新生大鼠少突胶质前体细胞的培养与鉴定

目的 在体外培养条件下获取纯度较高的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs).方法 原代混合胶质培养,利用振荡法和差速贴壁法分离纯化少突胶质前体细胞,再用无血清化学条件培养基培养.免疫荧光法及膜片钳记录细胞电生理特性进行鉴定.结果 振荡分离后超过90%细胞为NG2阳性OPCs:OPCs电生理特性:输入阻抗Ra相对较高;电压依赖的K 电流具有外向整流特性;对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的小的内向Na 流,不能产生动作电位.结论 振荡法结合差速贴壁可以获得纯度较高的OPCs;OPCs具有区别于神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞的独有电生理特性.     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞（OPCs）。方法新生1～2d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

少突胶质前体细胞分离培养方法及其谱系限定细胞体外分化模型建立的改进

目的：对少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,探讨体外条件下OPCs的增殖与分化特性。方法： 取新生SD大鼠脊髓来源的细胞分离、纯化OPCs行原代培养,用含碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和血小板源性生长因子-aa(platelet-derived growth factor-aa,PDGF-aa)的培养液作扩增培养,MTT法检测OPCs的增殖能力;三碘甲腺原氨酸和睫状神经生长因子诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs),并对分化细胞行形态学及免疫化学染色法鉴定。结果：95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态并表达A2B5;MTT法检测显示OPCs在体外保持良好的增殖能力;细胞最终诱导分化为成熟的OLs并表达髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)。结论：OPCs在体外条件下可继续保持良好的增殖生长及定向分化能力。     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的 对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞(OPCs)。方法 新生1~2 d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8 d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2 d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果 光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论 通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

少突胶质前体细胞分离培养方法的改进及其谱系限定细胞体外分化模型的建立

目的对少突胶质前体细胞(OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,并建立少突胶质谱系限制细胞的体外分化模型,以模拟体内OPCs的发育过程。方法通过非特异性差异黏附法与A2B5-IgM抗体免疫筛选法结合,从胚胎大鼠脊髓来源的细胞悬液中分离、纯化OPCs,用含成纤维细胞生长因子-2和血小板源性生长因子的培养液作扩增培养;再以三碘甲状腺氨酸和神经营养因子-3诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(OLs)。OPCs及其分化细胞的特性通过形态学观察和免疫化学染色法鉴定。结果 95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态,并表达A2B5;在一定的培养条件下,OPCs可持续扩增和反复传代,且扩增的OPCs仍能维持其特有的形态和自我增殖的特性;进入分化进程的细胞将依次表达O4、O1、受体反应蛋白及髓鞘碱性蛋白等特异性分化抗原。结论分离的OPCs在形态、增殖以及分化格局等方面均与存在于胚胎脑区的O2A前体细胞(体内OPCs)相类似。     

大鼠少突胶质前体细胞纯化及原代培养的新方法

【摘要】目的 建立简单、高效的少突胶质前体细胞（OPCs）分离培养方法。方法 取出生2天的SD大鼠大脑皮层,分离消化皮层细胞为单细胞悬液,采用A2B5免疫磁珠提纯OPCs进行体外培养,倒置显微镜观察细胞生长状况,并在第7天采用免疫荧光检测OPCs特异性标志A2B5和O4;培养7天后换为OPCs分化培养基诱导OPCs分化,分化培养7天后,免疫荧光法检测成熟少突胶质细胞特异性标志骨髓碱性蛋白（MBP）。结果 培养过程中观察发现,95%以上的细胞具有双极或三级突起的典型形态,免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95%以上表达A2B5和O4;分化培养后95%以上的细胞为MBP阳性的少突胶质细胞。结论 采用磁珠法可以获得高纯度的OPCs,并且细胞具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。     

NKCC1抑制剂布美他尼对大鼠脊髓原代少突胶质前体细胞增殖的影响

目的 研究钠-钾-氯共转运体1(NKCC1)抑制剂布美他尼(Bumetanide)对脊髓原代少突胶质前体细胞(OPCs)增殖的影响及其机制.方法 振摇及差速贴壁法培养大鼠脊髓原代OPCs,使用NKCC1抑制剂布美他尼干预.免疫荧光法鉴定细胞及其NKCC1表达;EdU细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期...     

人外周血单个核细胞体外重编程为少突胶质前体细胞研究

目的利用非整合质粒载体在体外将成人外周血中单个核细胞重编程为少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)。方法经外周静脉采集志愿者血液5 m L,利用Ficoll-Paquem密度梯度离心法获得单个核细胞,体外扩增培养后,电转染携带外源基因(OCT4,SOX2,KLF4,C-myc,LIN28,Nanog)的质粒,然后在加有化学小分子的特定培养基中分三步培养。结果转染后30 d左右,可以获得血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor-α,PDGFR-α)阳性的早期少突胶质前体细胞(Pre-OPC),该细胞能传20代以上,继续分化30 d左右可以获得表达O4的少突胶质前体细胞。结论利用非整合质粒载体携带外源基因可以将成人外周血单个核细胞在较短期时间内重编程为具有增生能力的早期少突胶质前体细胞,且能继续分化为少突胶质前体细胞。     

脂多糖对部分神经胶质细胞NgR表达的实验研究

目的:观察脂多糖诱导早产鼠小胶质细胞和少突胶质前体细胞NgR的表达及变化,了解NgR表达在TLR-4介导的神经胶质细胞释放炎性细胞因子中的作用。方法:采用振荡和差速贴壁法体外纯化培养MG和OPCs,分别用特异性抗体CD11b和O4做细胞鉴定;用实时荧光定量PCR检测各组MG、OPCs的NgR和MG的TLR-4基因表达情况,并用ELISA测各组TNF-α的含量。结果:LPS诱导后较其他对照组及处理组MG的TLR-4表达水平和MG、OPCs的NgR表达水平均增高,差异具有统计学意义(P<0.05),各组MG经LPS诱导后较其对照组及处理组的TNF-α的含量增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:细菌感染使MG和OPCs的NgR表达增高;脂多糖诱导小胶质细胞表达大量TLR-4需要NgR的介导;TLR-4可能存在上调NgR基因表达的作用。     

大鼠寡突胶质前体细胞的体外培养、鉴定及其生物学特性观察

目的 探讨体外培养条件下寡突胶质前体细胞增殖、迁移及分化特性。方法 取新生1 d SD大鼠大脑皮质混合胶质细胞培养10 d,分离纯化寡突胶质前体细胞。通过BrdU掺入实验对其增殖能力进行测定,采用经典的Transwell模型和重聚球模型对其迁移能力进行检验,并在分化培养基中观察其分化成为成熟寡突胶质细胞的能力。结果 混合培养胶质细胞在培养10 d后出现明显分层现象。初次振荡后,小胶质细胞脱落显示大量聚集成团的寡突胶质前体细胞散布于星形胶质细胞表面。分离的寡突胶质前体细胞NG2、A2B5表达阳性;阿糖胞苷可抑制其增殖(P<0.01);PDGF可明显促进其迁移(P<0.01);在分化培养条件下,MBP阳性的成熟寡突胶质细胞增多(P<0.01)。结论 寡突胶质前体细胞在体外培养条件下可以保持其增殖、迁移和分化的基本特性。     

Cuprizone 对少突胶质细胞相关蛋白的影响

目的: 研究双环己酮草酰双腙（cuprizone）对少突胶质细胞（oligodendrocytes,OLs）相关蛋白的影响。方法: 新生24 h Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮层胶质细胞混合培养7 天后,采用恒温摇床振荡分离与差异贴壁方法并结合条件培养基纯化培养细胞,纯化培养3 d 后加入含有25 nmol·L-1 cuprizone 培养基继续培养3 d。光学显微镜观察细胞形态;免疫荧光染色鉴定细胞类型。Western Blot 检测MBP、Fyn、Erk1/2 等蛋白的含量。结果：获得高纯度成熟的少突胶质细胞,荧光MBP 染色阳性。相较于正常细胞组蛋白,Cuprizone 组细胞MBP,Erk1/2 及磷酸化Fyn（416 位点）蛋白含量明显降低。结论：Cuprizone 对髓鞘形成细胞- 少突胶质细胞相关蛋白的表达成抑制作用。     

Differentiation of rat oligodendrocyte precursor cells in chemical conditional medium in vitro

Objective： To investigate in vitro differentiation of oligodendrocyte precursor cells （OPCs） into mature oligodendrocytes in chemical conditional medium. Methods： The mixed glial cells from cerebral cortices of 48-hour-old Sprague-Dawley （SD） rats were cultured in vitro. The OPCs were separated by shaking procedure around 9-10 d in the primary culture. Then the isolated OPCs were further transferred into the chemical conditional medium for cell differentiation. The pattern of OPCs maturation in vitro was continuously observed with contrast phase microscopy and mature oligodendrocytes were further identified by immunocytochemical assays. Results： OPCs grew well when co-cultured with glial cells and distinct cellular stratification formed about 9-10 d in the primary culture, which indicated the appropriate opportunity for the separation of OPCs. Following cultured in the chemical conditional medium, the OPCs progressively differentiated into the mature oligodendrocytes. These mature oligodendrocytes were also immunostained with the oligodendrocyte lineage-specific antibody, Oligo2. Conclusion： The OPCs isolated from the cerebral cortices of neonatal SD rats can progressively differentiate into mature oligodendrocytes in the chemical conditional medium in vitro.     

Rac1蛋白表达与神经前体细胞增殖分化的关系

目的探讨Rac1蛋白表达与神经前体细胞增殖分化的关系。方法取新生大鼠大脑皮层,原代培养获得混合细胞培养体系,在含10%血清的培养基中培养6 d细胞汇合后更换无血清培养基继续培养。实验中设计4个时间点,用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化的变化,免疫荧光染色技术鉴定细胞种类以及Rac1蛋白在细胞内的表达,通过Western blot检测Rac1蛋白的表达变化。结果建立了新生SD大鼠大脑皮层原代混合细胞培养体系,此体系底层主要是由Ⅰ型胶质细胞组成的单层细胞,GFAP染色呈阳性;在单层细胞上面有一些小圆形强折光性神经前体细胞生长,βⅢ-Tubulin染色呈阳性。更换无血清培养基后上层神经前体细胞大量增殖,βⅢ-Tubulin、Rac1染色呈阳性。Western blot定量分析结果显示,神经前体细胞增殖过程中Rac1蛋白表达上升,而分化过程中Rac1蛋白的表达下降。结论Rac1蛋白表达与神经前体细胞的增殖分化过程密切相关,可能参与了神经前体细胞的增殖分化过程。     

胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法新生1日龄大鼠禁食24 h后腹腔注射胰岛素50 u.kg-1,血糖值<1.0 mmol.L-1后取脑海马组织在含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27的无血清培养基中进行原代和传代培养,并分别对原代和传3代的细胞进行单克隆培养及诱导分化:单克隆培养细胞行巢蛋白(Nestin)免疫细胞荧光染色;诱导分化后的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞荧光染色,计数NSE阳性细胞比例。结果原代组培养细胞与传代组和对照组原代细胞相比生长较快;单克隆培养的细胞均Nestin阳性表达,诱导分化后的细胞分别呈NSE或GFAP阳性表达;原代组的细胞诱导分化为神经元的比例明显高于传代组和对照组(P<0.05);传代组的细胞诱导分化为神经元的比例与对照组传代细胞比较无统计学意义(P>0.05)。结论低血糖能够短暂地促进新生大鼠海马神经干细胞增殖及提高向神经元分化比例。     

神经干细胞球和单层贴壁神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨小鼠大脑皮层源性神经干细胞（NSCs）体外培养的两种方法并对培养的细胞进行鉴定。方法：分别取孕14-16d的昆明小鼠胚胎脑皮质并用细胞球悬浮培养和单层贴壁培养两种方法进行体外培养，用光学显微镜观察NSCs的生长情况，并用免疫细胞化学鉴定NSCs特异性抗原的表达，经过血清对NSCs分化诱导后进行胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白．2的检测。结果：①培养出来的细胞可以扩增生长；②这两种方法分别培养的神经干细胞球和单层神经干细胞经抗巢蛋白免疫细胞染色均呈阳性；③两种培养方法培养出的NSCs经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示微管相关蛋白-2、神经胶质酸性蛋白染色阳性。结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的神经干细胞球培养和单层贴壁两种培养技术，可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的NSCs。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimentin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5．溴脱氧尿苷（B枷）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Galc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC。