用RAPD技术对利什曼原虫kDNA、nDNA的分析

目的用RAPD技术分析利什曼原虫的kDNA及nDNA.方法用7种随机引物扩增L.infantum和L.donovani GS2的kDNA和nDNA,分析扩增结果并计算两虫种间kDNA和nDNA共享度F值.结果7种随机引物对两虫种的kDNA、nDNA均扩增出各自特有带型.L.infantum和L.donovani GS2两虫种间kDNA、nDNA扩增片段的F值分别为0.227和0.2.结论kDNA和nDNA均可作为利什曼原虫的RAPD扩增模板,这7种引物均可用于对L.infantum和L.donovani GS2进行RAPD分析.该两虫种kDNA、nDNA的共享度较低,说明二者遗传距离较远.在进行RAPD分析时,提取全DNA(包括kDNA和nDNA)进行扩增即可.     

用RAPD技术对利什曼原虫kDNA、nDNA的分析

目的 :用RAPD技术分析利什曼原虫的kDNA及nDNA。方法 :用 7种随机引物扩增L .infantum和L .donovaniGS2的kDNA和nDNA ,分析扩增结果并计算两虫种间kDNA和nDNA共享度F值。结果 :7种随机引物对两虫种的kDNA、nDNA均扩增出各自特有带型。L .infantum和L .donovaniGS2两虫种间kD NA、nDNA扩增片段的F值分别为 0 2 2 7和 0 2。结论 :kDNA和nDNA均可作为利什曼原虫的RAPD扩增模板 ,这 7种引物均可用于对L .infantum和L .donovaniGS2进行RAPD分析。该两虫种kDNA、nDNA的共享度较低 ,说明二者遗传距离较远。在进行RAPD分析时 ,提取全DNA (包括kDNA和nDNA)进行扩增即可     

北京再发黑热病利什曼原虫K26基因和ITS-1序列的多态性分析

目的 了解北京市再发黑热病病例的病原分子遗传背景。方法 使用PCR方法分别扩增其亲水性酰化表面蛋白B(K26)和核糖体DNA内转录间隔区Ⅰ(ITS-1),然后克隆测序,分析其多态性,构建系统发育树以确定患者感染原虫的虫种类型及其遗传关系。结果 K26基因扩增出626 bp大小片段,其长度与国内流行株差异明显,其氨基酸序列由14个氨基酸的基序重复排列组成,但个别位置发生氨基酸替代。K26序列的系统进化树分析显示,北京病例虫株与法国和西班牙的婴儿利什曼原虫相近,但与国内新疆、四川、河北等地的婴儿利什曼原虫虫株距离较远;ITS-1序列扩增出314 bp大小的片段,其系统发育分析显示与婴儿利什曼原虫Leishmania infantum属于同一分支。结论 该病例感染的为婴儿利什曼原虫L.infantum,且与国内其他流行区的虫株有一定差异。     

我国不同疫区杜氏利什曼原虫ITS片段的克隆及序列分析

为测定我国荒漠、山丘、平原疫区杜氏利什曼原虫分离株ITS序列并分析其序列差异,首先提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,然后将扩增出ITS片段克隆入PMD18-Tvector上,再用双脱氧链末端终止法测序。结果用PCR成功扩增出约1000bp的ITS片段,测序结果表明:本文报道的荒漠、山丘、平原疫区的3株杜氏利什曼原虫(L.dXJ771,L.dSC10,L.dSD2)的ITS序列大小分别为:1086、1027、1028bp。序列分析表明:我国杜氏利什曼原虫荒漠分离株(L.dXJ771)的ITS序列与平原分离株(L.dSD2)及山丘分离株(L.dSC10)的ITS序列有明显差异,平原分离株(L.dSD2)与山丘分离株(L.dSC10)的ITS序列也存在较明显差异,荒漠分离株(L.dXJ771)与山丘分离株(L.dSC10)的ITS序列差异略小于与平原分离株(L.dSD2)的ITS序列差异。     

杜氏利什曼原虫LACK基因真核表达重组质粒及其在真核细胞中的表达

利什曼原虫的 L ACK抗原是利什曼原虫活性蛋白激酶 C受体同源物 ,是一种新发现的抗原蛋白。我们以本实验室的重组质粒 T- L ACK为模板 ,PCR扩增获得 L ACK基因 ,与真核表达载体 pc DNA3.1( )定向重组 ,重组质粒经酶切和 PCR分析 ,含有约 95 0 bp的 L ACK基因 ,成功构建含有 L ACK基因的真核表达重组质粒 pc D-NA3- L ACK。将此重组质粒转染 COS- 7细胞 ,通过 RT- PCR及免疫荧光检测 L ACK基因在真核细胞中的表达。实验结果显示转染了重组质粒的 COS- 7细胞 ,其 RT- PCR及免疫荧光检测均呈阳性反应 ,证实重组质粒 pc DNA3-L ACK能在 COS- 7细胞中有效表达 L ACK蛋白。     

用虫种特异性线粒体基因序列鉴定2例疑似曼氏裂头蚴感染无虫病理标本

目的 探讨采用线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(CO1)基因特异性序列鉴定临床无虫病理标本中裂头蚴感染的可靠性.方法 应用免疫曼氏裂头蚴的兔血清检测病理切片中裂头蚴的抗原,有2例呈阳性,疑似裂头蚴感染的无虫病例,按照DNA提取试剂盒说明书提取核酸,用曼氏裂头蚴线粒体CO1基因特异性序列的两对引物作扩增.结果 经PCR 2次扩增后得到目的 序列,电泳条带出现在预期的位置.2例病理标本扩增的核苷酸序列与已知基因片断序列比对,引物F650/R800扩增条带符合率分别为100%和97%,引物F965/R1120扩增条带符合率均为100%.结论 用裂头蚴线粒体CO1特异性基因引物作重复PCR扩增,对鉴定无虫病理标本曼氏裂头蚴感染有诊断意义.     

新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病病原体SSU rRNA基因及k …

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术，对皮肤利什曼病（ＣＬ）病人（Ｐ１７）的病原体ＳＳＵ ｒＲＮＡ基因及ｋＤＮＡ进行分析。将新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病患者病变组织及有关利什曼原虫种株，Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ，Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ，Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ Ｘｉｎｊｉａｎｇ“７７１”株，分别抽提各标本的基因组ＤＮＡ和ｋＤＮＡ后，再用相应的引物，Ｒ２２２和Ｒ３３３ＰＣＲ扩增ＳＳＵ ｒＲＮＡ基因（３９７ｂｐ片段）和１     

特异性引物PCR鉴定鸡球虫种类与卵囊纯度的研究

为了建立鸡球虫种类的快速分子生物学鉴定方法,检测实验室保存虫株受污染状况,分别对单卵囊分离繁殖及实验室长期传代保存的6株巨型艾美耳球虫（EMSH01、EM4101、EMES01、EMBA01、EMTY01和EMTO01）、4株柔嫩艾美耳球虫（ETDS01、ETGD01、ETAD和ETAM）、1株堆形艾美耳球虫（EA1201）、1株变位艾美耳球虫（EMIS01）、1株毒害艾美耳球虫（ENGD01）收集卵囊,纯化、提取总DNA,根据巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、堆形艾美耳球虫的RAPD和SCAR分子标记、ITS-1区序列分别设计Tn-F与Tn-R、Mx-F与Mx-R、Ac-F与Ac-R、ET-1与ET-2、EM-1与EM-2、EA-1与EA-2等6对特异性引物,对13个虫株分别进行PCR扩增,1%琼脂糖电泳分析片段大小.结果显示：用引物Tn-F与Tn-R、ET-1与ET-2对ETDS01、ETGD01、ETAD、ETAM、EMTO01扩增出特异性条带,其余4种8个虫株未见条带;用引物Mx-F与Mx-R、EM-1与EM-2对EMSH01、EM4101、EMES01、EMBA01、EMTY01和EMTO01扩增出特异性条带,其余4种7个虫株未见条带;用引物Ac-F与Ac-R、EA-1与EA-2对EA1201扩增出特异性条带,其余4种12个虫株未见条带.结果说明特异性引物PCR方法鉴定的5种球虫与原常规生物学方法鉴定的结果一致,检测出保存的巨型艾美耳球虫EMTO01虫株受柔嫩艾美耳球虫污染,其余虫株未发现交叉污染.研究证明利用特异性引物建立的PCR方法可用于鸡球虫种类与卵囊纯度的鉴定.     

吉林地区山羊中泰勒虫感染检测及其序列分析

泰勒虫病是由泰勒科(Theileriidae)泰勒属Theileria原虫引起经蜱传播的一种疾病,可以侵袭羊的网状内皮系统细胞和红细胞,本次研究的目的是了解我国吉林地区山羊中泰勒虫的感染情况以及主要的基因型.在吉林珲春地区采集70份山羊血液标本.基于泰勒虫18S rRNA基因,分两段设计扩增全长的属特异引物,对采集到的血液样本进行PCR检测,将扩增产物进行测序,与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较,采用MEGA5.0软件进行遗传发育分析.结果表明在吉林珲春地区采集到的山羊血液标本中有51只(72.9％)山羊感染了泰勒虫,通过测序获得近全长1 600 bp的泰勒虫基因序列(KC429038).经过Blast序列比对分析,与吕氏泰勒虫Theileria luwenshuni最接近,和T.luwenshuni(JX469518)相差一个碱基,同源性为99％.从构建的系统发育树可以看出本研究所获得序列与吕氏泰勒虫T.luwenshuni最接近位于同一小分支.本研究说明我国吉林地区山羊中泰勒虫感染较为普遍,初步认为吕氏泰勒虫可能为本地区的一个较为流行的基因型.     

小鼠抗人小细胞肺癌单抗轻链可变区基因的体外扩增、克隆及序列分析

本文通过一对分别位于小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因 FR1骨架区和 FR4骨架区的通用引物,利用 PCR 技术首次从小鼠抗人小细胞肺癌2F7杂交瘤细胞染色体组总 DNA 中直接扩增出相应的免疫球蛋白轻链可变区基因,扩增出的基因片段经引物上引进的两个限制性内切酶位点直接克隆到装有人免疫球蛋白轻链恒区的克隆载体 pGEM-7Zf( )-V_kPCR 中的 EcoR1和 BglⅡ内切酶位点之间.通过对其进行顺序分析,结果表明我们克隆得到了免疫球蛋白轻链可变区基因,其长度为318bp.     

单细胞逆转录PCR实验方法研究

目的：探索建立稳定可靠的单细胞RT-PCR实验体系。方法：以人β-actin和DPH2L基因为靶基因，通过各个环节上实验条件的比较优化，对单细胞RT-PCR扩增单个细胞中特异性目的基因和全细胞mRNA两种方法的扩增效果进行深入研究，并结合琼脂糖凝胶电泳和DNA测序技术，分析该方法的灵敏性、特异性、重复性和忠实性。结果：单个细胞中的全部mRNA均得到了扩增，扩增成功率为75%，产物经核酸定量均可达到μg水平，足够常规分子生物学实验之用。β-actin和DPH2L基因均得到特异性扩增产物，未见基因组DNA污染，经BLAST比对为100%吻合，不同条件下扩增成功率在30%~90%之间。结论：单细胞RT-PCR是一种行之有效的单细胞基因表达的研究工具，提高Mg2+反应浓度并采用巢式引物有利于提高扩增成功率。     

单细胞RT-PCR实验方法研究

目的探索建立稳定可靠的单细胞RT-PCR实验体系。方法以人β-actin和DPH2L基因为靶基因,通过各实验条件的比较优化,对单细胞RT-PCR扩增单个细胞中特异性目的基因和全细胞mRNA两种方法的扩增效果进行深入研究,并结合琼脂糖凝胶电泳和DNA测序技术,分析该方法的灵敏性、特异性、重复性和可靠性。结果单个细胞中的全部mRNA均得到了扩增,扩增成功率为75%,产物经核酸定量均可达到μg水平,足够常规分子生物学实验之用。β-actin和DPH2L基因均得到特异性扩增产物,未见基因组DNA污染,经BLAST比对为100%吻合,不同条件下扩增成功率在30%～90%之间。结论单细胞RT-PCR是一种行之有效的单细胞基因表达的研究工具,提高Mg~(2 )反应浓度并采用巢式引物有利于提高扩增成功率。     

小卷蛾斯氏线虫不同品系RAPD分析及亲缘关系研究

本文运用PCR RAPD技术对小卷蛾斯氏线虫 (Steinernemacarpocapsae)A2 4、ALL、Beijing、BW、CB 16、CB 19、DD 136、ED、Mex、Mex Kapow、NC 116品系基因组的DNA多态性进行了分析。利用优化的RAPD反应体系和筛选的 6个引物对 11个线虫品系的DNA进行随机扩增 ,6个引物共扩增获得 4 2个RAPD标记 ,其中多态性标记为 2 9个 ,占 6 9 1%。DNA多态性分析表明 :小卷蛾斯氏线虫 11个品系可分为 6组 ,在组内 ,品系间的不相似性系数大多低于 0 15 ;而组间的不相似性系数则较大 ,表明小卷蛾斯氏线虫不同品系间具有丰富的遗传多样性 ;同时 ,同一地区采到的同一种线虫可能不属于同一类群 ;而不同地区采到的同一种线虫可能具有相似的遗传背景     

龙江血居吸虫和日本血吸虫的RAPD分析

龙江血居吸虫 ( Sangunicola lungensis)和日本血吸虫 ( Schistosoma japonicum)依次为冷血动物和温血动物血吸虫的重要代表种类。分别对日本血吸虫与龙江血居吸虫成虫和尾蚴全基因组进行 RAPD标记研究 ,筛选出 1 4种随机引物对 4种材料扩增得到 1 50条多态片段 ,其中日本血吸虫成虫和尾蚴之间的同源性为0 .60 9;龙江血居吸虫成虫和尾蚴之间的同源性为 0 .61 7,两种血吸虫成虫之间的同源性为 0 .1 4 8,尾蚴之间为 0 .1 4 5。说明了冷血和温血动物血吸虫 ,它们具有相近的遗传背景 ,同时揭示了同一种血吸虫 ,其成虫和尾蚴阶段存在一定的多态性 ,反映出在虫体发育过程中 ,基因组的结构可能发生变化。根据 2 8S r RNA特定基因片段的 RAPD分析 ,筛选出对两种血吸虫不同发育阶段具有特异性的扩增引物 ,进一步说明同一种血吸虫在不同发育阶段 2 8S r RNA基因片段存在的差异。     

水痘-带状疱疹病毒RAA检测方法的建立及初步应用

目的建立水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)的重组酶等温扩增(recombinase-aid amplification, RAA)快速检测方法。方法通过全球共享数据库下载VZV全基因组序列进行比对分析, 针对四个保守基因分别设计特异性引物与探针并筛选出最佳组合, 通过引物与探针浓度梯度筛选出最佳反应体系, 建立荧光型RAA检测方法。用VZV阳性质粒标准品与梯度稀释的临床样本评价方法的灵敏度, 以最低检出极限浓度的阳性质粒标准品进行重复实验评价方法的重复性, 以其他病毒核酸评价方法的特异性, 同时用本方法和荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR, qPCR)对临床样本进行检测并对检测结果进行比较。结果本方法筛选出针对开放阅读框架(open reading frame, ORF)28基因的引物对F2/R2与探针P2为最佳组合;考虑到成本因素, 最佳引物浓度为500 nmol/L, 最佳探针浓度为280 nmol/L;最低检出极限为101拷贝/μL, 最低可检测到Ct值为36.027的临床阳性样本;重复实验的检测...     

应用单分子触发式级联指数恒温扩增技术检测长链非编码RNA方法的建立

目的建立一种利用核酸恒温指数扩增技术特异性检测长链RNA的高灵敏度检测方法。方法利用恒温指数扩增(EXPAR)反应对所建立的方法进行反应条件的优化,并对该方法的通用性、特异性和灵敏度进行了系统分析。结果单分子触发反应产物可以作为引物触发指数恒温扩增;柔性引物可以提高检测特异性,柔性臂长7nt;单分子触发式级联指数恒温扩增技术能够有效检测出待检样品浓度在10fmol/L～100pmol/L范围内的靶标RNA,线性响应良好(R 2=0.955)。结论单分子触发级联式恒温指数扩增技术可以快速、准确检测长链RNA。     

双向等位基因特异性PCR快速区分纯合子和杂合子SNP分型的新方法

目的 建立一种基于单碱基改变基因分型的快速检测等位基因特异性双向PCR原理的改良SNP分型新方法:双向等位基因特异性PCR(Bi-PASA)在一次PCR反应中区分纯合子和杂合子的方法.方法 以SNP位点rs11293201和rs57148397为例,设计两个外部引物(F与R)和两个内部等位基因特异性引物(P与Q).同时与测序方法对比检测突变.结果 两个内部引物(P和Q)包含一个相对短的完全匹配区域和一个富含Gc的10核苷酸5'尾.当基因组DNA被先期扩增出的模板DNA取代时内引物完成从低效扩增到高效扩增的转变,其结果与直接测序完全一致.利用Bi-PASA参数的优化在人类SIP1基因常见突变的外显子中详细研究先天性巨结肠病,3种额外的Bi-PASA分析被快速优化.结论 Bi-PASA是一种简单快速而有效的SNP分型新方法,是在一个PCR反应中检测已知突变的方法.     

实验感染C57 BL/6N小鼠粪内蓝氏贾第鞭毛虫tim基因检测

建立蓝氏贾第鞭毛虫感染动物模型 ,用PCR技术对感染动物粪内该虫tim基因进行检测 ,探讨蓝氏贾第鞭毛虫基因检测方法。用人源蓝氏贾第鞭毛虫河北株 (CD)和江苏株 (XZ)的包囊分别接种两组C5 7BL 6N小鼠 ,于接种后第 6天、1 0天和 1 4天收集粪便标本 ,采用酚 氯仿法提取总DNA。将提取液分别按 1 0 0 、 1 0 - 1 、 1 0 - 2 和 1 0 - 3稀释并纯化。根据该虫磷酸丙糖异构酶 (Triosephosphateisomerase,tim)基因合成 1对特异性引物 ,采用PCR技术分别扩增各个稀释度的样本。结果贾第虫阳性样本均被扩增出相应基因的 1条 683bp长的片段 ,纯化后的各个稀释度样本的PCR检测阳性率随稀释倍数的增加而增高。本研究结果为贾第虫感染基因检测方法的进一步研究提供了实验资料。     

小卷蛾斯氏线虫不同品系RAPD分析及亲缘关系研究

本文运用PCR-RAPD技术对小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocapsae)A24、ALL、Beijing、BW、CB-16、CB-19、DD-136、ED、Mex、Mex-Kapow、NC-116品系基因组的DNA多态性进行了分析.利用优化的RAPD反应体系和筛选的6个引物对11个线虫品系的DNA进行随机扩增,6个引物共扩增获得42个RAPD标记,其中多态性标记为29个,占69.1%.DNA多态性分析表明小卷蛾斯氏线虫11个品系可分为6组,在组内,品系间的不相似性系数大多低于0.15;而组间的不相似性系数则较大,表明小卷蛾斯氏线虫不同品系间具有丰富的遗传多样性;同时,同一地区采到的同一种线虫可能不属于同一类群;而不同地区采到的同一种线虫可能具有相似的遗传背景.     

家蝇二氯苯醚菊酯抗性株分化的研究

本研究采用随机扩增多态DNA(RAPD)技术,探索了家蝇二氯苯醚菊酯抗性株(2000倍)在DNA分子水平上的分化。实验数据采用两种分析方法:1)用RAPDPLOT计算出个体间的遗传距离,进一步用PHYLIP软件包的NEIGHBOR程序进行UPGMA(非加权对组算术平均值聚类)聚类分析;2)经bootstrip方法随机取样100次,然后再进行UPGMA分析,在PHYLIP软件包的CONSENSE中形成合意树。两种分析方法结果极为类似,在聚类树中首先是抗性与非抗性个体分成两群,然后雌、雄个体分成两群,说明抗性株在DNA分子水平上已有明显的分化。OPD-02引物在全部抗性株个体中扩增出了非抗性株所没有的特异性同一片段(100bp左右),提示此片段有可能作为家蝇二氯苯醚菊酯抗性株的分子标记,但需进一步研究确定。