LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.     

热休克蛋白90(HSP90)对HBV复制的影响

目的探究热休克蛋白90(HSP90)对乙型肝炎病毒(HBV)复制以及HBV稳定复制细胞系细胞增殖的影响。方法在HBV稳定复制细胞系中瞬时转染HSP90过表达质粒与对照质粒,采用Western blot方法验证HSP90过表达水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HSP90过表达对HBV总RNA,3.5 kb mRNA表达的影响;同时在HBV稳定复制细胞系中稳转HSP90过表达质粒,构建成功后,检测细胞增殖能力的改变。结果 HSP90在HBV稳定复制细胞系Hep AD38和Hep G2.2.15细胞中过表达成功;在过表达HSP90的HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV总RNA,3.5 kb mRNA表达水平均上调;增殖实验显示HSP90可促进HBV稳定复制细胞的增殖。结论HSP90参与HBV的复制,并促进HBV稳定复制细胞系的增殖。     

shRNA表达载体构建及其对HBV体外抑制作用

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)基因X区和P区的shRNA表达载体,通过纳米聚合物将其转入HBV感染的细胞模型,并检测其对HBV复制的抑制作用。方法设计3条针对HBV基因编码区的干扰RNA序列,合成3对64nt的寡核苷酸,插入载体pRNAT-U6,构建重组干扰质粒Sl、S2和S3,利用纳米转染剂转入HBV感染的HepG2细胞。用实时荧光定量法检测HBVmRNA含量。结果干扰质粒S1、S2对HBv的复制有明显抑制作用,荧光定量检测转染后HBVmRNA表达水平发现,HBVmRNA含量分别减少至空白对照组的70.2%和61.2%,无关对照质粒则无抑制作用。结论成功构建针对HBv编码区的shRNA表达载体,并能在体外有效抑制HBVmRNA。     

靶向HBx小干扰RNA表达载体构建及其功能探讨

目的:设计和构建乙型肝炎病毒(HBV)X基因(HBx)特异性的小干扰RNA(siRNA)体内表达载体,筛选抑制X基因表达的有效siRNA,并初步探讨其对HBV复制功能的影响。方法:以X基因为目的基因,以产生siRNA质粒载体pSilencerTM-U6为表达模板,细胞内转录合成3条siRNA,并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucF-HBx。将重组质粒载体plucF-HBx与产生siRNA的质粒pSilencerTM-U6共转染HepG2细胞,检测荧光素酶活性以筛选出抑制荧光素酶表达的有效siRNA,逆转录聚合酶链反应检测HBx mRNA的表达,进一步证实siRNA对HBx表达的抑制效果,然后将siRNA转染HepG2.2.15,酶联免疫吸附法和荧光定量PCR检测siRNA对HBV复制的影响。结果:合成的3条siRNA中有1条抑制荧光素酶表达,抑制效率为76.3%,并能特异性抑制HBV的复制。结论:成功构建并筛选到针对X基因表达的有效siRNA质粒,为HBV的基因治疗奠定基础。     

HepG2-hNTCP细胞模型的构建及在miRNA-548ah调控乙型肝炎病毒研究中的应用

目的构建并鉴定表达人钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(hNTCP)的HepG2-hNTCP细胞模型,探讨微小RNA-548ah (miR-548ah)对乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法扩增重组慢病毒pWPI-hNTCP-Puro质粒,pWPI-hNTCP-Puro慢病毒感染HepG2细胞,聚合酶链反应(PCR)检测hNTCPmRNA的表达水平,共聚焦显微镜检测hNTCP蛋白定位。Lipofectamine转染miR-548ah激动剂、miR-548ah抑制剂及阴性对照至细胞系。酶联免疫吸附测定检测HBsAg和HBeAg的表达水平,荧光定量PCR检测HBVDNA的表达,应用SPSS 17.0对数据进行分析。结果 hNTCP mRNA在HepG2hNTCP呈高水平表达。共聚焦荧光显微镜观察HepG2hNTCP中的hNTCP蛋白正常表达且主要定位在细胞膜上。与HepG2细胞比较,HBsAg和HBeAg在感染后HepG2-hNTCP细胞5天和7天后的表达水平存在差异,随培养天数呈上升趋势,具有统计学意义(P0.01)。与转染阴性对照比较,HBsAg在转染miR-548ah激动剂组的表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);而HBeAg和HBVDNA的表达水平无明显变化,差异均无统计学意义。结论成功构建了表达hNTCP的HepG2-hNTCP细胞模型,对乙型肝炎病毒感染具有良好的易感性;miR-548ah可促进HBV感染HepG2-hNTCP细胞模型中HBsAg的表达。     

HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞的TLR4表达

目的 观察HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞后表达TLR4的变化.方法 采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15上表达的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率,将前期试验获得的HBV全基因组,采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在细胞上表达的MFI及阳性细胞率,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,并分析其与细胞表达TLR4的关系.结果 HepG2.2.15细胞上TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(均为P'<0.01),HepG2细胞于转染HBV DNA各剂量组48h后TLR4表达的MFI和阳性细胞率与无HBV DNA脂质体转染对照组相比均显著升高(均P'<0.01),并且MFI和阳性细胞率与转染剂量均呈正相关(均P<0.01),与细胞存活数均呈负相关(均P<0.01).结论 瞬时和稳定转染HBV的HepG2细胞,都存在细胞TLR4的上调,这种上调伴随着细胞存活的减少,并可能参与了急慢性乙型肝炎的免疫损伤.     

HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞的TLR4表达

目的 观察HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞后表达TLR4的变化.方法 采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15上表达的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率,将前期试验获得的HBV全基因组,采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在细胞上表达的MFI及阳性细胞率,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,并分析其与细胞表达TLR4的关系.结果 HepG2.2.15细胞上TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(均为P'<0.01),HepG2细胞于转染HBV DNA各剂量组48h后TLR4表达的MFI和阳性细胞率与无HBV DNA脂质体转染对照组相比均显著升高(均P'<0.01),并且MFI和阳性细胞率与转染剂量均呈正相关(均P<0.01),与细胞存活数均呈负相关(均P<0.01).结论 瞬时和稳定转染HBV的HepG2细胞,都存在细胞TLR4的上调,这种上调伴随着细胞存活的减少,并可能参与了急慢性乙型肝炎的免疫损伤.     

HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞的TLR4表达

目的 观察HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞后表达TLR4的变化.方法 采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15上表达的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率,将前期试验获得的HBV全基因组,采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在细胞上表达的MFI及阳性细胞率,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,并分析其与细胞表达TLR4的关系.结果 HepG2.2.15细胞上TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(均为P'<0.01),HepG2细胞于转染HBV DNA各剂量组48h后TLR4表达的MFI和阳性细胞率与无HBV DNA脂质体转染对照组相比均显著升高(均P'<0.01),并且MFI和阳性细胞率与转染剂量均呈正相关(均P<0.01),与细胞存活数均呈负相关(均P<0.01).结论 瞬时和稳定转染HBV的HepG2细胞,都存在细胞TLR4的上调,这种上调伴随着细胞存活的减少,并可能参与了急慢性乙型肝炎的免疫损伤.     

HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞的TLR4表达

目的 观察HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞后表达TLR4的变化.方法 采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15上表达的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率,将前期试验获得的HBV全基因组,采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在细胞上表达的MFI及阳性细胞率,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,并分析其与细胞表达TLR4的关系.结果 HepG2.2.15细胞上TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(均为P'<0.01),HepG2细胞于转染HBV DNA各剂量组48h后TLR4表达的MFI和阳性细胞率与无HBV DNA脂质体转染对照组相比均显著升高(均P'<0.01),并且MFI和阳性细胞率与转染剂量均呈正相关(均P<0.01),与细胞存活数均呈负相关(均P<0.01).结论 瞬时和稳定转染HBV的HepG2细胞,都存在细胞TLR4的上调,这种上调伴随着细胞存活的减少,并可能参与了急慢性乙型肝炎的免疫损伤.     

HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞的TLR4表达

目的 观察HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞后表达TLR4的变化.方法 采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15上表达的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率,将前期试验获得的HBV全基因组,采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在细胞上表达的MFI及阳性细胞率,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,并分析其与细胞表达TLR4的关系.结果 HepG2.2.15细胞上TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(均为P'<0.01),HepG2细胞于转染HBV DNA各剂量组48h后TLR4表达的MFI和阳性细胞率与无HBV DNA脂质体转染对照组相比均显著升高(均P'<0.01),并且MFI和阳性细胞率与转染剂量均呈正相关(均P<0.01),与细胞存活数均呈负相关(均P<0.01).结论 瞬时和稳定转染HBV的HepG2细胞,都存在细胞TLR4的上调,这种上调伴随着细胞存活的减少,并可能参与了急慢性乙型肝炎的免疫损伤.     

HPV16E6真核表达载体的构建及其在CaSki细胞中的表达及定位

目的:构建pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,转染CaSki细胞,检测其在CaSki细胞中的表达。方法:用RT-PCR法从CaSki细胞中扩增出带有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点的HPV16E6基因片段,将HPV16E6基因全长片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-C2上,通过脂质体将pEGFP-C2-HPV16E6转染入CaSki细胞。结果:pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体构建成功,转染CaSki细胞48h后经RT-PCR及Western-blot检测可见HPV16E6蛋白的高表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白主要在CaSki细胞核内表达。结论:成功构建了pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,为进一步对HPV16E6的研究奠定了基础。     

In vivo protein expression and immune responses generated by DNA vaccines expressing mycobacterial antigens fused with a reporter protein

We cloned six mycobacterial antigens into a mammalian expression vector as fusion proteins with the enhanced green fluorescent protein (EGFP). Plasmid DNA was injected intramuscularly, and the injection sites were examined 1 week later. Expression of each antigen-EGFP fusion protein was visualized as green fluorescence in muscle tissue sections. A plasmid expressing EGFP alone and a plasmid with a frameshift mutation served as positive and negative controls. Visualization of fluorescent protein in vivo was 100% specific when compared to in vitro results. In vivo sensitivity was only 37% based on individual injection sites, but increased to 100% when results from multiple injection sites were combined for each plasmid. EGFP alone was expressed in a higher proportion of myocytes than the antigen-EGFP fusion proteins (P < 0.001). There was a trend toward an inverse correlation between protein size and the proportion of myocytes with visible fluorescence (r = -0.68; P = 0.09). We compared antibody subtypes generated to Mycobacterium bovis antigen 85A, when it was expressed alone or as a fusion protein. Inclusion of EGFP modified the immune response toward a Th1 response, as indicated by the ratio of antigen 85A-specific IgG2a to IgG1 generated by each plasmid (antigen 85A alone 0.73 +/- 0.18 versus antigen 85A-EGFP 1.82 +/- 0.57, mean +/- S.D.; P < 0.01), though the magnitude of the antibody isotype shift was modest. Direct visualization of antigen-EGFP fusion proteins provided a simple and rapid method to confirm in vivo antigen expression.     

绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子病毒感染NIH3T3细胞的研究

目的：鉴定NIH3T3细胞中绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子基因（egfp-hRI）的表达情况。方法：采用上清感染法,将产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子反转录病毒的PA317细胞上清感染NIH3T3细胞,使反转录病毒介导的绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子载体（pLNCX-EGFP-C1-hRI）稳定整合于NIH3T3细胞。用荧光显微镜检测目的基因的表达,采用蛋白质印迹（Western blot）法检测目的基因在NIH3T3细胞的表达。结果：在荧光显微镜下可见绿色荧光在细胞浆内表达,Western blot法检测到目的基因表达。结论：建立表达绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的NIH3T3细胞株。     

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的 构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并鉴定其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞能否正确表达。方法 PCR扩增M-CSF基因，定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体，构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，脂质体介导将pEGFP-CSF转染人NH3T3细胞，以一步法RT-PCR检测其在NIH3T3细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白，RT-PCR检测结果显示RT～PCR扩增产物与M～CSF目的基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的。nRNA。结论 真核表达重组体pEGFP-M-CSF的成功构建及在体外真核细胞中有效表达，为进一步研究M-CSF在真核细胞中的信号调控奠定了一定的实验基础。     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用

目的构建汉坦病毒(HV）Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体，探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCm—Z10M为模板设计引物，用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段，将G2片段克隆入pUCm—T质粒载体，碱法提取质粒pUCm-Z10-G2，酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa，构建重组体pFastBacHTa-Z10-G2，重组体转化感受态细胞E．coli DH10Bac后，经2轮筛选，提取重组质粒转染昆虫细胞sf9，并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HV Z10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒，转染昆虫细胞表达出G2蛋白，与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应，昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清，与全病毒细胞抗原片的符合率为95％。结论成功构建HV Z10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体，并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。     

增强型绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子包装细胞系的建立及鉴定

目的：建立及鉴定产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的PA317包装细胞系。方法：采用脂质体转染法将pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒转染至PA317包装细胞,分为空白细胞组（未转染组）、pLNCX-EGFP-C1转染组（对照组）、pLNCX-EGFP-C1-hRI转染组（实验组）,每组设3个复孔,转然后用RT-PCR和Western blot方法检测egfp-hRI基因在PA317细胞的表达。结果：RT-PCR和Western blot方法显示,转染后在PA317细胞中检测到egfp-hRI基因表达;用脂质体转染法获得了G418阳性的PA317包装细胞克隆。结论：实验成功建立了产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的PA317包装细胞系,为后续试验奠定了基础。     

siRNA XIAP表达载体的构建及其生物学作用

目的构建靶XIAP的siRNA表达载体,研究其对Hep3B细胞中XIAP表达的影响。方法根据siRNA设计原则,设计并合成三段XIAP的siRNA序列,克隆到pRNAT—U6．1／Neo质粒构建重组质粒;经序列分析确认质粒构建成功后,将重组质粒转染入人肝癌细胞Hep3B,通过RT．PCR、Westernblot和免疫组化分析X!AP的表达。结果重组质粒pRNAT—u6．1／Neo．XIAP经过基因序列分析,siRNA片段成功插入,转染不同siRNAXIAP质粒均可使XIAP的翻译和蛋白表达水平不同程度的降低。结论成功构建并筛选出靶向XIAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究XIAP在调控肝癌细胞凋亡方面的作用奠定了基础。     

Adr亚型乙型肝炎病毒转染细胞模型的构建

目的建立乙型肝炎病毒（HBV）复制状态的细胞模型。方法利用分子亚克隆技术。将9600bp的adr亚型HBV全基因克隆至pcDNA3的EcoRI和HindⅢ位点构建pcDNA3—3HBV，通过脂质体介导的方法转染HepG2细胞，G418筛选。结果成功构建了质粒pcDNA3—3HBV，稳定转染后培养上清，ELISA检测结果显示，HBSAg、HBeAg阳性，且PCR检测前S／S基因阳性。PCR证实转染细胞中有HBVcccDNA存在，RT—PCR证实HBVS基因mRNA的表达。结论重组质粒pcDNA3．3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制。     

siRNA介导的Bcl-2表达下调对肝癌细胞Hep3B的影响及对氨甲蝶呤化疗敏感性的影响

目的构建靶向Bcl-2基因的siRNA表达质粒,观察其对肝癌细胞Hep3B的影响及对氨甲蝶呤(MTX)化疗敏感性的影响。方法根据siRNA设计原则,设计并合成Bcl-2的siRNA序列,克隆到pRNAT-U6.1/Neo质粒U6启动子下游构建重组质粒;经序列分析确认质粒构建成功后,将重组质粒转染入人肝癌细胞Hep3B,通过RT-PCR、Western blot分析Bcl-2的表达,细胞生长实验分析其对肝癌细胞生长的影响及对MTX化疗敏感性的影响。结果重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-Bcl-2经过基因序列分析,siRNA片段成功插入,转染此质粒可使Bcl-2的翻译和蛋白表达水平一定程度的降低,并且可抑制Hep3B细胞的生长,增加其对MTX化疗的敏感性。结论成功构建并筛选出靶向Bcl-2基因的siRNA表达载体,它能抑制肝癌细胞Hep3B的生长及增加其对MTX化疗的敏感性,为基因治疗肝癌提供了新策略和实验基础。