可溶性Jagged1/Fc融合蛋白对CD4~＋CD25~＋T细胞分化的作用

目的:探讨可溶性Jagged1/Fc融合蛋白对小鼠淋巴细胞CD4+ CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Tr)分化的作用.方法:利用荧光标记的单克隆抗体(mAb)双染技术结合流式细胞术(FCM)观察不同时间Jagged1/Fc融合蛋白及不同浓度Jagged1-Notch信号通路抑制剂DAPT对小鼠淋巴细胞表面分子CD4和CD25表达的影响.通过Luminex蛋白液相芯片技术检测Jagged1/Fc作用下T细胞培养上清中白细胞介素4(IL-4)、干扰素γ(IFN-γ)和转化生长因子β(TGF-β)的表达水平.结果:浓度为1 000 μg/L时,Jagged1/Fc在第1、 3、 5天均能增强淋巴细胞表面CD4,CD25的表达,以第3天的增强作用最为明显(P<0.01);DAPT浓度从2 μmol/L逐渐增至16 μmol/L时,对CD4、 CD25表达的抑制作用逐渐增强,以16 μmol/L DAPT的抑制作用最为明显,呈剂量依赖关系(P<0.01,r=0.96),而Jagged1/Fc能够逆转DAPT对CD4,CD25表达的抑制;Jagged1/Fc能够促进淋巴细胞培养上清中TGF-β表(P<0.01).结论:可溶性Jagged1/Fc融合蛋白可能参与诱导小鼠淋巴细胞向CD4+ CD25+ Tr分化.     

可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白对小鼠淋巴细胞活化、增殖和周期的影响

目的:研究可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白在小鼠淋巴细胞活化、增殖和周期中的作用.方法:选择有效剂量为500 μg/L Jagged 1/Fc嵌合蛋白(Jagged 1/Fc),以活体染料/羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色,建立在多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)或佛波醇酯(PDB)加离子霉素(Ion)刺激下评价淋巴细胞增殖的模型,通过流式细胞术分析Jagged 1/Fc对淋巴细胞增殖的作用;采用碘化丙锭染色检测Jagged 1/Fc对PDB加Ion刺激的淋巴细胞周期变化的影响;利用荧光标记的mAb双染技术观察Jagged 1/Fc对T细胞早期和中期活化标志CD69和CD25表达的影响.结果:Jagged 1/Fc对ConA刺激或非刺激的CD3 细胞CD69和CD25的表达无明显影响,对ConA或PDB加Ion刺激或非刺激的淋巴细胞的增殖指数也无明显影响,导致非刺激的淋巴细胞sub-G0期细胞百分比增高,S期细胞百分比降低,但并不影响PDB加Ion诱导的淋巴细胞各期的变化.结论:这些结果提示500 μg/L Jagged 1/Fc对小鼠淋巴细胞活化和增殖无明显作用,对PDB加Ion刺激的淋巴细胞周期也无明显影响,但能促进未受刺激的淋巴细胞凋亡,使细胞停滞于GO/G1期,阻止其进入S期.     

未成熟树突状细胞对T细胞功能及其IL-10和TGF-β1表达的影响

目的探讨未成熟树突状细胞(DC)对T细胞功能及其IL-10和TGF-β1表达的影响。方法通过诱导大鼠骨髓前体细胞,获取未成熟(iDC)和成熟(mDC)2种状态的DC;将2种DC用乙酰胆碱受体(AChR)负载后进行T细胞重复刺激、交叉刺激和无关抗原刺激试验,采用MTT法观察T细胞增殖情况,采用RT-PCR方法测定T细胞IL-10 mRNA的表达水平,采用Western blot方法检测T细胞TGF-β1的表达水平。结果①AChR负载的iDC可明显抑制T细胞增殖,且这种被抑制的T细胞对AChR负载的mDC的交叉刺激也不引起增殖,但对无关抗原OVA负载的mDC的刺激可产生明显增殖。②与mDC组比较,AChR负载的iDC初次和重复刺激均明显增强T细胞IL-10和TGF-β1的表达。结论 iDC可诱导抗原特异性T细胞耐受,耐受机制可能与IL-10和TGF-β1的表达增强有关。     

食管癌组织微环境对树突状细胞的影响

目的:探讨食管癌组织匀浆上清液体外模拟肿瘤微环境对人树突状细胞(DC)分化发育的影响, 揭示肿瘤免疫逃逸机制, 为DC疫苗的应用提供理论基础.方法:制备新鲜食管癌及癌旁组织匀浆上清液, ELISA检测其VEGF-A含量.密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞, 含rhGM-CSF和rhIL- 4 RPMI1640培养液诱导DC, 第2天在继续诱导DC基础上设食管癌匀浆上清组、癌旁匀浆上清组、 VEGF-A组, 均隔天半量换液, 第4天加入食管癌细胞株EC9706抗原, 第6天加入脂多糖, 第8天收集各组细胞.观察DC形态, 流式细胞术(FCM)检测免疫表型, RT-PCR检测CD1a表达, CCK-8检测T细胞增殖率及杀伤率.结果:食管癌组织匀浆上清VEGF-A含量[(0.987±0.319) μg/L]明显高于癌旁[(0.152±0.105) μg/L, P<0.05]; 食管癌匀浆上清组细胞形态明显受到抑制, CD86分子阳性率(%)与正常DC相比由69±8降为42±11、 CD1a由56±12降为27±12、 CD11c由21±13降为18±13(P<0.01), CD1a基因几乎无表达, 刺激T细胞增殖率(%)由112.5±7.2降为70.2±3.5(P<0.01), 杀伤率(%)由62.4±0.6 降为46.8±1.6(P<0.01); 癌旁匀浆上清液组、 VEGF-A组结果与正常DC组无统计学意义.结论:食管癌组织匀浆上清液所模拟的微环境对DC的诱导分化及其功能有明显的抑制作用, 在该抑制作用中VEGF-A并不起主要作用.     

不同刺激剂和培养环境对CD4+、CD8+T细胞内细胞因子表达的影响

目的探讨不同的刺激剂和不同的培养条件对CD4 和CD8 T细胞内细胞因子表达的影响。方法分离正常人的外周血单个核细胞(PBMC),分别加入3种不同的刺激剂(PHA,抗CD3和抗CD28mAb,PMA和离子霉素),置于4种不同的培养环境下(室温,37℃水浴,37℃培养箱,37℃50mL/LCO2培养箱)培养4·5~5h。收集细胞,以荧光素-mAb标记后,用流式细胞术分析CD4 、CD8 T细胞内IL-2、IFN-γ和TNF-α的表达。结果CD4 和CD8 T细胞内细胞因子的表达,随着刺激剂的不同而有所差别,且在上述4种培养环境中,PMA的刺激效果最强,抗CD3mAb次之,PHA的刺激效应最弱。以上述3种刺激剂刺激后,不同培养条件对T细胞内细胞因子的表达有一定的影响。室温培养时几乎检测不到细胞因子的表达,而在37℃水浴、37℃培养箱和37℃50mL/LCO2培养箱中培养时,表达细胞因子的CD4 和CD8 T细胞的百分率差异无统计学意义(P>0.05)。结论不同刺激剂体外刺激T细胞表达细胞因子的效应不同,依次为PMA和离子霉素>抗CD3和抗CD28mAb>PHA。体外刺激培养的T细胞活化过程中,温度是重要的条件,CO2无明显影响。     

重组大鼠4-1BBL对树突状细胞免疫学功能的影响

目的:探讨大鼠4-1BBL对骨髓来源的树突状细胞(DC)表面分子及免疫功能的影响.方法:构建真核表达质粒pIRES2-EGFP- 4-1BBL并利用脂质体介导转染HepG2细胞, G418筛选出阳性克隆, RT-PCR和荧光显微镜分别检测4-1BBL基因转录和EGFP的表达; 流式细胞术(FCM)检测不同HepG2细胞与DC共培养2 d后表面CD80及MHC-Ⅱ的表达, ELISA测定共培养上清中IL-6和IL-12的含量.结果:成功构建pIRES2-EGFP- 4-1BBL重组表达载体并在HepG2细胞中获得稳定表达, 重组大鼠4-1BBL能促进骨髓来源DC表面MHC-Ⅱ、 CD80分子表达和分泌IL-6、 IL-12(P<0.05).结论:重组大鼠4-1BBL具有促进骨髓来源DC成熟的功能.     

活动性肺结核患者外周血单个核细胞表达TH1/TH2类细胞因子的特点

结核病患者免疫细胞产生TH1类细胞因子的能力低下，而TH2类细胞因子表达各家报道不一。CD4^ T和CD8^ T细胞是结核病免疫中主要的效应细胞，也是细胞因子的主要来源。我们采用流式细胞仪检测CD4^ T和CD8^ T分泌IFN-γ和IL-4的能力，从单细胞水平探讨结核菌感染患者TH1／TH2型免疫反应的特点。     

可溶性mPDL1-hIgGFc表达载体构建、表达及对诱导细胞增殖与凋亡的影响

目的 可溶性mPDL1-hIgGFc(mouse PDL1-human IgG Fc)表达载体的构建与表达,及其对诱导细胞增殖与凋亡的研究.方法 以含有mPDL1基因的载体pmPDL1为模板,采用PCR的方法获得mPDL1胞外段基因,定向连接于含有hlgGFc基因片段的载体phIgGFc,构建表达载体pmPDL1-hIgGFc;采用脂质体将重组子转染CHO细胞,转染后的CHO命名为cHOp;ELISA和Western blot法检测目的 蛋白的表达,流式细胞术检测CHOp培养上清对混合淋巴细胞培养(MLC)的影响.结果 测序结果和酶切鉴定显示构建的表达载体pmPDL1-higGFc完全正确;ELISA和Westernblot法检测CHOp培养上清中有目的 蛋白表达;流式细胞术检测表明CHOp培养上清可体外抑制小鼠MLG,并诱导活化T细胞凋亡,其效应呈剂量依赖性.结论 成功构建mPDL1-hIgGFc表达载体;mPDL1-hIgGFc在体外可抑制MLC和诱导活化T细胞凋亡,具有负性调节T细胞的功能.     

MUC1/Y基因修饰的树突状细胞体外抗卵巢癌效应的研究

目的研究人MUC1／Y基因转染人外周血树突状细胞(DC)后在体外诱导的特异性抗MUC1／Y^ 卵巢癌效应。方法通过人外周血单核细胞诱导DC，采用脂质体法将已构建好的含人MUC1／Y全长cDNA的真核表达载体pEGFP-N1／MUC1/Y转染到DC中，荧光显微镜下观察其表达的蛋白定位；与自体T细胞共培养，观察其致敏的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MUC1／Y^ 的卵巢癌细胞A2780的杀伤活性，并与转染空载体的DC诱导的CTL进行比较。结果pEGFP-N1／MUC1/Y转染DC后，其绿色荧光蛋白主要表达于DC细胞膜上，可诱导出对卵巢癌细胞系A2780特异性的细胞毒性T细胞。结论MUC1／Y基因修饰的DC可诱导特异的抗MUC1／Y^ 卵巢癌效应。     

TRAIL对CIA小鼠脾细胞表达Th1/Th2细胞因子的影响

 摘要：目的 观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand , TRAIL）对胶原诱导型关节炎（Collagen-induced arthritis, CIA）小鼠的治疗效果,探讨TRAIL治疗类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）的可能机制。方法 牛Ⅱ型胶原蛋白加弗氏完全佐剂免疫DBA/1J小鼠建立CIA模型,采用重组腺相关病毒AAV-TRAIL关节腔内注射进行治疗。CBA和流式细胞术检测Th1/Th2细胞因子的分泌。结果 AAV-TRAIL可改善CIA小鼠的病情,体外研究其机制发现TRAIL可抑制CIA小鼠的脾细胞分泌Th1型细胞因子,但对Th2型细胞因子没有作用。结论TRAIL对CIA小鼠的治疗作用可能和TRAIL抑制Th1型细胞因子分泌相关。     

T淋巴细胞侵袭转移诱导蛋白1在小鼠子宫内膜基质细胞-胚泡共培养体系中对胚泡黏附的影响

目的:检测不同浓度T淋巴细胞侵袭转移诱导蛋白1 (Tiaml)抗体下,小鼠着床窗子宫内膜基质细胞内的Tiaml蛋白表达及其对基质细胞-胚泡共培养体系中胚泡黏附的影响,探讨Tiaml对小鼠胚胎着床的影响.方法:提取着床窗小鼠子宫内膜基质细胞并构建基质细胞-胚泡共培养体系;分别用免疫细胞化学和免疫印迹法检测不同浓度抗Tiaml抗体时着床窗基质细胞Tiaml蛋白的表达及其对胚泡黏附的影响.结果:抗体干预后着床窗基质细胞内的Tiaml蛋白表达水平降低;在不同抗体浓度下胚泡黏附率有差异.结论:随Tiaml抗体浓度增加,着床窗小鼠子宫内膜基质细胞Tiaml蛋白表达量及胚泡黏附率降低.表明Tiarnl可能在胚泡植入过程起重要的作用.     

小鼠可溶性CD83对树突状细胞表达共刺激分子和共刺激活性的影响

目的：研究可溶性小鼠CD83（mCD83）对树突状细胞（DC）表达共刺激分子及共刺激活性的影响。方法：克隆mCD83基因，构建mCD83胞外功能区与人IgG1αFc段融合基因的真核表达载体pmCD83-hIg，并在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白。采用ELISA、Western blot和RT-PCR技术检测mCD83-hIg融合基因在COS-7细胞中的表达。用mCD83-hIg处理小鼠DC细胞系（DC2．4）采用流式细胞术检测DC细胞周期、细胞凋亡和共刺激分子CD80、CD86的表达影响；采用混合白细胞培养试验，检测mCD83-hIg对DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的影响。结果：酶切和序列测定鉴定显示构建的真核表达载体完全正确；mCD83-hIg对DC2．4细胞周期和细胞凋亡无影响，但可下调DC2．4表面共刺激分子CD80和CD86的表达；mCD83-hIg处理过的DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的能力显著下降。结论：mCD83-hIg可抑制DC表达共刺激分子并下调DC共刺激活性，从而抑制同种异基因T细胞增殖和产生细胞因子。     

非小细胞肺癌患者中IL-33及其受体ST2对Th1/Th2/Th17型细胞因子的影响

为探究IL-33与受体抑癌蛋白2(suppression of tumorigenicity 2,ST2)及相关细胞因子在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中的作用,收集30例NSCLC患者样本为病例组,同时收集40例健康者为对照组,采用实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测NSCLC组织中IL-33和ST2的mRNA与蛋白水平;ELISA检测样本血清中IL-33/可溶性ST2(soluble ST2, sST2)、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A的水平;Pearson法分析NSCLC患者血清中IL-33与IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-17A的相关性。结果显示,与对照组相比,NSCLC患者病灶组织中IL-33和ST2的mRNA与蛋白水平均显著升高(P0.05);患者血清中IL-33、sST2、IL-10、IL-17A和IL-4的水平显著升高,IFN-γ水平显著降低(P0.05);患者血清中IL-33与IL-4、IL-10的水平呈显著正相关(r=0.65,P0.01;r=0.77,P0.01),与IFN-γ水平呈显著负相关(r=-0.82,P0.01),而与IL-17A的水平不相关。由此,IL-33与受体ST2在NSCLC患者中表达增高可能引起Th1/Th2细胞因子分泌的免疫失衡。     

灭活HIV-1颗粒对人CD4+T细胞活化和全血Th1/Th2细胞因子分泌的影响

目的：体外研究AT-2灭活的HIV-1颗粒对人CD4+T细胞活化和全血(whole blood，WB) Th1/Th2细胞因子分泌的影响。方法:AT-2灭活HIV-1ⅢB型病毒颗粒，运用ELISA法测定所制备的灭活病毒中p24抗原的含量，按照1/500、1/50和1/5 (V/V)的浓度加入到WB中，以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)组为阳性对照；24 h后，收集WB培养上清，运用流式微球分析法（cytometric bead array，CBA）检测WB分泌Th1 (IL-2、IFN-γ和TNF-α)和Th2 (IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子水平；同时运用免疫荧光抗体染色技术结合流式细胞术检测WB中CD4+T细胞早期活化标记分子CD69的表达百分率。结果:我们所制备的灭活病毒中p24抗原的含量为85.5 μg/L；24 h后，空白对照组中，CD4+T细胞CD69的表达百分率为(1.62±0.63)%，PHA组为(38.82±6.00)%，HIV-1(1/500)组为(3.83±1.07)%，HIV-1(1/50)组为(5.94±0.85)%，HIV-1(1/5)组为(9.30±1.22)%；空白对照组WB培养上清中细胞因子主要为IL-6和TNF-α，PHA组中Th1和Th2细胞因子全部升高，3个浓度的HIV-1组中Th1和Th2细胞因子也全部升高。结论:AT-2灭活的HIV-1ⅢB颗粒能够明显引起WB中CD4＋T细胞活化，并上调WB培养上清中Th1和Th2细胞因子的水平，其机制可能是除了HIV-1病毒蛋白的作用外，HIV-1出胞时，许多宿主细胞来源的免疫分子整合到病毒颗粒包膜中，而模拟抗原提呈细胞，从而产生免疫调节作用。     

TPA及细胞因子对U937细胞中IL—1β mRNA表达的影响

本文利用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法，检测了几种细胞因子及ＴＰＡ对人单核细胞白血病传代细胞系Ｕ９３７细胞中ＩＬ－１βｍＲＮＡ表达的影响。结果显示，ＴＮＦ－α，ＩＬ－６，ＩＦＮ－γ，ＩＬ－２，ＩＬ－３，ＩＬ－８，ＩＬ－９和ＧＭ－ＣＳＦ对ＩＬ－１βＲＮＡ的表达，均有不同程度的刺激作用，尤以ＴＮＦ－α和ＩＬ－６最为明显，ＴＰＡ刺激Ｕ９３７细胞表达ＩＬ－１β ｍＲＮＡ的时间效应显示，１２ｈ表达量较高；９ｈ表达     

内皮素-1对人肾小球系膜细胞层黏连蛋白的影响

内皮素-1(endothelin-1,ET-1)是一种强烈的缩血管活性肽,与血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)具有很多相似之处,且二者之间具有相瓦促进作用[1].阻断肾素-血管紧张素(RAS)系统已被广泛应用于慢性肾脏病(CKD)的治疗,但是ET系统拮抗剂还未得到重视.本实验通过研究ET-1及其受体拮抗剂(Bosentan)对层黏连蛋白(laminin,LN)代谢的影响,为ET-1受体拮抗剂应用于CKD的治疗提供依据.     

RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节

目的:研究RGS1基因对细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响.方法:通过克隆RGS1基因、转染RAW264.7细胞、建立稳定转染的细胞系, 利用流式细胞术检测, 基因芯片分析初步探讨RGS1基因的功能.结果:RGS1基因能够抑制NF-κB转录因子活性; RGS1基因明显增加RAW264.7细胞表面CD86分子的表达, 降低CD80表达; 在不同Toll样受体配体刺激后, CD40、 CD80和PD1水平低于对照组.同时, RGS1基因使IL-6、IL-15的表达明显升高, IL-10、 IL-1的表达明显降低.结论:RGS1基因可调节免疫相关细胞表面分子和细胞因子的分泌, 影响Toll 样受体信号通路,表明RGS1可能在免疫调节方面起重要作用.     

卵巢癌细胞对CD8+T细胞ζ链表达及分泌Tc1/Tc2型细胞因子的影响

目的：通过研究卵巢癌细胞对CD8+T细胞ζ链表达及分泌Tc1/Tc2型细胞因子影响，探讨其在卵巢癌免疫抑制中的作用。方法:Western印迹方法检测3株卵巢癌细胞（OVCAR3、CAOV3和SKOV3）培养上清液作用后CD8+ T细胞ζ链蛋白的表达；分别采用MTT、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法观察卵巢癌细胞培养上清液对CD8+ T细胞增殖和分泌Tc1/Tc2型细胞因子的影响。结果:（1）与对照组比较，OVCAR3、CAOV3和SKOV3细胞培养上清液均能抑制CD8+ T细胞中ζ链的表达，ζ链蛋白平均吸光度值分别为（0.346±0.004; 0.349±0.007; 0.387±0.011; 0.616±0.013）；（2）3株卵巢癌细胞培养上清液皆抑制CD8+ T细胞增殖，分泌的Tc1细胞因子IFN-γ显著降低，而Tc2细胞因子IL-10显著增高。结论:卵巢癌细胞源性的免疫抑制因子通过下调CD8+ T细胞ζ链的表达，从而抑制其增殖并导致Tc1/Tc2细胞因子分泌失衡，这可能是卵巢癌诱导腹腔免疫抑制的机制之一。     

HMGB1对淋巴细胞增殖、凋亡及Th1/Th2、Tc1/Tc2漂移的影响

目的:探索HMGB1是否参与淋巴细胞免疫功能的调节.方法:系列浓度HMGB1单独或与ConA联合刺激培养小鼠脾淋巴细胞.MTT法检测细胞增殖,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡、细胞表面CD3、CD8及细胞内IL-4、IFN-γ表达.结果:(1)HMGB1时间-剂量依赖性调节淋巴细胞增殖,而不影响其凋亡.(2)不同HMGB1浓度和刺激时间不影响淋巴细胞Th1、Th2及Th1/Th2变化,但10 μg/L和100 μg/L HMGB1刺激12～24 h,Th1亚群占优势;培养12～24 h,淋巴细胞Tc1亚群明显减少,Tc2无变化.Tc1/Tc2变化显示,1 μg/L和10 μg/L HMGB1刺激,Tc1亚群占优势.(3)培养12～24 h,上清中IL-2增加,sIL-2R减少,IL-2/sIL-2R比例升高20～50倍,尤以10 μg/L HMGB1刺激明显.结论:低剂量HMGB1可增强淋巴细胞免疫功能.     

CTLA-4Ig对B6.MRL-Faslpr/J狼疮小鼠脾脏Th17和Treg细胞表达的影响与其对小鼠狼疮样病征干预作用的相关性研究

目的:初步探讨B7阻断剂CD28与细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA-4Ig)对B6.MRL-Faslpr/J狼疮小鼠脾脏Th17和调节性T细胞(Treg细胞)表达的影响与其对小鼠狼疮样病征干预作用之间的相关性。方法:将4个月龄大小雌性B6.MRL-Faslpr/J狼疮小鼠16只,随机分为观察组(Ⅰ组)和对照组(Ⅱ组),分别静脉注射CTLA-4Ig及等量PBS,检测小鼠干预前后24 h尿蛋白、ANA抗体、ds-DNA抗体及干预结束2周后血清IL-17A、脾脏中Th17细胞和Treg细胞百分比。结果:末次干预2周后Ⅰ组的24 h尿蛋白、血清ANA及ds-DNA较Ⅱ组下降均有统计学意义(均P0.05)。末次干预2周后Ⅰ组血清中IL-17A、脾脏Th17细胞比例均较Ⅱ组低,而脾脏的Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的比例高于Ⅱ组,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论:CTLA4-Ig具有减轻B6.MRL-Faslpr/J狼疮鼠狼疮样病征的作用;上调Treg细胞、下调Th17细胞可能是CTLA-4Ig减轻B6.MRL-Faslpr/J狼疮鼠狼疮样病征的重要机制之一。