大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

VEGF基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据.方法 将靶向VEGF基因的shRNA表达序列连接到慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti中,获得pRNAT-shVEGF质粒,经PCR和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pPACKHl通过Lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实,VEGFshRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为3x107pfu/ml.结论 成功构建人VEGF基因RNAi慢病毒载体,为研究其在白血病细胞中的生物学功能和基因治疗奠定基础.     

人甘油激酶慢病毒干涉载体的构建和表达

构建人甘油激酶（GK）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,获得稳定下调GK表达的慢病毒。方法 将具有干涉效果的siRNA序列克隆入慢病毒核心质粒pSicoR中,并转染293T细胞进行病毒包装,用慢病毒感染293T细胞并应用FACS测定病毒滴度。以GK干涉慢病毒感染人肝细胞系L02细胞后,应用Western blotting方法检测GK的表达。 结果 成功构建GK干涉慢病毒pSicoR-GK载体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达3×107pfu/ml,GK 蛋白质表达水平下调至对照的约 20%。 结论成功构建人GK基因RNAi慢病毒,为后续GK生物学功能研究奠定基础。     

人甘油激酶慢病毒干涉载体的构建和表达

目的构建人甘油激酶(GK)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,获得稳定下调GK表达的慢病毒。方法将具有干涉效果的siRNA序列克隆入慢病毒核心质粒pSicoR中,并转染293T细胞进行病毒包装,用慢病毒感染293T细胞并应用FACS测定病毒滴度。以GK干涉慢病毒感染人肝细胞系L02细胞后,应用Western blotting方法检测GK的表达。结果成功构建GK干涉慢病毒pSicoR-GK载体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达3×107pfu/ml,GK蛋白质表达水平下调至对照的约20%。结论成功构建人GK基因RNAi慢病毒,为后续GK生物学功能研究奠定基础。     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。     

辐射诱发基因组不稳定性肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型的构建

目的构建基因组不稳定细胞Ran基因过表达和RNAi模型,为进一步研究该基因在辐射诱发基因组不稳定的功能提供研究工具。方法根据Ran基因信息,以慢病毒载体GV218设计合成2种重组质粒,分别包含Ran基因全长序列以及阴性对照序列;以慢病毒载体GV248设计合成2重组质粒,分别包含Ran基因的小干扰序列以及用于干扰对照的阴性序列。利用Western blot和qPCR进行过表达和RNAi重组质粒表达的检测;通过转染293T细胞进行慢病毒的包装;利用qPCR和荧光法分别进行滴度的检测;再用包装好的慢病毒感染辐射诱导基因组不稳定性HL-7702肝细胞,利用qPCR检测Ran基因表达量。结果测序结果表明重组质粒构建成功,并能够有效转染293T。过表达病毒滴度为2.0×108 TU/mL;RNAi病毒滴度为3.0×108 TU/mL。过表达慢病毒能有效地上调Ran基因的表达,过表达效率为85%。RNAi干扰慢病毒能够有效抑制Ran基因的表达,抑制效率为73%。结论成功构建基因组不稳定肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型,为进一步研究Ran基因在辐射诱发基因组不稳定细胞中的功能提供了有效的研究工具。     

ALR基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中对ALR表达的抑制

目的：构建肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,并检测其对人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因表达的干扰效率。方法：针对ALR基因RNAi的有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切线性化的GV118慢病毒载体连接产生LV-ALR-shRNA重组慢病毒载体,经转化感受态细胞后筛选出阳性克隆,并进行测序鉴定。用293T细胞包装产生慢病毒,逐孔稀释法测定病毒滴度。再将包装浓缩后的慢病毒转染人肝癌细胞株HepG2和QGY,应用Real-time PCR和Western blot方法检测HepG2和QGY细胞中ALR基因mRNA和蛋白的表达情况。结果：酶切鉴定证实成功构建了针对人ALR基因的RNAi慢病毒载体,包装并浓缩慢病毒,病毒滴度为 8E+8TU/ml。将病毒感染人肝癌细胞株HepG2和QGY后,2种细胞的干扰组ALR的mRNA表达水平较阴性对照组及空白对照组均明显下降（HepG2细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.004,P干扰组vs. 空白对照组=0.001;QGY细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.005,P干扰组vs. 空白对照组=0.001）,同样,干扰组ALR在蛋白水平的表达也明显减降低。结论：成功构建ALR基因RNAi慢病毒载体,该载体能有效干扰人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因的表达。     

Smad4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建Smad4基因RNAi慢病毒载体. 方法:针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shSmad4慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定. 用LV-shSmad4,pCMV-dR8.74和pMD2G 3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度. 结果:PCR和测序证实,成功构建Smad4 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad4. 包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×1010 pfu/L. 结论:成功构建人Smad4基因RNAi慢病毒载体.     

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。     

人GLUT3基因RNA干扰病毒载体的构建与鉴定

目的：筛选出人GLUT3基因有效的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列,并构建出慢病毒RNAi载体。方法：根据GLUT3基因mRNA序列设计合成siRNA片段4个,分别定向克隆至pLV-shRNA载体上,并将构建的质粒转染HeLa细胞,运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测GLUT3mRNA的表达量验证其干扰效果。筛选出其中有效的质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒,测定病毒颗粒滴度后,将病毒感染U251胶质瘤细胞以测定感染慢病毒干扰载体后胶质瘤细胞内GLUT3的表达情况。结果：重组RNAi质粒pLV-shRNA-GLUT3-1,pLV-shRNA-GLUT3-2,pLV-shRNA-GLUT3-3,pLV-shRNA- GLUT3-4经测序证实质粒载体构建成功;4个干扰质粒在HeLa细胞中均可以明显抑制GLUT3-mRNA的表达。pLV-shRNA-GLUT3可以在293T细胞中成功包装。收集293T细胞分泌的病毒上清浓缩后测定病毒颗粒LV-GLUT3滴度为1.5×109 TU/mL。与感染阴性对照慢病毒颗粒(0.3641±0.044)相比,胶质瘤U251细胞感染慢病毒颗粒LV- GLUT3后,GLUT3蛋白相对表达明显降低(0.108±0.016,t=16.267,P<0.001)。结论：成功构建了人GLUT3基因有效的慢病毒RNAi载体,为进一步研究GLUT3的生物学功能奠定了基础。     

Ang2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建促血管生成素(Ang)2基因的RNAi慢病毒表达载体,并鉴定其正确性。方法将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的嗜中性多形核白细胞-绿色荧光蛋白转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-siR-NA慢病毒转移质粒,再以pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白包膜质粒和包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,证明Ang2-siRNA核苷酸序列插入的正确性。利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Ang2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Ang2基因的RNAi慢病毒表达载体,为下一步进行干扰体内外恶性黑素瘤Ang2的表达奠定基础。     

人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达

目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达。结果所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P<0.01)。结论成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。     

慢病毒携带人Galectin-3基因RNAi的有效靶点筛选

OBJECTIVE: To construct a recombinant lentiviral U6 plasmids for RNA interference (RNAi) of galectin-3 gene and select the optimal target sequence of galectin-3 gene for RNAi. METHODS: Double-stranded oligo DNAs were designed and synthesized according to the sequence of galectin-3 gene, and ligated into linearized pGCL-GFP/U6 plasmid followed by transformation into competent DH5alpha cells. After PCR and sequence analysis for verification of the positive clones, the plasmid pGCL-GFP/U6 Gal-3shRNA-1 was extracted and transfected into CaCl(2)-treated 293T cells to obtain the viral vectors containing the RNAi sequence. MCF-7 cells were infected with pGCL-GFP/U6 Gal-3shDNA-1, and at the infection rate over 50%, the cells were harvested to extract the RNA. Real time-PCR was performed to determine the expression level of galectin-3 mRNA in the infected cells. RESULTS: The recombinant vector was successfully constructed as confirmed by sequence analysis. High titer of the virus was obtained, and after infection of MCF-7 cells, RNAi targeting the 1(#) and 3(#) sequences in galectin-3 gene resulted in suppression of galectin-3 mRNA expression by 95% and 85%, respectively. CONCLUSION: The recombinant lentiviral U6 plasmid for RNAi of Galectin-3 gene has been successfully constructed, which provides the basis for further study of the role of galectin-3 gene in tumor cells.     

PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建靶向PIK3CA（P110α）基因的RNA干扰慢病毒载体。方法针对PIK3CA—mRNA（NM_006218）设计4个RNA干扰靶点序列和一个阴性对照靶点,构建慢病毒转移质粒pGCL—GFP。构建成功的RNA干扰质粒与PIK3CA表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western Blot检测PIK3CA蛋白表达,筛选出干扰效果最好的RNA干扰质粒。将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒并检测其滴度。结果4个靶点和阴性对照靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Westem Blot检测获得最有效干扰靶点,并成功包装成滴度为2×10^8TU／ml的慢病毒。结论成功构建可供感染的PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体,为进一步研究PIK3CA功能和用慢病毒进行卵巢癌基因治疗奠定了基础。     

人Runx3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Runx3基因重组慢病毒载体。方法 PCR扩增Runx3基因,应用In-Fusion技术将Runx3基因PCR扩增产物交换进入线性化慢病毒载体pGC-FU以构建重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。对长出的阳性克隆进行PCR鉴定,并进行测序和比对分析。将构建成功的重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3与包装质粒pHelper 1.0、包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞进行病毒包装。荧光显微镜下观察重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3转染293T细胞后细胞内绿色荧光表达情况。Western blot检测Runx3与EGFP融合蛋白表达情况。实时定量PCR测定病毒滴度。结果重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3经测序和比对分析证实目的基因序列正确。三质粒共转染293T细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光。Western blot证实Runx3与EGFP融合蛋白在293T细胞内稳定表达。浓缩病毒后测定滴度为2.0×108TU/ml。结论成功构建携带人Runx3基因的重组慢病毒载体pGC-FU-Runx3,为进一步研究Runx3过表达对慢性乙型肝炎患者外周血Th细胞分化的影响奠定基础。     

APE1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建APE1基因慢病毒载体,为其后续的体内外实验研究提供基础。方法应用基因工程技术,筛选出两条针对APE1基因的RNAi靶序列KD1、KD2,分别与pGCIL-GFP载体连接,经转化筛选鉴定后,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,分别命名为LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2,两种病毒颗粒分别感染MHCC97-H细胞,设为感染LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2细胞组,同时设未感染病毒组和感染空载体细胞组。Real-time PCR和Western blot检测MHCC97-H细胞中APE1基因的mRNA和蛋白的表达。结果 PCR及测序结果与预期结果一致,LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2的病毒滴度为4×10^8TU/mL和7×10^8TU/mL。与未感染病毒组和感染空载体细胞组相比,2组慢病毒组APE1基因mRNA和蛋白的表达均明显下降,LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2对APE1基因的mRNA表达的抑制率分别为75%,90%,对APE1蛋白表达的抑制率达90%,95%。结论成功构建高效阻断APE1基因表达的RNAi慢病毒表达载体,为应用RNAi进一步研究APE1基因在肝癌中的作用机制和基因治疗奠定基础。     

转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建细胞周期相关转录因子E2F-1RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法：选取E2F-1基因的19nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果：双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×10^7TU/mL。结论：成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。     

稳定过表达、干扰RN181的MHCC97L细胞系建立及RN181功能的初步研究

目的构建过表达和干扰RNl81基因的肝癌MHCC97L重组细胞系，并研究RNl81对该细胞体外增殖的影响。方法基于基因克隆技术，构建plncx2一GFP—IRES／RNl81重组载体，常规鉴定后，与pVSV—G共转染GP2—293细胞包装逆转录病毒。该病毒与RNl81干扰慢病毒分别感染MHCC97L细胞，流式分选表达绿色荧光的细胞，RT—PCR、Westernblotting鉴定后，CCK．8实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖情况。结果重组载体构建成功，重组细胞荧光良好，RT．PCR、Westernblotting分别证实重组细胞中RNl81的mRNA和蛋白表达水平在重组细胞系间均出现差异有统计学意义（P〈0．05）。增殖实验显示RN181上调后细胞生长减慢，克隆数也显著少于对照组（P〈0．05），而RNl81干扰后上述现象可得到逆转。结论成功构建了过表达和干扰RNl81的MHGC97L重组细胞系．初步证实了RNl81在体外对MHCC97L细胞增殖的抑制作用。