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1.
目的:构建含目的基因人端粒逆转录酶(hTERT)重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,体外感染原代大鼠肝细胞,观察对大鼠肝细胞增殖的影响.方法:将hTERT插入逆转录病毒载体pLNCX2获得重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,转染包装细胞293T后可获得表达hTERT逆转录病毒,感染体外培养的原代大鼠肝细胞,通过RT-PCR及western-blot检测基因在细胞中的表达情况.结果:重组载体pLNCX2-hTERT经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确.转染原代大鼠肝细胞后能明显促进其增殖.结论:体外转染原代大鼠肝细胞后能有效促进其增殖,这为进一步解决人工肝细胞来源问题奠定了实验基础. 相似文献
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目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(UCBMSCs)中导入hTERT基因,观察该基因的表达。方法:PCR法扩增出hTERT全部片断,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞,检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达。结论:hTERT-逆转录病毒载体构建成功,在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达。 相似文献
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逆转录病毒转染后骨髓间充质干细胞中人Dmp-1表达的变化 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 探讨构建的pLNCX2-Dmp-1逆转录病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)后,外源性基因牙本质基质蛋白-1 (Dmp-1)表达的变化.方法 含人Dmp-1基因的逆转录病毒液pLNCX2-Dmp-1转染原代培养后扩增的第5代BMSCs,用免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测Dmp-1的表达.结果 用逆转录病毒液pLNCX2-Dmp-1转染BMSCs后,免疫荧光检测发现,在大多数细胞内Dmp-1都有明显的表达,而没有用pLNCX2-Dmp-1病毒液处理的BMSCs则无明显表达,RT-PCR和Westem blotting的检测也支持免疫细胞化学的结果.结论 构建含人Dmp-1基因的逆转录病毒载体pLNCX2-Dmp-1转染BMSCs后可上调目的 基因的表达. 相似文献
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hTERT转染神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA检测 总被引:2,自引:2,他引:0
目的以逆转录病毒PLXSN为载体,将hTERT基因转染入体外培养的人神经干细胞,检测神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA表达情况,为建立永生化神经干细胞系提供一种新的思路.方法体外扩增人神经干细胞及基因转染后,应用PCR-ELISA法检测神经干细胞端粒酶活性,荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达情况.结果通过逆转录病毒介导的hTERT基因转染人神经干细胞后,端粒酶活性明显升高,持续表达,hTERT mRNA也早期呈高水平表达,但继之下降,维持在一个较低水平.结论转染hTERT基因后的神经干细胞具有表达高水平端粒酶活性,并稳定表达,这为建立基因工程的永生化神经干细胞系奠定了基础.而hTERT mRNA则逐渐下降,并维持在一个较低水平,不能作为检测神经干细胞增殖和分化能力的指标. 相似文献
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目的 构建携带人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量. 相似文献
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BRCA1对MCF-7细胞hTERT基因表达的抑制作用研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的将BRCA1真核表达质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞中,观察外源性BRCA1基因转染MCF-7细胞后对hTERT蛋白表达的抑制作用及对细胞增殖的影响.方法应用脂质体法将BRCA1真核表达质粒转染至乳腺癌MCF-7细胞中,Western blot检测转染细胞中hTERT蛋白表达的变化.MTF比色试验观察BRCA1真核表达质粒转染后MCF-7细胞增殖活性的变化.结果外源性BRCA1真核表达质粒组MCF-7细胞较未转染组MCF-7细胞hTERT蛋白表达明显减弱.BRCA1基因转染后的MCF-7细胞的增殖活性明显降低.结论外源性BRCA1基因的表达可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞中hTERT基因的表达,并抑制MCF-7细胞的增殖能力.BRCA1基因的表达异常可能在乳腺肿瘤发生发展机制中具有重要的作用. 相似文献
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目的 构建抑癌基因PTEN的真核表达载体,研究外源性PTEN基因稳定表达对人卵巢癌细胞系SW626体外增殖的影响.方法 构建PTEN基因的真核表达载体pcDNA3.1/PTEN,转染重组质粒pcDNA3.1/PTEN于体外培养的人卵巢癌细胞系SW626,筛选并获得稳定表达PTEN基因的细胞克隆,应用RT-PCR和western blot分析PTEN基因的mRNA及蛋白质表达,MTT实验分析细胞增殖能力.结果 稳定转染PTEN基因的细胞系有外源目的 基因的mRNA及其蛋白表达.MTT实验表明,pcDNA3.1/PTEN 转染组细胞增殖能力低于pcDNA3.1(-)转染组和对照组 (P<0.05).结论 外源性抑癌基因PTEN的稳定表达可抑制人卵巢癌细胞系SW626的增殖. 相似文献
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[目的 ]研究逆转录病毒介导的人肿瘤坏死因子α(TNFα)基因转染对人胆管癌细胞生长的抑制作用。 [方法 ]构建逆转录病毒 -TNFα(pLNCX -TNFα)复合体 ,转染人胆管癌细胞得到稳定表达 ,通过聚合酶链式反应 (PCR)、流式细胞仪 (FCM )、免疫组织化学等方法检测基因表达、细胞生长增殖和细胞凋亡等情况。 [结果 ]pLNCX -TNFα基因转染人胆管癌细胞后 ,pLNCX空质粒转染组、pLNCX -TNFα基因转染组的细胞均能扩增出 70 8bp的基因片断 ,而未转染组则无 ;pLNCX -TNFα基因转染组的细胞克隆抑制率为 6 4% ,与对照组和 pLNCX空质粒转染组相比 ,差异性非常显著 (P <0 .0 1 ) ;转染的人胆管癌细胞G1期比例从 2 9.0 7%增加到 5 4.2 4 % ,G2 -M期和S期比例分别从 5 2 .0 3%下降到 2 .0 2 % ,1 8.32 %下降到 1 0 .34% ;凋亡细胞数从 5 .83%增加到34.76 %。[结论 ]TNFα基因通过诱导胆管癌细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞抑制胆管癌细胞的生长。 相似文献
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目的:探索将人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转入兔软骨细胞以获取大量种子细胞的方法和技术。方法:分离培养原代兔软骨细胞,以pcDNA3.1/Zeo(+)-hTERT载体进行基因转染,对照组则为空载体pcDNA3.1/Zeo(+),筛选并挑选出阳性克隆后扩增,以逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测转染hTERT基因后的软骨细胞hTERT mRNA表达;甲苯胺蓝染色判断转染hTERT基因后的软骨细胞是否具有软骨细胞的生物学特性;流式细胞术检测细胞周期及核型;裸鼠致瘤实验观察成瘤情况。结果:RT-PCR检测RNA水平上hTERT在细胞中的表达情况,hTERT转入兔软骨细胞后细胞形态未发生变化,长满单层后仍然呈现出多角形,与正常体外培养的软骨细胞形态基本一致。甲苯胺蓝染色后可见多糖染成蓝紫色,呈现较小蓝紫色颗粒,蛋白多糖等基质分布均匀,即转染hTERT基因后的软骨细胞具有合成和分泌软骨相关基质的功能。细胞周期测定转染hTERT的兔软骨细胞的增殖能力明显上升,细胞分裂基本以整数二倍体方式进行,保持了核型的基本稳定。裸鼠接种不致瘤。结论:转染hTERT的软骨细胞表型未发生转化,具有作为种子细胞和研究正常软骨细胞的生理、生化工具细胞的可行性。 相似文献
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摘要:目的研究ABCEl基因表达对人大细胞肺癌H460细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其机制。方法体外培养H460细胞,分为A组(转染ABCE1-siRNA-1组)、B组(转染ABCEl-siRNA-2组)、C组(转染空质粒组)以及D组(空白对照组)。将构建好的ABCEl的siRNA(小干扰RNA)载体转染人培养的细胞中,荧光显微镜下观察转染效率,WesternBlot法检测ABCEl蛋白以及RNaseL蛋白的表达,RT—PCR法检测ABCElmRNA的表达,MTT法分析细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果将构建好的载体成功转入了H460细胞,转染后A、B组的细胞活性降低,ABCEl的表达受到阻断俨〈0.01),RNaseL蛋白含量明显增加(P〈0.01),细胞的增殖能力明显降低并逐渐凋亡(P〈0.01)。结论ABCEl基因可促使人大细胞肺癌H460细胞增殖并抑制细胞凋亡,其机制是阻断了2-5A/RNaseL细胞通路。 相似文献
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人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法:用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2.0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果:PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98.73%,氨基酸序列同源性为99.68%。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28.4%。结论:成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。 相似文献
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目的 构建含ERGIC3基因真核表达载体,并转染至支气管上皮细胞株BEAS-2B,筛选并建立ERGIC3稳定表达的细胞株,为进一步研究ERGIC3在肺癌中的作用奠定基础.方法 采用RT-PCR方法获取人类ERGIC3基因的ORF框的DNA序列,构建逆转录病毒载体pLXSN-ERGIC3,用PT-67细胞包装后获得病毒颗粒;用病毒颗粒感染BEAS-2B细胞,通过G418筛选获取整合了外源基因ERGIC3的单克隆化细胞;采用定量RT-PCR和Western blot对ERGIC3稳定表达的细胞株进行鉴定,并用划痕实验分析稳定转染细胞株的迁移能力和形态学变化.结果 获得4个ERGIC3稳定表达的BEAS-2B细胞株,ERGIC3的表达量均远高于对照组细胞,分别为对照组细胞的45.3、48.8、41.5和28.2倍,且稳定转染细胞株的迁移能力也显著增强(P<0.05),但其形态学没有明显变化.结论 成功构建了含ERGIC3基因真核表达载体pLXSN-ERGIC3;筛选出多个ERGIC3基因稳定转染的BEAS-2B细胞株,且迁移能力明显提高. 相似文献
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目的:研究自杀基因胞嘧啶脱氨酶(CD)基因转染的小鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)联合酶前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)对小鼠肝癌细胞株H22的体外抗增殖作用。方法:分离普通小鼠骨髓源性EPCs,培养鉴定,Polybrene技术转染含CD基因的慢病毒载体重组体plenti6.3-EGFP-CD至EPCs,Western blotting检测目的蛋白的表达。利用Transwell小室共培养体系,用转染CD基因的EPCs处理H22细胞。 CCK-8法检测H22细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果:成功转染CD基因至EPCs;CCK-8法检测显示随着5-FC浓度增加,细胞增殖逐渐下降,5-FC浓度达100 mg· L-1时,肿瘤细胞增殖抑制率达到(54.74±5.38)%(P<0.05),细胞平均凋亡率为(48.71±4.62)%(P<0.05)。结论:CD基因修饰的EPCs 联合5-FC体外可明显抑制肝癌H22细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。 相似文献
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RNAi沉默Survivin基因抑制人鼻咽癌细胞生长 总被引:1,自引:0,他引:1
目的观察RNA干扰沉默Survivin基因对人鼻咽癌CNE2细胞在体内外生长的抑制作用。方法将Survivin特异性shRNA表达载体pGenesil-1-survivin经Lipofectamine。”2000介导转染人鼻咽癌CNE2细胞,经G418筛选获得稳定转染的CNE2细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞转染效率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot分别检测Survivin基因mRNA和蛋白表达水平;噻唑蓝(MTF)法检测细胞增殖能力的变化。以稳定转染细胞建立裸鼠荷瘤模型,观测瘤体积的变化,绘制移植瘤生长曲线。结果流式细胞仪检测pGenesil-1-survivin细胞转染百分率为(87.13±2.21)%;RT.PCR和Westernblot结果显示,pGenesil-1-survivin组对人鼻咽癌CNE2细胞SurvivinmRNA和蛋白的抑制率分别为64.55%和51.24%,均较随机序列构建载体的阴性对照(pGenesil-1-NC)组和空白对照组明显下调(均P〈0.05);MTT结果显示,pGenesil-1-survivin组细胞增殖能力明显较pGenesil-1-NC组和空白对照组降低(均P〈0.05);体内实验表明,pGenesil-1-survivin组较pGenesil-1-NC组和空白对照组能有效抑制BALB/C裸鼠人鼻咽癌的生长(均P〈0.05)。结论沉默Survivin基因可以有效抑制人鼻咽癌CNE2细胞在体内外的增殖,Survivin基因有望成为鼻咽癌基因治疗的有效靶点。 相似文献
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目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。 相似文献