溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系的建立

目的:建立溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系。方法:根据溶藻弧菌胶原酶基因colH的保守序列设计一对引物和一条TaqMan探针,优化反应体系中的引物浓度和探针浓度,评价此反应体系的特异度,并确定其检测下限。结果:优化的反应体系中,引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L,检测下限为1.0×102拷贝/μl,较普通PCR提高了100倍。特异度为100%。结论:本研究所建立的检测体系能够灵敏和特异地检测溶藻弧菌,可以作为溶藻弧菌的快速检测方法。     

霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法的建立

目的建立霍乱弧菌和拟态弧菌的实时荧光PCR快速检测方法。方法根据霍乱弧菌外膜蛋白W基因(out membrane protein W,omp W)和拟态弧菌溶血素基因(Vibrio mimicus hemolysin gene,vmh)的保守序列设计引物和Taq Man探针,建立快速检测并区分霍乱弧菌和拟态弧菌的双重荧光PCR方法,并对所建立的方法进行灵敏度和特异度评价。结果建立了霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR快速检测方法。优化的反应体系中,omp W引物和探针的浓度分别为100 nmol/L和200 nmol/L;vmh引物和探针的浓度均为100 nmol/L。对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为100.9%和99.7%。灵敏度和特异度均为100.0%。结论基于Taq Man探针的omp W和vmh双重荧光PCR检测方法,具有好的灵敏度和特异度。并且能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,为繁琐费时的传统检测方法提供了一种快速可靠的替代选择。     

嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法的建立

目的 建立嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR实验室检测方法.方法 根据嗜水气单胞菌主要黏附素基因(aeromonas hydrophila major adhesion gene,ahe)的保守序列设计引物和TaqMan探针.引物选取200～700 nmol/L 6个浓度梯度,探针选取100～400 nmol/L 4个浓度梯度,以完全随机设计资料的方差分析分别优化引物和探针的浓度.以45株霍乱弧菌、20株副溶血弧菌、10株河流弧菌、4株拟态弧菌、5株创伤弧菌、1株溶藻弧菌、1株弗尼斯弧菌、5株沙门菌属细菌、10株志贺菌属细菌和2株类志贺邻单胞菌为对照,评价该方法的特异性.对所建立的方法进行菌液灵敏度检测和DNA灵敏度检测,并将嗜水气单胞菌人工污染健康人的粪便,实验室内评价该方法从粪便中检测嗜水气单胞菌的能力.结果 6组引物浓度所得的循环阈值(cycle threshold,Ct)分别为(x±s):20.69±0.33、20.72±0.21、20.81±0.12、20.74±0.12、20.51±0.16和20.69±0.11,选择上下游引物的浓度为200 nmol/L(F=1.33,P=0.28),4组探针浓度所得的Ct值分别为(x±s):20.56±0.08、20.82±0.05、20.82±0.11和20.9±0.09,选择探针的浓度为100 nmol/L(F=5.26,P=0.01).该方法DNA的榆测下限为100 fs/μl,纯菌液的检测下限为80 CFU/ml,粪便中嗜水气单胞菌的检测下限为8×103CFU/ml,人工粪便标本增菌8 h后的检测下限为8 CFU/ml.该方法对其他细菌的染色体无扩增.结论 以aha基因为目标检测片段建立的嗜水气单胞菌实时PCR方法灵敏度高、特异度强,可用于纯菌和粪便标本中嗜水气单胞菌的快速检测.     

Taqman MGB探针实时PCR快速检测副溶血性弧菌

[目的]建立一种对食品中副溶血性弧菌的快速检测方法。[方法]根据GenBank公布的副溶血性弧菌的toxR基因的保守序列,设计1对引物和Taqman MGB探针,建立基于Taqman MGB探针的实时PCR快速检测副溶血性弧菌方法。[结果]通过对20种细菌的DNA进行扩增,结果6株副溶血性弧菌均可产生特异性扩增,与其他细菌无交叉反应;对纯菌而言,菌液灵敏度为23／ml,DNA浓度为130Pg。定量关系式为：y=3．353151Ln（x）＋43．797989,R^2=0．947952。67份冷冻海产品中2份副溶血性弧菌实时PCR检测结果阳性,相对应的有1份样品副溶血性弧菌培养阳性,检测时间仅需2h。[结论]该反应体系具有高度的灵敏度和极高的特异性,可用于食品和食物中毒样品中副溶血性弧菌的快速检测。     

新型细菌耐药基因NDM-1实时PCR检测方法的建立

目的 建立灵敏、特异、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测新型细菌耐药基因NDM-1.方法 根据NCBI数据库中β-内酰胺酶类相关耐药基因的序列,详细进行比对,选择特异性最高的片段设计引物和TaqMan探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光PCR方法.对所建立的实时荧光PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价.结果 本方法对各种细菌病原体的新型细菌耐药基因NDM-1的检测具有高度特异性和灵敏度.优化后的引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为100 nmol/L,灵敏度和特异度均为100％.该方法的检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,远远高于普通PCR1.0×105拷贝/μl的检测下限.结论 所建立的方法能够特异和敏感地检测携带NDM-1基因的超级细菌,能够作为携带有该基因细菌的灵敏快速的检测方法.     

霍乱毒素基因(ctx)和耐热直接溶血素基因(tdh)双重TaqMan实时PCR检测方法的建立

[目的]建立霍乱毒素和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时-PCR实验室检测方法。[方法]根据霍乱毒素基因(Cholera toxin gene,ctx)和耐热直接溶血素基因(thermostable direct hemolysin,tdh)的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测霍乱毒素和耐热直接溶血素两种毒力基因的双重TaqMan实时PCR方法。对所建立的霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。[结果]建立了霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR的实验室检测方法。优化的tdh和ct双重TaqMan实时PCR反应体系中,ct引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L;tdh引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为94%和97.7%。[结论]本研究建立了基于TaqMan探针的tdh和ct双重实时PCR检测方法,具有令人满意的灵敏度和特异度。检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,高于普通PCR100倍。并且双重实时PCR能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,这为费时又繁琐的传统检测方法提供了一种可靠又快速的替代选择。     

基于toxR基因的PCR检测副溶血性弧菌的方法建立

目的建立基于toxR基因的PCR检测副溶血弧菌的方法,并通过实验条件摸索,优化反应体系条件,验证PCR方法检测副溶血弧菌的优势。方法应用基于toxR基因的环引物PCR法和已报道的PCR法对副溶血性弧菌和食品样品进行检测,并优化反应条件。对两种检测方法的灵敏度、特异度和检测时间进行比较。结果环引物PCR法可以使副溶血性弧菌扩增出大小180 bp的toxR基因片段,两种方法检测副溶血性弧菌的特异度均为100%,检出限分别为4×103CFU/mL和5×104CFU/mL,检测所需时间分别为2 h 50 min和3 h10 min。结论基于toxR基因的环引物PCR法检测副溶血性弧菌的特异性更强,检出限更低,检测所需时间更短,能够较好地满足卫生防疫机构快速检测副溶血性弧菌的需要。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌

目的建立一种快速、准确、特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法. 方法 以金黄色葡萄球菌FemB基因为靶序列,设计并合成引物和Taqman探针,优化引物与探针比例,调整镁离子浓度,对金黄色葡萄球菌进行荧光定量检测. 结果引物与Taqman探针比例为1∶4,镁离子为2.5mmol/L时本底最低,荧光信号最强;该法的灵敏度为1.0×103拷贝,能特异区分金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌. 结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应能够对金黄色葡萄球菌准确快速定量检测.     

荧光实时定量PCR检测溶藻弧菌方法的建立

目的 建立荧光实时定量PCR(qPCR)定量检测溶藻弧菌的方法,检测该方法的灵敏度并与传统细菌培养比较其特异性吻合率。方法 选择溶藻弧菌的鞭毛基因fliC为目的基因设计探针引物,建立Taqman探针qPCR体系。采用双盲法设计,分别用qPCR和Biolog Microstation System对溶藻弧菌和10株相关细菌进行鉴定,以考核qPCR检测体系的特异性。同时,通过梯度稀释和绘制标准曲线,评价利用qPCR检测溶藻弧菌的灵敏度。结果 本试验建立的qPCR方法能特异、准确、快速鉴定溶藻弧菌,敏感度达102CFU/ml。结论 qPCR方法能够有效快速检测溶藻弧菌。     

应用荧光定量PCR法检测金黄色葡萄球菌

目的建立一种简单、快速、准确、特异性强的能定量检测金黄色葡萄球菌的方法。方法以金黄色葡萄球菌FemB基因为靶序列,设计并合成引物和Taqman探针,优化引物与探针比例,调整镁离子浓度,对金黄色葡萄球菌进行荧光定量检测。结果引物与Taqman探针比例为1：4,镁离子为2.5mmol/L时本底最低,荧光信号最强;该法的灵敏度为1.0×103拷贝,能特异区分金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应能够对金黄色葡萄球菌准确快速及定量检测。