肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）接种5年免疫持久性观察

目的 观察肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）疫苗III期临床试验接种5年的免疫持久性。方法 在III期临床试验免疫原性亚组中,对完成全程两针次免疫的免前抗EV71中和抗体阴性人群进行免疫后5年采血并检测抗EV71中和抗体,对0 d、56 d、8个月、14个月、26个月、64个月同时具有抗EV71中和抗体检测数据人群评价免疫持久性。结果 共614名受试者完成5年免疫持久性血样采集并获得中和抗体检测结果,其中490名受试者同时具有0天、56 d、8个月、14个月、26个月、64个月抗EV71中和抗体检测数据,疫苗组和安慰剂对照组分别为235名和255名。EV71疫苗免疫后5年,疫苗组抗EV71中和抗体阳性率（100.00%）和抗体几何平均滴度（geometric mean titer,GMT）（369.57）均高于对照组（69.02%和55.58）。分别以抗体滴度8、16、32为阳性判定标准,疫苗组阳性率（100%、99.57%、97.87%）均高于对照组（69.02%、61.96%、59.61%）。对不同年龄亚组进行分析,6~11、12~35月龄受试者免疫后疫苗组5年抗EV71中和抗体阳性（滴度≥8）率（均为100.00%）和抗体GMT（367.14、370.64）均高于对照组（66.67%、71.27%和53.43、63.66）。在EV71疫苗免疫后的各个时间点,疫苗组抗EV71中和抗体阳性率和GMT均高于对照组。结论 该EV71疫苗两针基础免疫后能够诱导良好的免疫原性,在免疫后5年依然保持较好的免疫持久性。     

联合检测手足口病肠道病毒71型RNA及IgM结果分析

目的探讨实时荧光定量PCR与EV 71-IgM抗体捕获ELISA两种方法检测肠道病毒71型的差异及一致性及临床意义。方法釆集1539例手足口病患儿咽拭子及血清,分别采用实时荧光定量PCR与ELISA法检测肠道病毒71型的RNA及IgM抗体。结果实时荧光定量PCR的EV71及EV 71-IgM抗体捕获ELISA的阳性率分别为63.5%和61.9%,两者全阳性占56.9%,两者全阴性占31.4%;两种方法的阳性率无明显差异P=0.073,两种方法结果总符合率为88.4%,一致性检验Kappa=0.751,说明两方法吻合程度较高。结论 ELISA法检测EV71-IgM抗体作为一种新的检测方法与实时荧光定量PCR具有较高的一致性,可在各级检验机构中广泛应用。但ELISA法有一定的局限性,在病情早期阶段或免疫功能低下时,有些病例漏诊,最好联合进行病毒RNA检测或过一定时间复查。     

SARS灭活疫苗毒种特性和效力试验方法的研究和建立

目的 验证SARS灭活疫苗生产用毒种和建立疫苗效力试验方法和评价疫苗有效性的方法和初步标准。方法 将SARS灭活疫苗进行系列稀释后免疫小鼠、原液疫苗免疫家兔，用异株病毒作为攻击毒以蚀斑减少法测定血清中和抗体，并与一组SARS病人恢复期血清的中和抗体水平进行比较。初步建立疫苗的效力试验方法和评价标准。结果 疫苗以不同稀释度免疫小鼠，能产生随不同稀释度疫苗相应梯度的中和抗体滴度。用原倍疫苗免疫的小鼠血清中和抗体可达495．2；原倍疫苗免疫家兔所产生的中和抗体GNT为55．0～79．9。无论是小鼠或家兔所产生的中和抗体对广东分离的病毒均较北京分离的病毒为高。南北不同区域的SARS病人恢复期血清中和抗体GMT为50．12～54．95，且发现北方人群样本的抗体高于南方人群样本。结论 用小鼠和家兔作疫苗的效力试验模型具有较好的敏感性和重复性，且产生的抗体水平较高：选用的攻击病毒对多批用不同毒株生产的疫苗免疫后的动物抗体具有较高的一致性，可用于评价疫苗的效力。     

兔抗肠道病毒71型血清制备中不同免疫剂量对抗体效价的影响

目的 研究兔抗肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）血清制备中不同免疫剂量对抗体效价的影响。方法 将9只实验兔简单随机分为3组,每组3只。5、50和100 μg 3个剂量EV71灭活疫苗和弗氏佐剂均匀混合后,通过肌内注射途径分别免疫3组动物,于第0、7、14及28天各免疫1次,每7天采血,分离血清,检测抗EV71中和抗体效价。结果 100 μg剂量组兔血清抗体效价显著高于5和50 μg剂量组（第42天t值分别为–3.282和–2.486,P值均<0.05）。第42天时,兔血清抗体效价和免疫剂量（5~100 μg范围内）呈线性关系,回归方程y=478.229x–2 041.820。结论 在本实验选择的3个免疫剂量中,随着免疫剂量升高,产生的血清抗体效价也升高,且呈线性关系。     

新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制和评价标准的研究

目的 研究建立新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制标准和评价体系,为EV71疫苗研发提供基础.方法 根据创新型疫苗研发的要求,充分发挥技术优势,开展EV71疫苗质控标准、标准品和评价方法研究.结果与结论 建立EV71灭活疫苗的中和抗体和抗原定量测定标准品,统一不同企业疫苗的质控标准,规范疫苗的评价体系,为EV71疫苗的研发提供保障.     

假病毒中和试验对狂犬病毒中和抗体效价的检测效能分析

目的：组织不同的实验室分析假病毒中和法（Pseudo Virus-based Neutralization Assay,PBNA）对不同样品的狂犬病病毒中和抗体水平的检测能力,并比较其与经典的快速免疫荧光灶抑制试验（Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,RFFIT）以及小鼠中和试验法（Mouse Neutralization Test,MNT）的相关性。方法：共9家实验室,分别采用PBNA、RFFIT以及MNT法对6份样品进行狂犬病病毒中和抗体检测,每个实验室进行3～5次重复实验。采用配对t检验及Pearson相关系数对3种检测方法的结果进行统计学分析。结果：PBNA与RFFIT、PBNA与MNT、RFFIT与MNT Pearson相关系数分别为0.985、0.988和0.974,抗体几何平均滴度进行t检验,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：3种方法重复检测6份样品的定量结果具有高度的相关性,PBNA法可作为《中华人民共和国药典》方法RFFIT、MNT的一种替代或补充方法,用于人用狂犬病疫苗临床血清、狂犬病人免疫球蛋白及抗狂犬病血...     

抗肠道病毒71型血清与病毒间的中和量效反应关系

目的探讨抗肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)中和血清效价与EV71滴度之间的中和试验量效反应关系。方法将EV71收获液进行系列梯度稀释后, 加入不同动物来源的不同效价的血清进行中和试验, 观察细胞病变情况, 找到能够完全中和不同滴度病毒所需的最低血清效价。结果随着病毒滴度的增加, 需要完全中和病毒所对应的血清效价也相应增加, 但血清效价增加的趋势较病毒增加的趋势慢, 当病毒滴度增加约120 000倍时, 所需的血清效价增加约1 000倍。不同来源的血清对EV71的中和能力相当。结论初步确立了EV71中和血清与EV71滴度间的中和量效关系。     

胶体金法和PCR-荧光探针法联合检测手足口病患儿肠道病毒71型

目的探讨胶体金法检测EV71型病毒IgM抗体和检测EV71型病毒核酸的临床应用。方法胶体金法和PCR-荧光探针法联合检测EV71型病毒并对结果进行比较。结果胶体金法检测EV71型病毒IgM抗体和PCR-荧光探针法检测EV71型病毒核酸相比无显著差异(P>0.05)。结论胶体金法和PCR-荧光探针法联合检测EV71型病毒既能保证快速检测,又能提高准确性。     

霍乱疫苗效力试验替代方法的研究

目的研究霍乱疫苗效力试验的替代方法。方法以不同剂量霍乱疫苗免疫小鼠,用间接ELISA方法检测小鼠全血的抗菌、抗毒抗体滴度,小鼠毒菌攻击法计算保护率。结果抗毒、抗菌抗体水平与免疫剂量和攻毒后的动物保护率成正相关,结果稳定。结论可以通过检测高免疫剂量组实验动物的抗菌、抗毒抗体替代以往小鼠攻毒法的效力试验。     

鼠源神经生长因子临床受试者血清抗体检测

目的：采用酶联免疫测定法（ELISA）检测鼠神经生长因子临床用药病人的血清抗体。方法：通过直接标记鼠神经生长因子（NGF），建立了一种检测人抗鼠NGF抗体的检测方法：即双抗原夹心法检测人抗鼠NGF抗体。将此方法应用于检测临床用药病人的血清抗体，并与间接法进行了比较。结果：双抗原夹心源检测94份正常人血清，无一份假阳性，在检测临床病人血清时，亦得到了较好的结果。而间接法的非特异性则达10％。结论：双抗原夹心法方法可靠，可用于鼠源神经生长因子临床试验；血清样本检测证明临床实验病人血清抗鼠NGF抗体含量与正常人无显著差异。     

肠道病毒71型抗原定量检测方法的建立

目的 建立肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)抗原的定量检测方法,用于EV71疫苗生产过程中EV71抗原含量的监测.方法 用EV71抗原免疫新西兰兔制备抗EV71多克隆抗体,纯化后用辣根过氧化物酶标记.采用双抗体夹心ELISA法建立抗原检测系统.以EV71国家抗原标准品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的线性范围和定量限,并对该方法的特异性、精密度、准确性、稳定性及适用性等进行验证.结果 建立的ELISA法的线性范围为5～80 U/ml,定量限为5 U/ml,线性决定系数均大于0.990 0;不同浓度样品回收率为85.0％～110.0％,变异系数均小于15％;置于2～8℃及37℃3、6d的抗体包被板对不同浓度样品的检测值变异系数均小于15％;该方法可特异性检测EV71原液,与非EV71样品无交叉反应.结论 建立了EV71抗原定量检测方法,为EV71疫苗生产工艺过程的质量控制奠定了基础.     

四参数模型和平行线分析法在病毒疫苗抗原生物检定统计中的应用

目的 比较四参数模型与平行线分析法在Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin inactivated poliovirus vaccine,sIPV)D抗原和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)抗原生物检定统计中的应用.方法 对sIPV-D抗原和EV71抗原检测数据分别进行四参数模型和平行线分析法的方法验证,并将两种方法应用于不同含量样品检测结果的分析计算.结果 sIPV-D抗原检测数据四参数曲线拟合度好(决定系数为0.998,残差值≤0.059),平行性分析可靠(线性回归:参比品F=727.49,P＜0.01;样品F=1 169.44,P＜0.01.平行性方差分析F=0.24,P＞0.05).EV71抗原四参数曲线拟合度好(决定系数为1.000,残差值≤0.025),平行性分析可靠(线性回归:参比品F=126.63,P＜0.01;样品F=192.74,P＜0.01.平行性方差分析F=4.00,P＞0.05).对于sIPV和EV71不同抗原含量的生物检定统计,两种方法计算结果的差异无统计学意义(t=0.248～1.023,P值均＞0.05).结论 四参数模型和平行线分析法均能较好地应用于sIPV-D抗原和EV71抗原的ELISA检测体系.     

我国肠道病毒71型（EV71）疫苗株生物信息学分析

目的 比较3个EV71疫苗株病毒的生物信息学特点,为疫苗的质控和探讨该病毒疫苗的免疫机制提供参考.方法 本研究利用DNAstar MegAlign、DNAMAN Alignment、ANtheProt等生物学软件,比较了我国已进入临床试验的3家EV71全病毒灭活疫苗毒株的基因组及氨基酸序列,并对英衣壳蛋白二级结构及可能存在的抗原表位进行了预测分析.结果 3个疫苗株病毒基因同源性为97％～99％;氨基酸同源性为98％～99％;二级结构一致率在95％以上;均存在35个潜在抗原表位区域.结论 3个疫苗株生物信息学分析结果存在高度的一致性,提示疫苗具有相似的抗原性和免疫原性.     

抗H7N9流感病毒中和抗体快速检测方法的建立及应用

目的：对建立的抗H7N9流感病毒中和抗体快速检测方法进行方法学验证及初步应用。方法：分别采用不同代次细胞对高、中、低不同滴度的阳性血清进行多次平行检测,考察细胞代次对检验结果的影响;采用NIBSC提供的参考品对方法学的特异性进行验证;同时应用抗H7N9的阳性血清检测进一步评估方法的准确性和精密性;采用ELISA-MNT法和血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）试验分别接种H7N9灭活流感疫苗免疫的小鼠血清样本20份,分析两种方法检测结果的相关性。结果：采用ELISA-MNT中和法,使用不同代次MDCK细胞（25、30和35代）检测相同的血清样本的中和抗体滴度结果相同;该方法只对羊抗H7N9的血清具有较高保护力,对其他血清基本没有交叉反应;该方法准确性良好;该方法组间、组内精密性的平均变异系数分别为4%和11%。该方法测定H7N9型流感疫苗免疫后的小鼠血清抗体效价,其结果与HI抗体的相关系数为0.61,表明两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性。结论：建立的微量病毒中和法能够满足H7N9流感病毒中和抗体效价检测的要求,可用于H7N9新型大流行流感疫苗的免疫评价。     

肠道病毒71型感染的血清流行病学分析近况

近年来肠道病毒71型（enterovirus 71, EV71）在我国引发了手足口病的暴发和流行。针对该病毒的流行病学研究,为预防和控制EV71引发的手足口病流行提供重要依据。此文就目前EV71在人群中的血清阳性率和中和抗体水平资料进行综述。     

磁珠法结合定量PCR检测肠道病毒71型灭活疫苗中宿主细胞DNA残留量的验证及应用

目的  对磁珠法结合定量PCR（quantitative PCR,qPCR）检测肠道病毒71型灭活疫苗〔非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）〕（EV71疫苗）中宿主DNA残留量进行适用性验证及应用。方法  利用微磁珠与蛋白溶液中DNA的特异性结合,来提取样品中残留的Vero细胞DNA。将已知浓度Vero细胞DNA对照系列稀释后,作为标准品DNA与提取的DNA同时进行qPCR扩增。根据标准品DNA的循环阈值与浓度之间的线性关系,对未知样品中残留DNA进行定量分析。结果  标准品检测范围在0.03～3 000.00 pg/反应。该方法的标准曲线决定系数≥0.98,扩增效率在90%～110%。质控样品回收率在50%～150%,相对标准偏差均小于30%。实验结果的各项参数均在要求范围内。结论  磁珠法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点,qPCR能够简便、快速、准确地对生产过程样品的EV71疫苗中DNA残留量进行定量测定。适用于EV71疫苗中DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制,对其他以Vero细胞为基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。     

假病毒在中和抗体检测中的应用研究进展

目前成功的病毒性疫苗大多通过诱导广谱有效的中和抗体来保护机体免受感染,因此检测血清中和抗体水平对疫苗的免疫效果评价具有重要意义.中和抗体检测的传统方法包括微量细胞病变效应抑制法、蚀斑减少试验等,均需进行活病毒操作.近年来,随着逆转录病毒载体和重组病毒表达技术的发展,假病毒得到越来越多的研究,并被广泛应用在新型疫苗研发、中和抗原表位鉴定、细胞嗜性研究、抗病毒药物筛选、中和抗体检测、基因治疗等方面.此文主要对假病毒在中和抗体检测中的应用进行综述,并总结相关领域的研究进展.