人可溶性TRAIL蛋白诱导多种肿瘤细胞的凋亡

探讨原核表达的凋亡激活因子－人可溶性ＴＲＡＩＬ蛋白放导多种肿瘤,尤其实体瘤细胞凋亡的人作用及与Ｐ５３突变的关系。方法ＰＣＲ扩增人ＴＲＡＩＬ密码子１１４－２８１,ＪＦ１１２５大肠杆菌表达,复发并纯化该可溶性片段。免疫组织化学分析各细胞株Ｐ５３的突变。     

含报告基因的凋亡素基因真核表达载体构建研究

目的构建含报告基因的凋亡素基因真核表达载体。方法对pMD18T-VP3质粒进行EcorI和BamHI双酶切,回收366 bp（含凋亡素基因完整序列）片段。对增强型绿荧光蛋白pEGFP-C2质粒酶切,回收载体大片段。将凋亡素基因通过连接反应,连接到增强型绿荧光蛋白（EGFP）基因C末端的终止密码前,并使两者读框不移位,构建成pEGFP-VP3质粒,并对其进行酶切分析和测序鉴定载体结构。结果通过对构建的pEGFP-VP3质粒酶切、电泳,出现了366 bp的电泳条带,与凋亡素基因片段一致。凋亡素基因真核表达载体测序鉴定结果表明,本研究合成的凋亡素基因与Genbank中报告的凋亡素基因序列一致,同源性为100%。结论将凋亡素基因连接于增强型绿荧光蛋白的C末端,成功构建了凋亡素—增强型绿荧光蛋白表达载体pEGFP-VP3。     

流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的：探讨流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒是否具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。方法：流感病毒及经紫外线照射后的病毒分别以20m．o．i．感染Hela细胞，于不同时间取细胞分别在电镜下观察细胞超微结构的改变．Annexin-VFITC/／PI流式细胞仪进行凋亡定量分析。结果：流感病毒作用于Hela细胞后6h电镜下即可见细胞凋亡的改变。流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡百分率随时间延长而增高，于12～24h达高峰，流感病毒诱导凋亡百分率最高达40．2％，紫外线照射后的流感病毒最高达16．4％。结论：流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒均有诱导肿瘤细胞凋亡的能力，但流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的能力要比经紫外线照射后的流感病毒强。     

诱导肿瘤细胞凋亡的中药研究

肿瘤的治疗除了传统的放疗、化疗、手术切除等以外，一种全新的治疗方法——“细胞凋亡疗法”正逐步变成现实。同时，人们在研究中发现，传统中药能够明显的诱导肿瘤细胞的凋亡。利用传统中药从肿瘤细胞凋亡角度治疗癌症，不仅为癌症治疗提供了新方法，而且为传统中药的发展开辟了新途径。目前，诱导肿瘤细胞凋亡的中药研究主要集中在2个领域：单味药与复方药。     

诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达载体构建研究

目的　构建一种诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达系统 ,以制备抗原物质凋亡素融合蛋白。方法　通过PCR的方法 ,以pcDNA -VP3质粒为模板 ,扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体 pET DsbA的多克隆位点 ,构建成凋亡素的高效原核表达载体 pET DsbA VP3,将该质粒转化到大肠杆菌E .coliBL2 1 (DE3) plysS中 ,以异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (isopropylthio β D galactoside,IPTG)对其进行诱导表达 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。 结果　转化有凋亡素原核表达载体pET DsbA VP3的大肠杆菌E .coliBL2 1 (DE3) plysS经IPTG诱导后 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳出现 38 3KD的目的蛋白条带。结论凋亡素原核表达载体 pET DsbA VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白     

流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的:探讨流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒是否具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。方法:流感病毒及经紫外线照射后的病毒分别以20m.o.i.感染Hela细胞,于不同时间取细胞分别在电镜下观察细胞超微结构的改变,Annexin-VFITC/PI流式细胞仪进行凋亡定量分析。结果:流感病毒作用于Hela细胞后6h电镜下即可见细胞凋亡的改变。流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡百分率随时间延长而增高,于12～24h达高峰,流感病毒诱导凋亡百分率最高达40.2%,紫外线照射后的流感病毒最高达16.4%。结论:流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒均有诱导肿瘤细胞凋亡的能力,但流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的能力要比经紫外线照射后的流感病毒强。     

硒诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的：研究硒抑制肿瘤细胞生长的机理。方法：采用ＤＮＡ电泳及流式细胞仪分析等方法。结果：硒能诱导Ｈｅｌａ细胞凋亡。１．５％琼脂凝胶电泳呈现典型的阶梯现象。流式细胞仪检测显示大量的亚二倍体细胞。结论：硒促进ＨｅＬａ肿瘤细胞凋亡，可能是硒抑制肿瘤细胞生长的机理之一。     

人骨形成蛋白与肿瘤细胞凋亡

骨形成蛋白 (ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ ,ＢＭＰ)最初因其具有诱导骨形成的作用而得名。随着研究的不断深入 ,人们发现它还是一个多功能因子 ,在胚胎发生和发育、组织与细胞的分化和增殖等方面起重要作用。Ｗｏｚｎｅｙ[1] 于 1988年首次报道了人ＢＭＰ 1、ＢＭＰ 2Ａ、ＢＭＰ 2Ｂ和ＢＭＰ 3的ｃＤＮＡ克隆及表达 ,以后相继有 16种不同的人骨形成蛋白ｃＤＮＡ得到克隆。目前国内也已克隆了多种ＢＭＰ亚型的ｃＤＮＡ ,在ＢＭＰ家族中 ,具有较强功能活性者为ＢＭＰ 2、ＢＭＰ 4和ＢＭＰ 7。1　ＢＭＰ的结构特征和理化性质…     

EGF-Linker-TCS融合蛋白诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡

目的表达和纯化由人表皮生长因子、柔性肽和天花粉蛋白组成的融合蛋白(EGF-Linker-TCS),检测其对肿瘤细胞的杀伤能力并探讨其在肿瘤治疗中的可能作用。方法诱导、表达EGF-Linker-TCS嵌合毒素,使用HiTrap Chelating亲和层析纯化,采用生长曲线、结晶紫法、电镜和流式细胞仪等技术研究EGF-Linker-TCS对肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。结果EGF-Linker-TCS纯度达到95%,细胞活性检测证明EGF-Linker-TCS能够明显抑制肝癌细胞的生长和集落形成,0.1μg/mlEGF-Linker-TCS和1μg/mlEGF-Linker-TCS作用于肝癌BEL-7402细胞,集落形成率分别为(15.17±1.19)%和(7.83±1.32)%,明显低于对照组(31.23±3.98)%(P<0.05)。EGF-Linker-TCS对BEL-7402细胞有较强的细胞毒作用,IC50为10.98μg/ml。结论EGF-Linker-TCS嵌合毒素对肝癌BEL-7402细胞有增殖抑制和诱导细胞凋亡作用,具有治疗肝癌的潜在价值。     

创伤弧菌溶细胞素融合蛋白诱导人Jurkat-T淋巴细胞凋亡的研究

目的：探讨创伤弧菌溶细胞素融合蛋白（rVvhA）对人Jurkat T淋巴细胞凋亡的作用及凋亡过程中Caspase-3酶活性的变化。方法：利用基因工程方法体外表达、制备和纯化rVvhA;MTT法检测rVvhA对Jurkat T淋巴细胞的细胞毒活性影响;Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测rVvhA诱导Jurkat T淋巴细胞凋亡情况;Hochest33258荧光染色激光共聚焦显微镜观察rVvhA诱导Jurkat T细胞核形态的改变;分光光度法检测凋亡过程中Caspase-3酶活性的变化。结果：纯化复性后rVvhA的纯度达到92%以上;MTT结果显示rVvhA活性蛋白能显著抑制Jurkat T淋巴细胞的生长,有效浓度为1.5 HU/mL;流式细胞仪和激光共聚焦检测发现rVvhA作用后Jurkat T淋巴细胞核固缩,产生亮蓝荧光,1.5 HU/mL rVvhA,作用4 h后即可有效诱导其凋亡,凋亡率为（39.13±3.33）%,对照组为（3.43±0.34）%,且能被Caspase全酶抑制剂一定程度抑制。1.5 HU/mL rVvhA作用Jurkat T淋巴细胞3 h,Caspase-3酶活性达到高峰。结论：rVvhA能损伤人Jurkat T淋巴细胞,诱导其发生细胞凋亡,Caspase-3可能在rVvhA诱导的Jurkat T细胞凋亡过程中起重要作用。     

分泌型PTD4-Apoptin融合蛋白诱导HepG2细胞凋亡

目的研究分泌型的含蛋白质转导结构域的凋亡素(PTD4-Apoptin)融合基因经人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达和分泌后,对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响,探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法构建PTD4-Apop-tin融合基因的pSecTag2分泌型真核表达载体,并采用脂质体介导将其转染入HUVEC细胞,Western blot检测PTD4-Apoptin融合蛋白的表达及分泌,转染48h后收集培养上清作为条件培养液,用于HepG2、L02细胞培养,共培养24h后,采用Western blot检测细胞内和核内Apoptin的含量,流式细胞术检测细胞凋亡。结果瞬时转染pSecTag2-PTD4-Apoptin的HUVEC细胞可表达及分泌PTD4-Apoptin融合蛋白,其培养上清中的PTD4-Apoptin融合蛋白可有效进入HepG2和L02细胞,并可在HepG2细胞核内聚积,显著诱导HepG2细胞凋亡达47.4%(P<0.001),而对L02细胞无此效应。结论 HUVEC细胞表达分泌的PTD4-Apoptin融合蛋白可显著诱导邻近HepG2细胞凋亡,而对L02正常肝细胞无损伤。     

增强型绿色荧光蛋白-C1转染示踪骨髓间充质干细胞

目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protein,pEGFP-C1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）,以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法：在体外分离培养大鼠MMSCs,流式细胞仪检测细胞表型,以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因,荧光显微镜观察基因表达。结果：pEGFP-C1在基因转染24 h后开始表达,48-72 h达高峰,12-14 d后有较多的表达。结论：由脂质体介导的质粒pEGFP-C1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。     

鹅绒藤中的黄酮苷类诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的观察不同浓度的鹅绒藤中黄酮苷类单体化合物山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷（Monomer Compounds-Ⅴ,MC-Ⅴ）诱导肿瘤细胞凋亡的形态学变化及其凋亡率的检出。方法用浓度50、100和200μg·mL-1的MC-Ⅴ作用人宫颈癌Hela细胞、人胃癌MGC-803细胞和小鼠淋巴瘤YAC-1细胞48h和72h后,采用细胞凋亡荧光Hoechst33342/PI双染方法,在荧光显微镜下观察肿瘤细胞在加MC-Ⅴ后的形态变化过程,并计算三种肿瘤细胞的凋亡率。结果镜下可见正常对照组细胞质染色均匀,形态规则,呈均匀微弱蓝光;所有MC-Ⅴ作用的肿瘤细胞核固缩,染色质凝集,随着浓度的增加和作用时间的延长,细胞膜损坏加剧;在MC-Ⅴ作用的三种肿瘤细胞中,作用于Hela细胞,染色质边集化,部分染色质裂断;作用于MGC-803细胞,染色质部分高度凝集,核碎裂、边集化严重,呈现不均一的荧光显色结构;作用于YAC-1细胞,细胞核固缩凝集成小团块状结构。三种肿瘤细胞的凋亡率均随MC-Ⅴ浓度的增高及作用时间的延长而增大。结论MC-Ⅴ可以诱导不同的肿瘤细胞显示不同的凋亡形态,并呈时间和剂量依赖性,提示其作用于肿瘤细胞的作用机制不同。     

预防性葛根素抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

目的探讨预防性葛根素对UVB诱导的HaCa T细胞凋亡的影响。方法 HaCa T细胞与0.49、1.0mg.mL-1葛根素孵育1h后,以30mJ.cm-2UVB直接照射细胞,24h后收集细胞测定细胞凋亡率和p53蛋白。结果葛根素预处理HaCa T细胞的凋亡率下降,同时细胞表达的p53蛋白减少。结论预防性葛根素抑制UVB诱导的HaCa T细胞凋亡,可能与下调p53蛋白有关。     

β1整合素过表达抑制顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨β1整合素过表达对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响及其机制。方法功能性β1整合素稳定过表达Hep3B细胞系用于实验。采用WST-1细胞增殖实验试剂盒检测细胞增殖,DNA梯形条带和Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。结果与亲株、空载体转染Hep3B细胞相比,β1整合素过表达明显抑制顺铂诱导的肝癌细胞凋亡。细胞外信号调节激酶(ERK)抑制物PD98059和p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制物SB203580能够明显减弱β1整合素对细胞凋亡的保护作用,但Jun激酶抑制物SP600125不能减弱β1整合素的保护作用。结论β1整合素能够通过ERK和p38MAPK信号通路抵抗顺铂诱导的肝癌细胞凋亡。β1整合素介导的细胞外基质信号与肝细胞肝癌化疗耐药有关。     

F10基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位

目的：构建F10基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体，进而观察F10基因编码蛋白在细胞内的定位情况。方法：运用RT—PCR技术从葡萄胎组织中分离F10基因的完整ORF，构建pEGFP-N2／F10和pEGFP—C2／F10的融合表达载体，以1Apofect AMINE2000为介导剂，将重组载体转染入人乳腺癌细胞MCF-7，并在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察表达的融合蛋白。结果：显微镜下观察到，GFP／F10融合蛋白呈不规则的颗粒状、环状分布于细胞核，或细胞浆，或者在核浆中均有分布，而且在细胞浆中主要分布在细胞器中。而对照的pEGFP蛋白均匀分布在整个细胞浆和细胞核。结论：F10蛋白在细胞的不同周期分布不同，或在细胞核，或在细胞胞浆中，或者在核浆中均有分布。     

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导入脐静脉内皮细胞

目的研究PEP—1—EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力。方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP—1—EGFP融合蛋白，将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育，分别观察其进入细胞的能力及PEP—1—EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性，并用MTr法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性。结果EGFP蛋白不能进入细胞内。PEP-1-EGFP融合蛋白可在5min内穿透人脐静脉内皮细胞，其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性，进入细胞后27h仍可观察到微量绿色荧光。PEP-1-EGFP蛋白浓度达200umol／L时对细胞仍无毒性。结论PEP—1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞，这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础。     

CD3AK细胞诱导白血病Jurkat细胞凋亡的实验研究

目的探讨CD3AK细胞诱导白血病Jurkat细胞凋亡的效果.方法用细胞形态学观察,DNA琼脂糖电泳,原位末端标记法分别检测Jurkat自然凋亡率和CD3AK细胞诱导的Jurkat细胞凋亡率.结果 Jurkat细胞自然凋亡率为(4.60±2.17)%;CD3AK细胞诱导的Jurkat细胞凋亡率为(27.38±4.91)%,两者之间具有显著性差异(t=15.1P＜0.01).结论 CD3AK细胞能诱导白血病Jurkat细胞凋亡.     

结肠肿瘤细胞株体外培养过程中的自发性凋亡的观察

研究了Ｖ２３５Ｅ、Ｖ２３５Ｌ、Ｖ４１１三个结肠肿瘤细胞株的细胞凋亡现象。ＤＮＡ电泳分析和ＡＯ／ＥＢ荧光染色形态学检查表明，这三个肿瘤细胞株均存在自发性凋亡。提示肿瘤细胞，包括恶变的癌细胞仍可保留与增殖相对立的凋亡过程。肿瘤细胞存在自发性细胞凋亡的观察，有助于更好地认识肿瘤的发生和发展过程。此外，这些细胞株也为进一步研究细胞凋亡的诱导及其调控提供了有用的细胞模型。     

高氧诱导A549细胞凋亡

目的探讨高浓度氧（高氧）诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞（A549细胞）凋亡的机制。方法以A549细胞为研究对象,将细胞随机分成正常对照组和高氧干预组。正常对照组采用正常培养,高氧干预组用含95%O2和5%CO2混合气行高氧损伤,分别检测A549细胞的细胞活力、细胞凋亡率和capase-8的表达。结果高氧干预组细胞活力OD值（0.39±0.03）明显低于正常对照组（0.57±0.08）,高氧干预组细胞凋亡率和capase-8表达的IOD值[（9.55±0.04）%;（1368.44±19.61）]均明显高于正常对照组[（0.26±0.04）%;（934.29±37.40）],差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论高氧可诱导A549细胞caspase-8表达增加,导致A549细胞凋亡。