脐动脉平滑肌细胞体外培养方法的改进

目的:建立并优化的人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)的体外培养方法。方法:人脐动脉VSMCs的体外原代培养应用优化的组织块贴壁法进行。在分别应用传统细胞培养法和优化后细胞培养法贴壁培养提取的原代细胞10 d后,计数6孔板每孔细胞数目,并做统计比较分析相同时间内原代细胞的数量。以抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体和抗CD31抗体进行免疫荧光染色和倒置相差显微镜观察鉴定培养的细胞。结果:与传统细胞培养法相比,在相同的时间周期内优化实验方法后培养的原代细胞数量较传统多,我们可以在较短时间内得到实验所需的细胞量,因此优化后可缩短细胞的培养周期。原代和传代培养的脐动脉VSMCs生长良好,细胞经冻存、复苏后状态依然良好。光镜下细胞呈典型的峰-谷样生长,细胞多为长梭形,具有VSMCs的特征,且传代培养至第7代,细胞生长特性不变。经抗α-SMA、CD31抗体进行免疫荧光染色鉴定证实为VSMCs。结论:优化的组织块贴壁法可缩短原代人脐动脉VSMCs的培养周期,且细胞的生物学特性较稳定,为与平滑肌相关的疾病进展及心血管生长发育的研究奠定了实验基础。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的探讨平滑肌细胞培养方法,了解生长特性。方法用组织贴块法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,用相差显微镜观察其生长情况,用免疫荧光染色分析其抗原的表达。结果培养3日可见组织块周边有细胞长出,2周达亚融合,传代后细胞“谷峰”生长明显。SM-α-肌动蛋白和Calponin抗体免疫荧光染色呈阳性。结论组织贴块法是简单、经济、高效的平滑肌细胞培养方法,为心血管疾病发病机制的研究提供了理想的细胞模型。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的 改进大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的培养方法.方法 采用机械刮除、差异贴壁等手段进行组织贴块法原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SABC免疫组化染色试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定.结果 镜下培养细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内αactin阳性表达.结论 本法可获纯度高、结构和功能良好的VSMCs.     

一种大鼠肺静脉平滑肌细胞快速培养方法的建立及评价

目的 通过改进原代大鼠肺静脉平滑肌细胞(pulmonary vein smooth muscle cells,PVSMCs)的培养方案,以期建立快速、方便、高细胞活力的肺静脉平滑肌细胞培养方法,为肺静脉在肺血管相关疾病研究中提供适合的细胞模型.方法 体视镜下显微分离大鼠肺静脉,胶原酶消化后获取原代PVSMCs,分别用低糖DMEM培养基、DMEM-F12培养基、高糖DMEM培养基作为培养液,观察PVSMCs的生长情况和细胞形态,对平滑肌α-actin进行免疫荧光鉴定,并用实时荧光法检测PVSMCs对高钾溶液引起的细胞内钙浓度升高的反应,评价细胞活力.结果 PVSMCs在3种培养基中的生长速率比较:DMEM-F12＞高糖DMEM＞低糖DMEM.DMEM-F12中培养的PVSMCs可见细胞质中有典型的、并行排列的、绿色荧光显色的平滑肌α-actin蛋白,细胞核呈蓝色荧光,细胞纯度达95％以上,而阴性对照只见染蓝光的细胞核.细胞对高钾溶液具有良好反应.结论 DMEM-F12培养基中PVSMCs生长速率最大,细胞符合平滑肌细胞免疫结构特征,并具有良好的细胞功能.DMEM-F12培养基更适合PVSMCs的培养.     

牛主动脉蛋白聚糖对培养的人主动脉平滑肌细胞生长的影响

为探讨蛋白聚糖在动脉粥样硬化发生发展中的作用,观察牛主动脉硫酸肝素蛋白聚糖、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸皮肤－硫酸软骨素蛋白聚糖和三种蛋白聚糖的混合物对培养的人主动脉平滑肌细胞增殖的影响。用细胞计数计算硫酸肝素蛋白聚糖（１．５￣７．０ｍｇ／Ｌ）对培养的人主动脉平滑肌细胞增殖的抑制率分别为０．５５％和７６％;硫酸软骨素蛋白聚糖（１５．０￣６０．０ｍｇ／Ｌ）的抑制率分别为２３％、３４％和６５％;硫酸皮肤素     

胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞

建立胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,并和其他大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养方法相比较.在无菌条件下分离雄性Wistar大鼠胸主动脉血管中膜,剪碎中膜,在37℃用10mL0.25%胰酶消化大约3.5h.中止消化后,在100g条件下离心5min,收集细胞种入25cm2细胞培养瓶.结果发现,胸主动脉平滑肌细胞至少可以传20代以上,并且细胞形态、生长特点、平滑肌a-肌动蛋白表达不发生明显的改变.结果提示,与目前的平滑肌细胞培养方法相比,胰酶消化法培养平滑肌细胞的方法重复性好,原代培养的平滑肌细胞具有数量多、生长迅速的特点.     

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定

目的探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。方法采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。结果85%的组织块接种存活,原代培养后2周左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。台盼蓝染色约有94%以上的细胞为活细胞。镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。     

自发性高血压大鼠胸主动脉外膜胶原分布及含量的变化

自发性高血压大鼠（SHR）胸主动脉外膜胶原分布及含量的变化。方法：天狼猩红染色法观察不同周期龄（4W、8W、24W）大鼠胸主动脉外膜胶原的分布,氯胺T氧化法测定不同周龄组胸主动脉外膜胶原含量,组织块贴片法进行血管外膜成纤细胞的培养,并采用细胞免疫化学法检测血管外膜成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。结果：大鼠胸主动脉胶原主要分布于血管外膜,自发性高血压大鼠胸主动脉外膜胶原含量在8周、24周高于对照京都种Wistar大鼠（WKY）;血管外膜成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性。结论：胸主动脉外膜胶原的沉积可能参与高血压血管重逆过程,血管外膜成纤维细胞可合成Ⅰ、Ⅲ型胶原。     

炎性细胞和主动脉固有细胞在主动脉夹层中的研究现状

主动脉夹层是指主动脉内膜撕裂, 血液经内膜撕裂口进入主动脉壁造成正常主动脉壁分离, 形成真假腔的一种凶险的心血管疾病。常见于中老年人群, 尽管发病率低, 但发病突然, 且病死率极高。主动脉夹层的诱因错综复杂, 发病机制尚未完全明确, 主要与主动脉壁结构异常、血管壁炎症反应和血流动力学有关。该文重点整理了炎性细胞和主动脉固有细胞在主动脉夹层发生发展过程中的作用, 为该疾病的治疗提供新思路。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的探讨以简便、高效的方法获取血管平滑肌细胞,为相关研究提供实验材料。方法采用组织贴块法进行原代培养,胰酶消化法传代,并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果90%的组织块接种存活,培养5代的平滑肌细胞纯度达98%以上。镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷状”样生长,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论本法简便、可靠,短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞,可作为研究心血管疾病良好的体外模型。     

Ⅱ型胶原酶/弹性蛋白酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞

为快速、成功培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,在无菌条件下分离大鼠胸主动脉,并剥离外膜及内皮,然后用Ⅱ型胶原酶／弹性蛋白酶消化血管中层,2h左右完全消化成单个细胞时,离心收集细胞,然后重悬,接种细胞,24h后便可见细胞贴,4－5天便可传代,传至第3代时,用台盼蓝检查细胞存活率为96％,光镜和免疫组织化学鉴定培养细胞,培养细胞纯度为97％,与国内报道的贴块法及消化法相比,用酶解法培养血管平滑肌细胞的培养周期缩短4－5天,能更好的保护细胞,维持细胞形状。     

BMP信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化中的作用。方法体外分离培养大鼠胸主动脉VSMC,将其随机分为正常对照组、高磷组、华法林(10μmol/L)干预组及华法林(10μmol/L)+维生素K(10μmol/L)干预组。对细胞进行钙含量和碱性磷酸酶(ALP)活性检测,茜素红染色检测钙结节,Western blot检测细胞中Runx2蛋白的表达变化,RT-PCR检测细胞中骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Smad1及Runx2的表达变化。结果茜素红染色结果显示,与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组钙化结节明显增多;钙含量测定结果与茜素红染色结果基本一致。与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组ALP活性明显增加(P0.05),Runx2 mRNA和蛋白表达水平及BMP-2、Smad1 mRNA表达明显增高(P0.05);与华法林干预组相比,华法林+维生素K干预组细胞钙含量、ALP活性及BMP-2、Smad1、Runx2的表达均明显降低(P0.05)。结论BMP信号通路参与了华法林促进的大鼠VSMC钙化,其可能的作用机制是介导了VSMC的表型转化。     

Cariporide对糖基化终末产物所致血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察cariporide对糖基化终末产物所致大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响。方法采用组织贴块法原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞。用体外制备的外源性糖基化终末产物和平滑肌细胞共孵育24h,加入不同浓度的cariporide(0.1、1.0和10μmol/L)处理。用噻唑蓝比色法所测得的细胞吸光度值及考马斯亮蓝法测得的细胞总蛋白含量来反映细胞增殖情况,利用2,7-二羧乙基-5,6羧基荧光素及钙荧光探针通过荧光分光光度计分别检测细胞内的pH值及Ca2 浓度。结果糖基化终末产物(10mg/L)与平滑肌细胞共孵24h,与正常对照组比较,细胞吸光度值(0.554±0.032比0.155±0.018)和细胞内总蛋白浓度均显著增加(193.3±10.7μmol/L比127.8±8.2μmol/L,P<0.01);cariporide0.1、1.0和10μmol/L使细胞吸光度值从0.554±0.032分别降至0.402±0.028、0.298±0.020、0.174±0.019;细胞内总蛋白浓度也从(193.3±10.7)μmol/L分别降至(180.9±9.8)μmol/L,(156.4±9.4)μmol/L,(130.6±8.8)μmol/L,同时cariporide也明显降低了糖基化终末产物处理后的平滑肌细胞内pH值及Ca2 水平。结论外源性糖基化终末产物能显著刺激平滑肌细胞的增殖;cariporide对糖基化终末产物诱导的平滑肌细胞增殖具有显著抑制作用,其机制可能与cariporide抑制细胞内糖基化终末产物诱导的pH值及Ca2 水平升高有关。     

糖基化终末产物促进大鼠血管平滑肌细胞钙化

目的 观察糖基化终末产物对体外培养的血管平滑肌细胞钙化的影响.方法 在含10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠培养液中加入不同浓度(0、50、100、200 mg/L和400 mg/L)的糖基化终末产物与大鼠血管平滑肌细胞孵育不同时间.采用磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶活性,甲-酚酞络合酮方法测定钙含量,实时定量逆转录聚合酶链反应检测成骨细胞特异性核心结合因子、碱性磷酸酶以及骨桥蛋白基因表达,蛋白免疫印迹检测成骨细胞特异性核心结合因子及骨桥蛋白蛋白表达.结果 与对照组相比,糖基化终末产物随作用时间延长和浓度增加,细胞钙含量增加(P<0.05),升高碱性磷酸酶活性和基因表达(P<0.05),促进成骨细胞特异性核心结合因子及骨桥蛋白基因及蛋白表达(P<0.01).结论 糖基化终末产物可促进体外培养的大鼠血管平滑肌细胞钙化.     

原代培养大鼠肝细胞分离方法比较研究

目的:探索原代培养大鼠肝细胞的最佳分离方法。方法:对比观察不同的肝细胞分离技术的培养效果。培养前,以4％台盼蓝染色判定肝细胞活性,培养48h后,观察肝细胞贴壁及生长状况。结果:①灌流消化法优于剪切消化法;②在多种灌流消化法中,经门静脉灌流消化法优于经胆总管灌流消化法及经腹主动脉灌流消化法;③在门静脉灌流的基础上,0.1％胶原酶Ⅰ37℃热消化10～15分钟,效果最好,而0.25％胰蛋白酶消化10～12分钟次之,用含EDTA的D-Hank液直接灌流分离法效果极差。结论:原代培养肝细胞的得率及活性与不同分离法包括灌流途径、灌流液、消化时间等有关。     

牛主动脉蛋白聚糖对培养的人脐静脉内皮细胞生长的影响

为观察牛主动脉中蛋白聚糖对培养的人脐静脉内皮细胞生长的影响及其在动脉粥样硬化形成中的作用，用解聚提取，离子交换及凝胶过滤柱层析法从牛主动脉内，中膜分离出硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸软骨素蛋白聚糖和硫酸皮肤素－硫酸软骨素蛋白聚糖。     

罗格列酮对高脂血症大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及机制探讨

目的 观察罗格列酮对高脂血症大鼠血管平滑肌细胞凋亡及磷酸化Smad2/3表达的影响.方法 高脂饮食复制SD大鼠高脂血症模型,酶消化法原代提取SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞进行体外培养,取5～8代细胞进行实验.无血清培养24 h后:实验一分为4组:①对照组,②罗格列酮组(本实验所用罗格列酮均为100 μmol/L),③罗格列酮+过氧化物酶体增生激活受体γ(PPAR-γ)阻断剂GW9662组,④罗格列酮+抗转化生长因子β1(anti-TGF-β1)组,分别用Western blot于1 h检测磷酸化Smad2/3水平,24 h后流式细胞学检测细胞凋亡;实验二分2组:①对照组,②100 μmol/L罗格列酮组,分别于0、0.5、1、2,6、12和24 h,用Western-blot检测磷酸化Smad2/3水平.结果 24 h后罗格列酮组细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.05),罗格列酮+GW9662组和罗格列酮+抗转化生长因子β1组细胞凋亡率较罗格列酮组明显降低(P<0.05);罗格列酮处理后0.5 hVSMC p-Smad2/3表达水平明显高于对照组(P<0.05),且1 h迭高峰(P<0.05),p-Smad2/3水平达到高峰后又较快下降(P<0.05);罗格列酮+GW9662组和罗格列酮+anti-TGF-β1组p-Smad2/3表达水平较罗格列酮组低(P<0.05).结论 罗格列酮可能通过激活过氧化物酶体增生激活受体γ,诱导血管平滑肌细胞磷酸化Smad2/3表达水平上调从而诱导血管平滑肌细胞凋亡.     

细胞质膜小凹/小凹蛋白1在实验性动脉粥样硬化小鼠血管壁中的表达变化

目的 研究细胞质膜小凹，小凹蛋白1在动脉粥样硬化病变中的表达变化，探索动脉粥样硬化发生过程中细胞胆固醇逆转运障碍的机制。方法采用高脂饲料喂养动脉粥样硬化敏感C57BL／6J小鼠24周，计算机图像分析系统计算动脉粥样硬化病灶面积和主动脉内膜和中膜厚度；电镜观察小凹在主动脉病变区的血管平滑肌细胞表达，Western印迹检测血管壁小凹蛋白1变化情况。结果动脉粥样硬化模型小鼠主动脉病变区的血管平滑肌细胞膜上存在有小凹结构，但排列稀疏，与正常血管平滑肌细胞相比明显减少，泡沫样改变的血管平滑肌细胞未见明显小凹结构的存在。通过Western印迹检测观察到，高脂组血管壁的小凹蛋白1蛋白表达量明显减少，与对照组比较具有显著差异。结论维持细胞内胆固醇平衡的重要结构小凹，小凹蛋白1在动脉粥样硬化病变中明显受损，可能是血管平滑肌细胞胆固醇逆转运障碍重要原因之一。