17β-雌二醇对大鼠心肌的促血管新生作用:促进微血管内皮细胞分泌VEGF

目的: 研究17β-雌二醇（17β-E2）对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMEC)的促血管新生作用。方法: 以体外培养的CMECs为模型，用免疫荧光染色法检测雌激素受体(ER)的表达。用MTT比色法检测不同剂量的17β-E2对细胞增殖的影响。用细胞划痕法检测加入17β-E2后细胞的迁移能力。用Millicell小室测定法检测17β-E2对细胞侵入能力的影响。用管样结构形成实验观察加入17β-E2后细胞分化的情况。用ELISA法检测17β-E2对细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）的影响。结果: 免疫荧光染色法检测显示，心肌微血管内皮细胞内存在ER。MTT比色法检测表明，17β-E2可明显促进CMECs的增殖，在其浓度为0.01 μmol/L时，可产生最大的增殖效应；而雌激素的拮抗剂三苯氧胺（TMF）则可阻断此效应。同时发现，17β-E2处理组CMECs的迁移能力和管样结构形成的能力，均明显强于对照组及17β-E2+TMF处理组。与对照组及17β-E2+TMF处理组相比，17β-E2处理组可明显促进大鼠CMESs分泌VEGF（P<0.01）。结论: 在体外环境中，17β-E2可刺激CMECs自分泌VEGF，提高CMECs血管新生的活性。     

阿司匹林对心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响

目的:探讨不同剂量阿司匹林对大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）血管新生功能的影响和可能的机制。方法:消化法分离大鼠CMECs，用不同浓度（1、10、100、1 000和5 000 μmol/L）的阿司匹林处理体外培养的大鼠CMECs后，分别用CCK-8比色法检测细胞增殖、TUNEL法检测细胞凋亡、划痕试验及Transwell小室评价细胞迁移能力、成管实验评价血管新生能力、Western blot法检测蛋白激酶B（AKT）磷酸化水平，ELISA法测定纤维连接蛋白（FN）表达。结果: ①1、10和100 μmol/L的阿司匹林对，CMECs的增殖、凋亡和AKT磷酸化水平无明显影响，1000、5000μmol/L的阿司匹林对组显著抑制CMECs增殖、下调AKT磷酸化水平、诱导细胞凋亡；②10、100 μmol/L的阿司匹林促进CMECs迁移、成管；③FN表达随阿司匹林浓度升高而升高。结论:①低浓度阿司匹林（1~100μmol/L）对CMECs的存活无明显影响，而高浓度的阿司匹林（1 000、5 000 μmol/L）显著抑制CMECs增殖、下调AKT磷酸化水平、细胞凋亡增多。②低浓度阿司匹林（1~100 μmol/L）作用下，阿司匹林促进CMECs迁移、成管能力，可能与阿司匹林作为环氧化酶（COX）抑制剂，减少前列环素（PGI2）生成引起FN表达上调有关。     

去天门冬氨酸血管紧张素Ⅰ减轻大鼠心肌微血管内皮细胞缺血/再灌注损伤

目的探讨去天门冬氨酸血管紧张素Ⅰ(DAA-Ⅰ)对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺血/再灌注损伤的影响。方法分离培养大鼠CMECs,建立模拟缺血/再灌注模型,完全随机分组,分为对照组、模拟缺血/再灌注组(SI/R组)、模拟缺血/再灌注+DAA-Ⅰ(2.5、3.75、5.0μmol/L)组。MTT检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,TUNEL法检测细胞凋亡,采用Western blot检测GRP78/Bip、CHOP/GADD153、pro-caspase-12、cleaved-caspase-12蛋白的表达。结果与对照组相比较,SI/R组CMECs增殖能力明显降低(P<0.01),凋亡率显著上升(24.85%±0.67%比3.55%±0.11%,P<0.01)。与SI/R组相比,SI/R+DAA-Ⅰ组细胞增殖能力明显升高(P<0.01)并呈剂量依赖性,细胞迁移率上升(P<0.01)并呈剂量依赖性,凋亡率明显下降(15.18%±0.40%比24.85%±0.67%,P<0.01)并呈剂量依赖性。与对照组相比较,SI/R组和SI/R+DAA-Ⅰ组的GRP78、CHOP/GADD153、cleaved-caspase-12表达明显上升(均为P<0.01)。与SI/R组相比,SI/R+DAA-Ⅰ组的GRP78、CHOP/GADD153、cleaved-caspase-12表达明显降低(均为P<0.01)。结论 DAA-Ⅰ可显著抑制缺血/再灌注损伤诱导的CMECs凋亡,促进CMECs存活,改善细胞功能,其保护作用可能与下调ERS相关蛋白的表达有关。     

三角波形低频脉冲磁场对大鼠心肌微血管内皮细胞增殖、迁移和细胞周期的影响

目的: 研究在固定时间和频率下,三角波形的低频脉冲磁场(LF-PMF)对大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）增殖、迁移以及细胞周期的影响。方法: 实验分为4组（对照组,1.0mT组,1.4mT组,1.8mT组）。对照组不加磁场干预;其余各组分别在频率为15 Hz,磁场强度分别为1.0mT、1.4mT和1.8mT,时间为4 h/d,连续照射3 d的条件下,用三角波形作用离体培养的大鼠CMECs。利用MTT法检测细胞增殖情况,transwell法观察细胞迁移状况,流式细胞仪技术检测细胞周期变化。结果: 1.4mT和1.8mT组磁场促进CMECs增殖的作用差异显著［(0.200±0.043)A值, vs.(0.159±0.037)A值,(0.225±0.042)A值,vs.(0.159±0.037)A值,P<0.05］。迁移能力与对照组相比也有显著提高［(27.20±4.76)个/视野 vs.(22.60±4.77)个/视野,(33.80±3.19)个/视野 vs.(22.60±4.77)个/视野,P<0.05］。CMECs在细胞周期中的分布发生改变,DNA合成期(S期)和合成后期(G2期)细胞的比例增加。1.0mT组LF-PMF胞对细胞增殖、迁移以及细胞周期的影响均不明显。结论: 低频脉冲磁场磁场对CMECs的生物学作用与磁场的强度相关,1.4mT和1.8mT组LF-PMF促进细胞增殖、迁移及使其DNA合成的能力提高。     

女性慢性完全闭塞病变患者的临床和影像学特点

目的:通过同期男女冠心病慢性完全闭塞（CTO）患者的比较分析女性CTO病变的临床和影像学特点。方法:1989年6月~2005年12月诊断冠心病的患者,入院后行常规实验室生化检查及X线胸片、心脏超声等临床辅助检查,并行冠状动脉造影及左室造影检查。入选有1支或1支以上CTO病变的患者进入本研究,按性别分为女性组（n=334）和男性组(n=1 382)。结果:与男性组比较,在临床资料方面,女性组年龄大［(64±8)岁 vs.(60±11)岁,P<0.01］,高血压病比例高(65.6% vs. 53.3%,P<0.01),而女性组体质量低［(65±10)kg vs.(75±10)kg,P<0.01)、吸烟比例低(11.1% vs.46.7%,P<0.01)、饮酒比例低(2.4% vs. 26.6%,P<0.01)、心肌梗死比例低(38.0% vs. 52.7%,P<0.01),在心绞痛、心律失常、心力衰竭、糖尿病 、脑血管病的比例均无统计学差异。实验室检查资料方面,女性组三酰甘油（TG）高［(2.3±2.0)mmol/L vs.(2.0±1.5)mmol/L,P<0.01)、总胆固醇（TC）高［(5.4±1.3)mmol/L vs.(5.0±2.4)mmol/L,P<0.01］、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）高［(1.4±0.5)mmol/L vs.(1.3±0.4)mmol/L,P<0.01 ］、空腹血糖（FPG）高［(6.1±1.7)mmol/L vs.(5.9±1.7)mmol/L,P<0.05］和纤维蛋白原（Fib）水平高［(4.1±1.3)g/L vs.(3.9±1.4)g/L,P<0.05 ］,而尿素氮低（BUN）［(5.6±2.4)mmol/L vs.(5.9±2.0)mmol/L,P<0.05］、血清肌酐（Cr）低［(81±31)μmol/L vs.(95±33)μmol/L,P<0.01］。心脏超声左室内径小［ (48±6)mm vs.(51±6)mm,P<0.01］,左室射血分数（LVEF）偏高［(0.64±0.10) vs.(0.63±0.11),P<0.05］。冠状动脉造影资料比较显示,两组在冠状动脉优势型、单支血管病变、多支血管病变、CTO血管分布、侧支循环0级、Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级比例及造影并发症发生中均无统计学差异。结论:女性CTO患者中代谢指标异常较为突出,且年龄较高,但女性CTO患者病变复杂程度与男性并无显著差异。     

右室室间隔起搏与心尖部起搏对心功能影响的比较

目的 比较右室室间隔起搏与心尖部起搏对患者心功能的影响。方法 180例患者随机分为右室室间隔部起搏组（n=98例）和右室心尖起搏组（n=82例）。比较两组患者术前与术后第18个月心脏彩超的变化。 结果 间隔组患者的左室射血分数（LVEF）较术前显著提高 ［（66±8）% vs （69±9）%,P<0.01］,心搏出量（SV）较术前显著提高［（83±15）ml vs (87±12）ml,P<0.01］,左室舒张末期内径(LVEDD)缩小未达显著水平［(52±5)mm vs (51±5)mm］,左室收缩末期内径(LVESD)无明显变化［(31±5)mm vs (31±5)mm］,而心尖组LVEF显著降低［(68±7)% vs (63±8)%,P<0.01］,SV显著减少了7 ml［(87±16)ml vs (80±10)ml,P<0.01］,LVEDD显著增大3 mm［(50±6)mm vs (53±7)mm,P<0.01］,LVESD显著增大 ［（30±5）mm vs (32±6）mm,P<0.05］,两组患者各观察指标同期比较术前无统计学意义,术后18个月LVEF差异有非常显著统计学意义（P<0.01）,SV差异有统计学意义（P<0.05）。结论 右室室间隔起搏较右室心尖部起搏更利于起搏器植入患者的心功能保护。     

辛伐他汀对雷帕霉素作用下的大鼠心肌微血管内皮细胞的影响

目的:探讨辛伐他汀(SIM)对雷帕霉素(RAPA)作用下大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)增殖、迁移、凋亡及一氧化氮(NO)分泌的影响。方法:用不同浓度(0、0.01、0.1、1及10μg/L)的RAPA处理CMECs 24 h,分别采用MTT比色法及transwell法检测细胞的增殖能力和迁移能力,并选择合适干扰浓度(抑制效果居中,即对细胞的增殖及迁移有一定的抑制作用,但不会完全抑制,选择浓度为1μg/L)。对已加入RAPA(1μg/L)的细胞中加入不同浓度(0、0.01、0.1、1及10μmol/L)的SIM,共孵育24 h,采用MTT比色法检测细胞的增殖能力,用transwell法检测细胞迁移能力,用Hoechst染色法计算细胞的凋亡率,用Griess反应检测NO的分泌活性。结果:与对照组相比较,单纯以RAPA干预细胞后,细胞增殖和迁移的能力均显著下降(P0.05,P0.01),且呈浓度依赖性。而在RAPA基础上加入不同浓度的SIM后,与单纯RAPA组比较,细胞的增殖能力及迁移能力均显著增强(P0.05,P0.01),NO的分泌活性明显升高(P0.05),细胞的凋亡率明显下降(P0.05)。结论:RAPA能抑制CMECs增殖及迁移、NO分泌并诱导其凋亡。而将CMECs与SIM共孵育24 h后,对RAPA诱导的细胞损伤具有抑制作用。     

高尿酸对血管内皮细胞eNOS基因表达的调节作用及其对血管新生的影响

目的探讨高尿酸对血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达调节作用及其对血管新生的影响。方法人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)在600μmol/L尿酸溶液中培养,应用RT-PCR和Western印迹分别检测各组细胞eNOS mRNA和蛋白表达,应用硝酸还原法检测各组细胞上清液中一氧化氮(NO)含量,应用人工基底膜检测细胞的管腔形成能力,应用鸡胚尿囊膜试验检测细胞的血管新生能力,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组HUVECs的增殖,应用划痕试验检测各组HUVECs的迁移能力。结果与对照组比较,600μmol/L的高尿酸培养HUVECs 48 h后,细胞eNOS mRNA转录水平、蛋白表达量、NO浓度显著下降(P0.01);HUVECs有聚集倾向,但未能形成管腔样网络结构;CAM的血管新生面积比率降低49.78%(P0.01);同时,细胞的增殖能力降低63.68%(P0.05),细胞的迁移能力下降38.70%(P0.01)。结论高尿酸抑制血管内皮细胞eNOS基因表达和NO含量;高尿酸抑制细胞的血管新生能力,同时抑制细胞增殖与迁移,其抑制的可能机制与高尿酸下调eNOS的表达有关。     

谷胱甘肽对糖基化终产物诱导平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨糖基化终产物(AGEs)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞的增殖作用和还原型谷胱甘肽(GSH)对AGE介导的动脉平滑肌细胞增殖作用的抑制机制。方法以体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞为实验模型,分为8组,每组12孔,每孔细胞密度1×10~5/mL,与不同浓度的糖基化终产物共同培养,并用不同浓度的谷胱苷肽干预。分别用噻唑蓝(MTT)比色法测定血管平滑肌细胞增殖和用夹心ELISA方法测定细胞的磷酸化P38丝裂素蛋白激酶(P-P38 MAPK)的浓度来探讨平滑肌增殖的机制和干预因素。结果 (1)AGEs对血管平滑肌细胞MTT吸光度的影响:经过AGEs干预,与对照组比较,血管平滑肌细胞MTT的吸光度(OD)值增高(P<0.01),分别为:B组0.43±0.146,C组0.49±0.16,D组0.48±0.185。但随着AGEs浓度增加,B、C、D组间MTT OD值无统计学上差异(P>0.05)。(2)GSH对AGEs干预的血管平滑肌细胞MTT吸光度的影响:在加入GSH的AGEs干预组,F、G、H组与AGEs(25 mg/L)对照组比较,MTT吸光度下降(P<0.01),分别是F组0.347±0.102,G组0.333±0.108,H组0.285±0.08。但随着GSH浓度增加,F、G、H组组间无统计学差异(P>0.05)。(3)AGEs对血管平滑肌细胞内P-P38 MAPK的影响:经过AGEs干预后,p-p38MAPK吸光度增加(P<0.01),B组0.65±0.17,C组0.85±0.26,D组0.94±0.17,分别为对照组0.26±0.06的2.5、3.2和3.6倍(P<0.01)。随AGEs浓度增加,C、D组与B组相比,P-P38有显著增加(P<0.01)。(4)GSH对AGEs干预的血管平滑肌细胞内P-P38的影响:在加入GSH的AGEs干预组,F、G、H组与B组即AGEs对照组比较,p-p38 MAPK吸光度降低(P<0.01),分别是F组0.356±0.09 G组0.281±0.07 H组0.256±0.072,与对照组相比分别下降45%,56%,60%(P<0.01)。随着GSH浓度增加,G、H组与F组相比,p-p38MAPK逐渐降低(P<0.01)。结论 (1)AGEs具有促进血管平滑肌细胞增值的作用,其作用机理可能与激活了P-P38MAPK信号传导通路有关。(2)GSH对AGEs介导的血管平滑肌细胞增值     

缬沙坦对伴有高血压病的代谢综合征患者血管性假血友病因子的影响

目的 观察伴有高血压病的代谢综合征（metabolic syndrome,MS）患者血浆血管性假血友病因子（von Willebrand factor,vWF）水平及应用缬沙坦后vWF的变化。方法 测定22例伴有高血压病的MS患者服用缬沙坦80 mg/d4周前后及29例健康体检者血浆vWF含量。结果 伴高血压病的MS患者血浆vWF显著高于健康对照者［(176±24)% vs (130±26)%,P<0.01］;vWF含量与收缩压（SBP）［r＝0.60,P<0.01］、舒张压（DBP）［r＝0.57,P<0.01］、平均动脉压（MAP）［r＝0.61,P<0.01］、体质量指数（BMI）［r＝0.53,P<0.01］、三酰甘油（TG）［r=0.36,P<0.05］、总胆固醇（TC）［r=0.49,P<0.01］、空腹血糖（FBG）［r＝0.45,P<0.01］呈正相关;缬沙坦治疗4周后,伴高血压病的MS患者血浆vWF水平较治疗前显著降低［(160±15)% vs (176±24)%,P<0.01］。结论 伴高血压病的MS患者血浆vWF水平较健康人明显增高;予缬沙坦治疗后,在有效降低血压的同时,可短期内降低vWF水平,改善血管内皮功能。     

Ghrelin对大鼠心肌微血管内皮细胞的作用

目的:探讨ghrelin对大鼠心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)增殖、迁移能力和分泌NO的影响。方法:以酶消化法获得SD大鼠的CMECs,采用Dil-ac-LDL吞噬试验鉴定CMECs。将新一代CMECs分5组分别干预24 h:即(A)空白对照组、(B)1×10-9mol/L ghrelin组、(C)1×10-8mol/L ghrelin组、(D)1×10-7mol/L ghrelin组和(E)ghrelin+拮抗剂LY294002组(1×10-7mol/L ghrelin和20μmol/L LY294002)。用MTT比色法检测ghrelin对CMECs增殖的影响;以transwell法检测ghrelin对CMECs迁移的影响。用硝酸还原法检测CMECs分泌NO的量。结果:Dil-ac-LDL吞噬试验表明,90%以上的CMECs表达Dil-ac-LDL。与对照组相比,10-8~10-7mol/L的ghrelin可明显促进CMECs增殖和迁移,以及NO分泌(P0.05);LY294002则能够明显抑制ghrelin对CMECs的促增殖和迁移作用,以及抑制ghrelin刺激CMECs分泌NO的作用(P0.05)。结论:一定浓度条件下,ghrelin能够促进心肌微血管内皮细胞(CMEC)的增殖、迁移和NO分泌,这可能与激活AKT/PI3K信号转导通路有关。     

辛伐他汀抑制糖基化终产物诱导心肌微血管内皮细胞炎性反应及机制探讨

目的观察羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制荆辛伐他汀对糖基化终产物(AGEs)诱导心肌微血管内皮细胞(CMECs)表达单核细胞趋化因子1(MCP-1)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)的抑制作用,探讨辛伐他汀在早期糖尿病心肌微血管炎性病变中的保护机制。方法将培养的CMECs用辛伐他汀预孵育6 h,加入400mg/L的外源性糖基化牛血清白蛋白共培养72 h,分为AGEs组和BSA对照组,分别采用ELISA法测定McP-1的表达;流式细胞仪测定ICAM-1的表达;RT-PCR法测定糖基化终产物特异性受体mRNA的表达;Western blot法检测内皮细胞表面特异性受体(RAGE)蛋白表达。结果与BSA对照组比较,AGEs组MCP-1、ICAM-1、RAGE mRNA及其蛋白表达明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。辛伐他汀预孵则显著抑制AGEs诱导的MCP-1、ICAM-1的表达,并在mRNA及蛋白水平下调RAGE蛋白的表达。结论辛伐他汀可能通过抑制AGEs-RAGE信号途径来发挥对糖尿病心肌微血管病变的保护作用。     

生长激素促分泌物受体的内源性配体ghrelin促进大鼠心肌微血管内皮细胞体外血管生成

目的 探讨生长激素促分泌物受体的内源性配体 ghrelin 对大鼠心肌微血管内皮细胞增殖、迁移和体外血管生成的影响,并探讨其潜在的信号转导途径.方法 (1)植块法分离成年SD 雄性大鼠的心肌微血管内皮细胞,Ⅷ因子免疫组织化学鉴定细胞种类并传代培养.(2)通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹法(Western blot)鉴定ghrelin及其天然受体(growth hormone secretagogue-receptor,GHS-R)在心肌微血管内皮细胞上mRNA 及蛋白的表达.(3)用不同浓度(10-9～10-7mol/L)的ghrelin干预心肌微血管内皮细胞后,检测心肌微血管内皮细胞的增殖、迁移及体外血管生成的变化.(4)用不同浓度(10-9～10-7 mol/L)的ghrelin 干预心肌微血管内皮细胞后,观察ERK2磷酸化表达.用MAPK/ERK2的特异性抑制剂PD98059提前干预细胞后,观察ghrelin对大鼠心肌微血管内皮细胞体外血管生成及ERK2磷酸化表达的变化.结果 (1)植块法培养的原代心肌微血管肉皮细胞纯度达95％左右,且具有形成管腔样结构的能力.(2)RT-PCR、免疫荧光、ELISA和Western blot检测发现ghrelin及GHS-R在心肌微血管内皮细胞上均有表达.(3)分别用10-9～10-7 mol/L的ghrelin干预心肌微血管内皮细胞后,发现10-8、10-7 mol/L ghrelin处理组心肌微血管内皮细胞的增殖明显高于正常对照组[分别为(12.37±0.70)和(12.73±0.78)pmol/L比(7.40±0.71)pmol/L,P值均为0.001],迁移亦明显高于正常对照组(分别为127.00±4.06和121.00±4.30比113.80±4.60,p值分别为0.001和0.03),体外的血管生成亦明显高于正常对照组[分别为(72.20±5.72)和(71.00±7.78)mm比(28.60±5.13)mm,P均＜0.001].(4)10-8、10-7mol/L ghrelin处理组ERK2的磷酸化表达水平明显高于正常对照组(分别为0.92±0.13和1.15 ±0.16比0.29±0.04,P均＜0.001).若提前用PD98059干预细胞,则能明显抑制ghrelin诱导的体外血管生成及ERK2的磷酸化表达.结论 ghrelin及其受体GHS-R在大鼠心肌微血管内皮细胞上均有表达,ghrelin可通过激活ERK2的磷酸化促进心肌微血管内皮细胞的体外血管生成.     

晚期糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞管样结构形成和崩解的影响及机制

目的研究晚期糖基化终产物(AGEs)对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)管样结构形成和崩解的影响及其初步机制。方法分离、培养SD大鼠CMECs,将AGEs-BSA与大鼠CMECs共同孵育,实验分为对照组(只加DMEM培养液)、BSA组(100 μg/ml BSA)、AGEs-BSA组(100μg/ml AGEs-BSA)。分别在孵育第1、3天时,用管样结构形成实验观察CMECs管样结构的长度;流式细胞仪检测CMECs的凋亡;ELISA法测定CMECs半胱天冬酶3(caspase-3)的活性。孵育1天采用Western blot法检测CMECs血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白的表达。结果第1天时,与对照组和BSA组比较,AGEs-BSA组CMECs管样结构的长度明显增加,VEGF蛋白表达显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01);而CMECs早期凋亡率及caspase-3的活性,差异无统计学意义(P>0.05)。第3天时,与对照组和BSA组比较,AGEs-BSA组CMECs的管样结构长度明显降低,CMECs早期凋亡率及caspase-3的活性显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 AGEs-BSA在早期可能通过自分泌VEGF促进CMECs管样结构的形成,晚期可能通过促进CMECs的凋亡,加速管样结构的崩解。     

糖基化终末产物诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能改变

目的 研究糖基化终末产物(AGEs)诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的变化及相关机制.方法 SPF级雄性Wistar大鼠20只,7～8周龄,体重260～280 g,分离培养大鼠视网膜内皮细胞,采用免疫荧光染色、流式细胞术和体外形成毛细血管样网络结构的方法进行鉴定.视网膜内皮细胞在AGEs刺激后,用噻唑蓝(MTT)法分析细胞的增殖能力;用膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染法检测细胞凋亡;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术检测细胞AGEs受体、人蛋白激酶C(PKC)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达变化.采用t检验进行统计学分析.结果 分离纯化的大鼠视网膜内皮细胞表达血管性血友病因子(vWF)并在人工基膜上形成毛细血管网络结构.AGEs以时间和剂量依赖的方式抑制大鼠视网膜内皮细胞增殖能力,在200 mg/L的AGEs组培养至第5天时细胞增殖能力低于对照组(t=8.9,P＜0.05),7 d和9 d时抑制作用更明显(t值分别为15.7和46.1,均P＜0.01).400 mg/L AGEs组在第3天开始出现细胞增殖减慢(t=12.5,P＜0.05),从第5天开始增殖速度明显低于对照组(t值分别为22.4、41.5和77.7,均P＜0.01).并且AGEs诱导视网膜内皮细胞凋亡.进一步分析发现AGEs上调了大鼠视网膜内皮细胞AGEs受体、PKC、ICAM-1和iNOS的mRNA表达(t值分别为91.8、9.22、16和42,均P＜0.01)和蛋白水平的表达(t值分别为20.2、12.3、7.7和13.9,均P＜0.01).结论 AGEs可能通过上调AGEs受体诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的改变.     

罗格列酮抑制糖基化终产物诱导心肌成纤维细胞增殖和结缔组织生长因子及Smad的表达

目的 探讨糖基化终产物(AGE)对培养乳鼠心肌成纤维细胞增殖、结缔组织生长因子(CTGF)和Smad2、Smad4蛋白表达的影响及罗格列酮的干预作用.方法 采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取心肌成纤维细胞,应用MTT法、流式细胞仪法分别观察不同浓度AGE及罗格列酮对心肌成纤维细胞的细胞增殖、细胞周期的影响,ELISA方法 检测细胞培养上清中TGF-β1水平,Westem印迹技术检测CTGF及Smad2、Smad4蛋白质表达.结果 在一定浓度范围内,AGE干预心肌成纤维细胞,随浓度的增加,细胞增殖更加显著,TGF-β1分泌增加,CTGF蛋白表达增加.罗格列酮(0.1、1、10μmoVL)干预后,随浓度的增加,抑制心肌成纤维细胞增殖(分别为0.823±0.072、0.785±0.060、0.601±0.081对0.981±0.049,P<0.05)、抑制心肌成纤维细胞分泌TGF-β1(分别为257.77±9.09、230.29±6.56、200.84±10.26对300,68±8.56,P<0.01)、抑制CTGF蛋白表达的作用都更加显著(分别为0.769±O.108、0.590±0.095、0.534±0.115对1.021±0.113,P<0.01).罗格列酮(1和10μmol/L)干预后可显著减少AGE诱导的Smad2的蛋白表达(分别为0.424±0.059对0.572±0.073,P<0.05;0.396±0.080对0.572±0.073,P<0.01),同时可显著减少AGE诱导的Smad4的蛋白表达(分别为0.580±0.063对0.672±0.059,P<0.05;0.556±0.051对0.672±0.059,P<0.01).结论 AGE刺激心肌成纤维细胞增殖及分泌TGF-β1,同时诱导CTGF、Smad2及Smad4蛋白表达,罗格列酮在一定程度上抑制AGE上述作用,表明罗格列酮抑制心肌成纤维细胞增殖的效应与CTGF/Smad通路密切相关.     

生存素在胰岛素抑制大鼠心肌微血管内皮细胞缺血再灌注损伤中的关键作用

目的探讨生存素(survivin,SVV)在胰岛素(Ins)抑制大鼠心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cell,CMECs)缺血再灌注损伤中的作用。方法分离培养大鼠CMECs,建立模拟缺血再灌注(SI/R)模型,随机分为对照组、对照+Ins组、SI/R组、SI/R+Ins组、SI/R+Ins+SVV RNA干扰组(SVV RNAi组)。采用MTT检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,TUNEL法检测细胞凋亡指数,Western blot法检测SVV蛋白表达。结果与对照组比较,SI/R组和SI/R+Ins组CMECs增殖能力明显降低(P<0.01),凋亡指数明显升高(P<0.01)。与SI/R组比较,SI/R+Ins组CMECs增殖能力明显升高(P<0.01),细胞迁移率升高(P<0.05),凋亡指数明显降低(P<0.01)。与对照组和SI/R组比较,SI/R+Ins组SVV表达明显升高(P<0.05)。RNAi抑制SVV表达后,在SI/R+Ins处理中,与未转染对照组和β-actin转染组比较,SVV RNAi组凋亡指数明显升高(P<0.01)。结论胰岛素可显著抑制缺血再灌注损伤诱导的CMECs凋亡,促进CMECs存活,改善细胞功能,其保护作用可能与上调SVV蛋白表达相关。