外源hTERT基因对大鼠肝细胞增殖的影响

目的:构建含目的基因人端粒逆转录酶(hTERT)重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,体外感染原代大鼠肝细胞,观察对大鼠肝细胞增殖的影响.方法:将hTERT插入逆转录病毒载体pLNCX2获得重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,转染包装细胞293T后可获得表达hTERT逆转录病毒,感染体外培养的原代大鼠肝细胞,通过RT-PCR及western-blot检测基因在细胞中的表达情况.结果:重组载体pLNCX2-hTERT经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确.转染原代大鼠肝细胞后能明显促进其增殖.结论:体外转染原代大鼠肝细胞后能有效促进其增殖,这为进一步解决人工肝细胞来源问题奠定了实验基础.     

hTERT-逆转录病毒载体构建及其在脐血间质干细胞中的表达

目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(UCBMSCs)中导入hTERT基因,观察该基因的表达。方法:PCR法扩增出hTERT全部片断,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞,检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达。结论:hTERT-逆转录病毒载体构建成功,在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达。     

逆转录病毒转染后骨髓间充质干细胞中人Dmp-1表达的变化

目的 探讨构建的pLNCX2-Dmp-1逆转录病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)后,外源性基因牙本质基质蛋白-1 (Dmp-1)表达的变化.方法 含人Dmp-1基因的逆转录病毒液pLNCX2-Dmp-1转染原代培养后扩增的第5代BMSCs,用免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测Dmp-1的表达.结果 用逆转录病毒液pLNCX2-Dmp-1转染BMSCs后,免疫荧光检测发现,在大多数细胞内Dmp-1都有明显的表达,而没有用pLNCX2-Dmp-1病毒液处理的BMSCs则无明显表达,RT-PCR和Westem blotting的检测也支持免疫细胞化学的结果.结论 构建含人Dmp-1基因的逆转录病毒载体pLNCX2-Dmp-1转染BMSCs后可上调目的 基因的表达.     

hTERT转染神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA检测

目的以逆转录病毒PLXSN为载体,将hTERT基因转染入体外培养的人神经干细胞,检测神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA表达情况,为建立永生化神经干细胞系提供一种新的思路.方法体外扩增人神经干细胞及基因转染后,应用PCR-ELISA法检测神经干细胞端粒酶活性,荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达情况.结果通过逆转录病毒介导的hTERT基因转染人神经干细胞后,端粒酶活性明显升高,持续表达,hTERT mRNA也早期呈高水平表达,但继之下降,维持在一个较低水平.结论转染hTERT基因后的神经干细胞具有表达高水平端粒酶活性,并稳定表达,这为建立基因工程的永生化神经干细胞系奠定了基础.而hTERT mRNA则逐渐下降,并维持在一个较低水平,不能作为检测神经干细胞增殖和分化能力的指标.     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

BRCA1对MCF-7细胞hTERT基因表达的抑制作用研究

目的将BRCA1真核表达质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞中,观察外源性BRCA1基因转染MCF-7细胞后对hTERT蛋白表达的抑制作用及对细胞增殖的影响.方法应用脂质体法将BRCA1真核表达质粒转染至乳腺癌MCF-7细胞中,Western blot检测转染细胞中hTERT蛋白表达的变化.MTF比色试验观察BRCA1真核表达质粒转染后MCF-7细胞增殖活性的变化.结果外源性BRCA1真核表达质粒组MCF-7细胞较未转染组MCF-7细胞hTERT蛋白表达明显减弱.BRCA1基因转染后的MCF-7细胞的增殖活性明显降低.结论外源性BRCA1基因的表达可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞中hTERT基因的表达,并抑制MCF-7细胞的增殖能力.BRCA1基因的表达异常可能在乳腺肿瘤发生发展机制中具有重要的作用.     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及对人卵巢癌细胞系SW626增殖的影响

目的 构建抑癌基因PTEN的真核表达载体,研究外源性PTEN基因稳定表达对人卵巢癌细胞系SW626体外增殖的影响.方法 构建PTEN基因的真核表达载体pcDNA3.1/PTEN,转染重组质粒pcDNA3.1/PTEN于体外培养的人卵巢癌细胞系SW626,筛选并获得稳定表达PTEN基因的细胞克隆,应用RT-PCR和western blot分析PTEN基因的mRNA及蛋白质表达,MTT实验分析细胞增殖能力.结果 稳定转染PTEN基因的细胞系有外源目的 基因的mRNA及其蛋白表达.MTT实验表明,pcDNA3.1/PTEN 转染组细胞增殖能力低于pcDNA3.1(-)转染组和对照组 (P＜0.05).结论 外源性抑癌基因PTEN的稳定表达可抑制人卵巢癌细胞系SW626的增殖.     

逆转录病毒介导人肿瘤坏死因子-α基因抑制胆管癌细胞的生长

[目的 ]研究逆转录病毒介导的人肿瘤坏死因子α(TNFα)基因转染对人胆管癌细胞生长的抑制作用。 [方法 ]构建逆转录病毒 -TNFα(pLNCX -TNFα)复合体 ,转染人胆管癌细胞得到稳定表达 ,通过聚合酶链式反应 (PCR)、流式细胞仪 (FCM )、免疫组织化学等方法检测基因表达、细胞生长增殖和细胞凋亡等情况。 [结果 ]pLNCX -TNFα基因转染人胆管癌细胞后 ,pLNCX空质粒转染组、pLNCX -TNFα基因转染组的细胞均能扩增出 70 8bp的基因片断 ,而未转染组则无 ;pLNCX -TNFα基因转染组的细胞克隆抑制率为 6 4% ,与对照组和 pLNCX空质粒转染组相比 ,差异性非常显著 (P <0 .0 1 ) ;转染的人胆管癌细胞G1期比例从 2 9.0 7%增加到 5 4.2 4 % ,G2 -M期和S期比例分别从 5 2 .0 3%下降到 2 .0 2 % ,1 8.32 %下降到 1 0 .34% ;凋亡细胞数从 5 .83%增加到34.76 %。[结论 ]TNFα基因通过诱导胆管癌细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞抑制胆管癌细胞的生长。     

脂质体介导人端粒酶逆转录酶基因构建永生化软骨细胞方法的建立及评价

目的：探索将人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因转入兔软骨细胞以获取大量种子细胞的方法和技术。方法：分离培养原代兔软骨细胞,以pcDNA3.1/Zeo(+)-hTERT载体进行基因转染,对照组则为空载体pcDNA3.1/Zeo(+),筛选并挑选出阳性克隆后扩增,以逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测转染hTERT基因后的软骨细胞hTERT mRNA表达;甲苯胺蓝染色判断转染hTERT基因后的软骨细胞是否具有软骨细胞的生物学特性;流式细胞术检测细胞周期及核型;裸鼠致瘤实验观察成瘤情况。结果:RT-PCR检测RNA水平上hTERT在细胞中的表达情况,hTERT转入兔软骨细胞后细胞形态未发生变化,长满单层后仍然呈现出多角形,与正常体外培养的软骨细胞形态基本一致。甲苯胺蓝染色后可见多糖染成蓝紫色,呈现较小蓝紫色颗粒,蛋白多糖等基质分布均匀,即转染hTERT基因后的软骨细胞具有合成和分泌软骨相关基质的功能。细胞周期测定转染hTERT的兔软骨细胞的增殖能力明显上升,细胞分裂基本以整数二倍体方式进行,保持了核型的基本稳定。裸鼠接种不致瘤。结论：转染hTERT的软骨细胞表型未发生转化,具有作为种子细胞和研究正常软骨细胞的生理、生化工具细胞的可行性。     

ABCE1基因通过RNaseL途径抑制人大细胞肺癌H460细胞凋亡

摘要：目的研究ABCEl基因表达对人大细胞肺癌H460细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其机制。方法体外培养H460细胞,分为A组（转染ABCE1-siRNA-1组）、B组（转染ABCEl-siRNA-2组）、C组（转染空质粒组）以及D组（空白对照组）。将构建好的ABCEl的siRNA（小干扰RNA）载体转染人培养的细胞中,荧光显微镜下观察转染效率,WesternBlot法检测ABCEl蛋白以及RNaseL蛋白的表达,RT—PCR法检测ABCElmRNA的表达,MTT法分析细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果将构建好的载体成功转入了H460细胞,转染后A、B组的细胞活性降低,ABCEl的表达受到阻断俨〈0．01）,RNaseL蛋白含量明显增加（P〈0．01）,细胞的增殖能力明显降低并逐渐凋亡（P〈0．01）。结论ABCEl基因可促使人大细胞肺癌H460细胞增殖并抑制细胞凋亡,其机制是阻断了2-5A／RNaseL细胞通路。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

人ERGIC3基因稳定表达支气管上皮细胞株的建立与迁移能力

目的 构建含ERGIC3基因真核表达载体,并转染至支气管上皮细胞株BEAS-2B,筛选并建立ERGIC3稳定表达的细胞株,为进一步研究ERGIC3在肺癌中的作用奠定基础.方法 采用RT-PCR方法获取人类ERGIC3基因的ORF框的DNA序列,构建逆转录病毒载体pLXSN-ERGIC3,用PT-67细胞包装后获得病毒颗粒;用病毒颗粒感染BEAS-2B细胞,通过G418筛选获取整合了外源基因ERGIC3的单克隆化细胞;采用定量RT-PCR和Western blot对ERGIC3稳定表达的细胞株进行鉴定,并用划痕实验分析稳定转染细胞株的迁移能力和形态学变化.结果 获得4个ERGIC3稳定表达的BEAS-2B细胞株,ERGIC3的表达量均远高于对照组细胞,分别为对照组细胞的45.3、48.8、41.5和28.2倍,且稳定转染细胞株的迁移能力也显著增强（P＜0.05）,但其形态学没有明显变化.结论 成功构建了含ERGIC3基因真核表达载体pLXSN-ERGIC3;筛选出多个ERGIC3基因稳定转染的BEAS-2B细胞株,且迁移能力明显提高.     

自杀基因修饰内皮祖细胞对肝细胞癌体外作用的效应

目的：研究自杀基因胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染的小鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）联合酶前体药物5-氟胞嘧啶（5-FC）对小鼠肝癌细胞株H22的体外抗增殖作用。方法：分离普通小鼠骨髓源性EPCs,培养鉴定,Polybrene技术转染含CD基因的慢病毒载体重组体plenti6．3-EGFP-CD至EPCs,Western blotting检测目的蛋白的表达。利用Transwell小室共培养体系,用转染CD基因的EPCs处理H22细胞。 CCK-8法检测H22细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果：成功转染CD基因至EPCs;CCK-8法检测显示随着5-FC浓度增加,细胞增殖逐渐下降,5-FC浓度达100 mg· L-1时,肿瘤细胞增殖抑制率达到（54．74±5．38）％（P＜0．05）,细胞平均凋亡率为（48．71±4．62）％（P＜0．05）。结论：CD基因修饰的EPCs 联合5-FC体外可明显抑制肝癌H22细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。     

RNAi沉默Survivin基因抑制人鼻咽癌细胞生长

目的观察RNA干扰沉默Survivin基因对人鼻咽癌CNE2细胞在体内外生长的抑制作用。方法将Survivin特异性shRNA表达载体pGenesil-1-survivin经Lipofectamine。”2000介导转染人鼻咽癌CNE2细胞,经G418筛选获得稳定转染的CNE2细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞转染效率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot分别检测Survivin基因mRNA和蛋白表达水平;噻唑蓝（MTF）法检测细胞增殖能力的变化。以稳定转染细胞建立裸鼠荷瘤模型,观测瘤体积的变化,绘制移植瘤生长曲线。结果流式细胞仪检测pGenesil-1-survivin细胞转染百分率为（87．13±2．21）％;RT．PCR和Westernblot结果显示,pGenesil-1-survivin组对人鼻咽癌CNE2细胞SurvivinmRNA和蛋白的抑制率分别为64．55％和51．24％,均较随机序列构建载体的阴性对照（pGenesil-1-NC）组和空白对照组明显下调（均P〈0．05）;MTT结果显示,pGenesil-1-survivin组细胞增殖能力明显较pGenesil-1-NC组和空白对照组降低（均P〈0．05）;体内实验表明,pGenesil-1-survivin组较pGenesil-1-NC组和空白对照组能有效抑制BALB／C裸鼠人鼻咽癌的生长（均P〈0．05）。结论沉默Survivin基因可以有效抑制人鼻咽癌CNE2细胞在体内外的增殖,Survivin基因有望成为鼻咽癌基因治疗的有效靶点。     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。