发现，E1A激活基因阻遏子蛋白调控人血管平滑肌细胞的增殖及表型转化，但其表达调控细胞增殖、分化、凋亡的量效关系有待深入探讨。目的：建立强力霉素调控小鼠E1A激活基因阻遏子表达的NIH3T3细胞系，拟为定量观察E1A激活基因阻遏子的生物学功能提供研究基础。设计、时间及地点：对比观察实验，于2006—05／2008—03在沈阳军区总医院全军心血管病研究所实验室完成。材料：强力霉素调控基因表达系统，3T3细胞系。方法：通过反转录一聚合酶链反应方法获得小鼠E1A激活基因阻遏子（mCREG）cDNA序列；将mCREGcDNA序列亚克隆入pRey—TRE载体中，构建强力霉素调控E1A激活基因阻遏子表达pRev—TRE—mCREG载体；分别经G418（新霉素）及潮霉素筛选表达pRev-Tet—On、pRev—TRE—mCREG的NIH3T3细胞克隆；反转录聚合酶链反应鉴定转染细胞克隆中抗性基因和插入基因的表达。主要观察指标：Western blotting检测不同浓度的强力霉素诱导后NIH3T3细胞中mCREG的表达。结果：成功构建了强力霉素可调控表达的pRev—TRE—mCREG重组载体；筛选出稳定表达双抗性基因的NIH3T3，mCREG细胞克隆；反转录-聚合酶链反应检测证实细胞克隆中G418及插入基因表达均为阳性；Western blotting检测发现随强力霉素诱导剂量的增加（O，O．01，0．1，1mg／L），NIH3T3．mCREG细胞中mCREG表达呈剂量依赖性增加。结论：成功建立强力霉素调控E1A激活基因阻遏子表达的小鼠NIH3T3细胞系。     

载脂蛋白E和缺血性中风相关性研究

目的：研究载脂蛋白E多态性与缺血性中风发病之间的相关性。方法：采用夹心ELISA法进行ApoE定量,应用多聚酶链反应（poly-merase chain reaction PCR)和限制性片断长度多态性方法分析（Restriation fragment length Polymorphism,RFLP)检测51例缺血性中风患者者及50例正常健康体检者的载脂蛋白E的基因型。结果：缺血性中风患者中携带ε4等位基因的百分数及ε2／4,ε3／4基因型百分数高于对照组（P＜0．05）,结论：载脂蛋白E基因多态性对缺血性中风的发病有影响。     

广东地区汉族正常人群HLA-E基因多态性研究

为了检测广东地区汉族正常人群HLA—E基N的多态性，并分析HLA—E与典型HLA—Ⅰ类(Ia)位点之间的连锁关系，采用PCR—SSP方法检测广东地区150个无血缘相关的正常人的HLA—E基N型，同时用NIH标准微量淋巴细胞毒方法检测其中106人HLA—A，一B基N型，对HLA—E与HLA—A，-B位点之间作连锁分析。结果发现，在广东地区汉族正常人群中共检出3个HLA—E等位基N：HLA—E*0101，HLA—E*01031，HLA—E*01032，其基N频率分别为45．33％，32．33％，22．33％。未检出E*0102和E*0104。HLA—E与HLA—A，-B位点之间B15／*E01032及A2／E*01032存在连锁不平衡，除此之外其他任何两位点之间不存在连锁不平衡。结论：HLA—E高度保守的多态性提示其生物学特性可能有别于HLA—Ia分子。