干扰素-γ对脐血造血干/祖细胞细胞周期蛋白D各亚型表达的影响

体外观察干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)对脐血造血干／祖细胞细胞周期蛋白D(cyclinD)不同亚型表达的影响，以探讨IFN-γ造血抑制的机制。用免疫磁珠阳性分选的方法分离脐带血CD34^ 细胞，并进行体外扩增；用甲基纤维素半固体培养方法，观察IFN-γ对脐血造血干／祖细胞CFU-GM形成的影响；用半定量RT-PCR检测IFN-γ对脐血造血干／祖细胞cyclinD不同亚型表达的影响。结果显示IFN-γ可以显著抑制脐血CFU-GM的形成，并可以从mRNA水平抑制cyclinD2和CyclinD3亚型的表达。由此得出结论，IFN-γ可以显著抑制cyclinD的表达，这可能是IFN-γ介导造血抑制的一种机制。     

体外扩增小鼠造血干/祖细胞及重建造血功能的研究

目的 探讨体内中性粒细胞的快速植入及长期重建造血的能力。方法 分离经氟尿嘧啶处理的雄性BDF1小鼠骨髓单个核细胞，以MoFlo细胞分选系统分离纯化CD34^ /c-kit^ 造血干，祖细胞，体外应用骨髓间充质干细胞共培养和阶段扩增结合的方法分别对分离的单个核细胞和CD34^ /c-kit^ 细胞进行体外扩增，并将扩增的有核细胞移植给经亚致死剂量照射的雌性小鼠。结果 以骨髓间充质干细胞为培养基质细胞，结合分阶段扩增方法，有效提高了各种细胞的扩增倍数，其中单个核细胞扩增的总有核细胞、CD34^ 细胞、GM-CFC和HPP-CFC扩增倍数分别为10．8，4．8，65．9和38．8，CD34^ /c-kit^ 细胞扩增的以上4种细胞扩增倍数分别为76．1，2．9，71．7和51．8；扩增细胞移植后可快速产生体内中性粒细胞的植入，并在2个月后的移植小鼠中仍可检测到移植的造血细胞。结论 与骨髓间充质干细胞的共培养，为造血干，祖细胞的有效扩增提供了良好的环境，分阶段扩增法加快了体外造血干，祖细胞的扩增和成熟，为移植后体内中性粒细胞的快速植入创造了条件。     

基质细胞衍生因子-1和血小板第4因子对体外扩增后脐血CD34+细胞黏附特性和趋化功能的影响

为了研究基质细胞衍生因子-1（SDF—1）和血小板第4因子（PF4）对扩增后脐血CD34^＋细胞归巢相关功能的影响，将纯化的脐血CD34^＋细胞接种入无血清培养液中，加入不同组合的细胞因子FST（FL＋SCF＋TPO）、FST＋SDF—1、FST＋PF4或FST＋SDF—1＋PF4，分别于培养第7、10、14天检测CD34^＋细胞扩增倍数、集落形成能力、细胞的黏附分子表达、总黏附性、趋化功能。结果表明：①加入SDF—1的实验组CD34^＋细胞及造血祖细胞集落扩增倍数高于对照组；②加入SDF—1明显上调扩增的CD34^＋细胞CD49e的表达，加入PF4明显上调扩增的CD34^＋细胞CD49e、CD54的表达，在扩增体系中加入SDF—1或PF4均能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的总黏附性；③在扩增体系中加入SDF—1能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的自发迁移率，但导致CXCR-4的表达和SDF—1诱导迁移率降低；而PF4能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的CXCR-4的表达和SDF—1诱导迁移率；在扩增体系中同时加入SDF—1和PF4能够明显提高扩增的CD34^＋细胞自发迁移率和SDF—1诱导迁移率。结论：体外扩增体系中加入SDF—1和PF4能够上调部分归巢相关黏附分子的表达，保持扩增的CD34^＋细胞的黏附和迁移能力，有利于降低体外扩增对造血干／祖细胞（HSPC）归巢相关功能的不利影响，维持扩增的HSPC的归巢潜能。     

TGF-β1对脐血体外扩增中造血祖细胞生物学特性影响

为了了解TGF-β1对扩增中脐血(UCB)造血祖细胞(HPC)增殖和分化等生物学特性的影响，探讨利用其进行UCB-HPC体外扩增的可行性，在含有若干细胞因子的UCB CD133^ 细胞体外扩增体系中加入不同浓度的TGF-β1，对扩增细胞的有核细胞(NC)数、免疫表型、细胞周期、祖细胞集落及粘附分子表达等进行了动态观察。结果显示，TGF-β1各组NC总数及其扩增倍数均低于对照组，且呈明显的剂量负相关性。扩增中TGF-β1各组的CD34^ 、CD133^ 、CD34^ CD38^-细胞的比例、细胞总数及其扩增倍数均明显高于对照组。在扩增早期，TGF—β1各组的CFU—GM，CFU—mix和HPP-CFC集落的产率均高于对照组。高浓度TGF—β1组的S期细胞比例明显减少，而G1／G0期的细胞明显增加。对粘附分子表达的检测表明，TGF—β1能够上调CD49d，CD11a和CD54的表达；TGF-β1各组表达CD49d，CD11a和CD54细胞的比例明显高于对照组，而表达这些粘附分子的CD34^ 细胞的比例也明显高于对照组。结论：适当剂量的TGF-β1能够促进CD133^ 细胞的扩增，延缓和减少扩增中HPC的过度分化，提高扩增细胞中造血祖细胞的含量，同时还能上调扩增细胞的部分粘附分子的表达，从而提高扩增细胞的植入能力，对提高UCB体外扩增的质量具有重要意义。     

转白血病抑制因子基因人胚肺成纤维细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

背景:单份脐血的造血细胞数量有限,难以满足成人的需要,如何有效地扩增脐血造血干/祖细胞是目前研究的热点.目的:构建人白血病抑制因子基因修饰的人胚肺成纤维细胞,观察转基因细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞体外扩增的影响.方法:建立转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞,用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;扩增后的造血干/祖细胞用跨膜迁移实验检测自发迁移率和基质细胞衍生因子1诱导迁移试验以鉴定体外扩增的造血干/祖细胞的归巢能力.结果与结论:成功建立转基因饲养层细胞,RT-PCR法和ELISA法证实有目的基因表达,与人白血病抑制因子转基因饲养层细胞共培养7 d后CD34+造血干/祖细胞可大量扩增,同时表面黏附分子的表达量仍较高.体外迁移实验显示与转基因饲养层细胞共培养的造血细胞的诱导迁移率明显高于对照组,可以较好地保持其归巢能力.因此转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞可有效扩增脐血CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力.     

脐血造血干/祖细胞端粒酶相关蛋白基因hTERT和TEP1的表达及意义

目的：探讨造血／干细胞端粒酶相关蛋白基因hTERT和TEP1在造血过程中对端粒酶活性的调节作用。方法：用RT-PCR和TRAP法分别测定脐血干／祖细胞中hTERT、TEP1mRNA及端粒酶的活性。结果：在新分离的脐血单个核细胞（MNC）和CD34^-细胞中检测不到端粒酶的活性，hTERTmRNA表达阴性；CD34^ 细胞中端粒酶活性低，hTERTmRNA阳性；而TEP1mRNA在MNC、CD34^－细胞和CD34^ 细胞中均为阳性，表达水平差异无显著性。在不同细胞因子组合条件下，CD34^ 细胞体外培养7d，细胞端粒酶活性和hTERTmRNA表达增高，之后随着细胞的分化成熟，二者表达降低，在整个培养过程中，TWEP1mRNA表达无明显变化。结论在脐血造血干／祖细胞中，hTERT基因表达水平与端粒酶活性一致，hTERT基因表达水平对端粒酶的活性起关键作用，TEP1基因作用较弱。     

Caspase-3在脐血CD34+细胞中的表达及意义

为探讨脐血CD34＾＋细胞在不同细胞因子支持下体外扩增过程中caspase－3表达及意义，采用RT—PCR，Western blot和流式细胞术对脐血CD34＾＋细胞在体外扩增过程中的细胞增殖、细胞凋亡及caspase—3的表达进行了测定。检测结果显示，casPase—3　mRNA在新鲜分离的脐血CD34＾＋细胞中低水平表达，在细胞因子支持下体外培养3天，扩增的CD34＾＋细胞中caspase—3　mRNA和蛋白质水平表达上调，但在这两种细胞中仅能检测到分子量为32kD的非活性酶原形式的casPase－3，随着体外培养时间的延长，在无早期效应细胞因子SCF或FL存在的条件下，casPase-3被激活，可检测到分子量为20kD的裂解片段，细胞凋亡率增加。结论：虽然造血干／祖细胞的凋亡是个复杂的过程，但在脐血CD34＾＋干／祖细胞体外扩增过程中，caspase—3参与了细胞凋亡事件并发挥着重要的作用，早期效应细胞因子SCF和FL可减少造血干／祖细胞的凋亡，对造血干／祖细胞有保护作用。     

Notch配体的原核表达与纯化及其对四氯化碳损伤后造血的影响

目的:通过原核表达并纯化靶向内皮细胞的小鼠Notch重组配体m D1R蛋白,观察其对四氯化碳损伤后造血的影响。方法:PCR克隆并构建p ET22b(+)-m D1R表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导,镍珠亲合层析纯化,SDS-PAGE确认目的蛋白表达。应用流式细胞术、细胞粘附实验、免疫荧光染色及实时定量RT-PCR检测蛋白的内皮靶向性和Notch激活程度。建立四氯化碳损伤小鼠模型,应用流式细胞术观察m D1R蛋白对造血干细胞(HSC)、髓系和淋系细胞的影响,应用磁珠分选Lin~-Scal-1~+c-Kit~+细胞并分析细胞周期的变化,RT-PCR检测IL-10的表达。结果:成功克隆并构建原核表达载体,获得高纯度且有生物学活性的m D1R重组蛋白。m D1R能激活四氯化碳损伤小鼠造血干/祖细胞的Notch信号途径,内源性扩增HSC和长期HSC达2.96倍和6.18倍,促进了髓系祖细胞及髓源性抑制细胞的自体扩增,尤其有利于粒/单核细胞进入血液循环,其具体机制可能与Notch信号促进应激损伤后造血干细胞增殖和上调IL-10表达有关。结论:成功构建了连接造血干细胞和造血微环境的新型Notch配体活性蛋白,证实Notch信号途径可能通过促抗炎因子表达,实现应激损伤后自体造血动员。     

脐血造血干／祖细胞研究进展

脐血和骨髓均富含造血干／祖细胞，但二者在造血干／祖细胞的含量上存在差别。脐血中各CD34^ 细胞亚群有着独特的免疫表型。脐血造血干／祖细胞能在体外扩增，扩增后的CD34^ 细胞能在SCID小鼠体内造血，由脐血CD34^ 细胞可以生成淋巴细胞和内皮细胞。脐血造血干／祖细胞移植与骨髓造血干／祖细胞移植在患者的生存率、复发率及移植免疫排斥等方面均具有可比性，有着极大的潜在价值。     

脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化

同源盒基因家族成员HOXIM反映原始造血干／祖细胞（PHSC／PHPC）的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量RT—PCR的方法在mRNA水平上检测HOXIM基因的表达，以观察体外扩增脐血CD34^＋细胞自我更新的水平。结果显示：随着体外培养时间的延长，虽然CD34^＋细胞数增加，但HOXB4表达下降；周后，HOXB4几乎检测不到，与成熟外周血淋巴细胞表达HOXIM的水平相同；CD34^＋细胞与骨髓间充质干细胞（BM—MSC）共培养可以减缓CD34^＋细胞HOXIM表达的下降。结论：脐血CD34^＋细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34^＋与BM—MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34^＋细胞自我更新能力的丧失。     

不同的胞外基质对人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的影响简

本研究建立人胚胎干细胞分化为造血细胞的新诱导体系,并探讨不同的胞外基质对产生造血祖细胞的影响.选择3种胞外基质——matrigel、纤维黏连蛋白（fibronectin）和Ⅳ型胶原蛋白（collagen Ⅳ）包被培养板,采用直接贴壁培养的诱导方法,分步添加造血生长因子诱导人胚胎干细胞向造血祖细胞分化,用造血集落形成试验检测集落形成细胞数,流式细胞术以及实时定量PCR方法检测造血特异性标志物的表达,比较这3种胞外基质对生成造血祖细胞的差异.结果表明,诱导14 d时Ⅳ型胶原蛋白组形成造血集落形成细胞数目、产生CD34阳性细胞数以及造血特异性基因SCL和CD34的表达量均明显高于matrigel和纤维黏连蛋白两组（P＜0.05）.结论：人胚胎干细胞在胞外基质上直接贴壁诱导能有效地分化为造血祖细胞,且Ⅳ型胶原蛋白更有利于向造血系的分化.     

多西环素诱导表达下IL-3基因转染小鼠骨髓基质细胞促进造血

本研究探讨用多西环素调控IL-3基因表达的小鼠骨髓基质细胞系对小鼠造血干细胞增殖分化的促进作用。构建含小鼠IL-3基因逆转录病毒载体系统，转染小鼠骨髓基质细胞系，获得QXMSClTet-on-IL-3；体外加入多西环素诱导IL-3基因表达并检测IL-3表达活性；观察细胞培养条件上清液对造血祖细胞集落形成单位的作用及QXMSClTet-on-IL-3与骨髓细胞共培养对造血干细胞增殖分化的影响。结果表明：多西环素提高了QXMSClTet-on-IL-3细胞系IL-3的表达，促进骨髓造血祖细胞克隆形成数；与骨髓细胞共培养可促进造血干细胞的增殖分化。结论：应用多西环素诱导外源基因转染的骨髓基质细胞IL-3的表达，可促进造血。     

Notch信号在造血祖细胞扩增中作用的研究进展

造血祖细胞扩增具有十分重要的临床价值，传统的方法扩增往往导致造血祖细胞的分化、Notch受体和配体在造血系统中广泛存在，活化的Notch信号可抑制造血祖细胞的分化而促进其扩增，提示可以通过Notch信号途径实现对造血祖细胞的扩增．本文就Notch信号通路、Notch信号与造血祖细胞维持、Notch信号与造血祖细胞扩增，Notch信号维持造血祖细胞未分化状况的分子机制，进行了综述，     

骨髓基质细胞对人造血CD_34~+细胞体外扩增及基因转导的作用

目的：探讨造血基质细胞对人外周血干细胞体外培养扩增及基因转导的促进作用。方法：应用基质细胞支持培养扩增体系进行人造血干细胞体外培养扩增及基因转导。结果：骨髓基质细胞和造血生长因子共同支持组的造血ＣＤ＋３４细胞在体外培养３周后,其造血祖克隆形成能力较单纯造血生长因子支持组高３０．７％（Ｐ＜０．０５）。在有基质细胞支持时,逆转录病毒载体上清转导人造血ＣＤ＋３４细胞后,其造血细胞克隆中Ｎｅｏ基因阳性克隆是无基质支持对照组的２倍。结论：基质细胞的支持有维持造血干细胞原始造血活性及促进基因转导的双重好处。     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及对脐血CD34~＋细胞的扩增作用

背景：Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3配体）是一种重要的生长因子,通过激活特定的酪氨酸激酶受体,调控造血细胞的生长、生存和/或分化,具有促进造血干细胞体外扩增的应用潜力。目的：构建pET32a（＋）-hFLext原核表达载体,表达、纯化hFLext蛋白,观察其对脐血CD34＋细胞的扩增作用。方法：克隆hFLext,构建pET32a（＋）-hFLext重组表达载体。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白。磁珠分选脐血CD34＋细胞,单独加入hFLext或联合干细胞因子、血小板生成素孵育1周,观察体外扩增作用。结果与结论：成功克隆hFLext,并构建了pET32a（＋）-hFLext重组表达载体。在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hFLext融合蛋白,经8mol/L尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白。Trx-hFLext融合蛋白不仅具有维持及轻度刺激CD34＋细胞体外扩增的作用,并且与干细胞因子及血小板生成素具有协同作用,为造血干/祖细胞体外扩增研究奠定了基础。     

融合蛋白hJagged1^ext-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达

本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1^ext-Fc，并在毕赤酵母GS115中表达。用RT—PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段。在测序正确后，将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC—Fc载体，得到PIC—hJagged1^ext-Fc。用MD平板筛选重组子，G418法筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，采用SDS—PAGE分析表达蛋白。结果表明：hJagged1基因的胞外段被有效地扩增。序列分析显示所构建的含phJagged1^ext-Fc融合基因的质粒与设计相同，人IgG1Fc蛋白及融合蛋白hJagged11^extFc得到正确表达。结论：成功地构建了hJagged1^ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体，并在毕赤酵母中正确表达，为进一步研究Jagged1在造血干／祖细胞的体外扩增奠定了基础。     

The notch ligand jagged-1 represents a novel growth factor of human hematopoietic stem cells

The Notch ligand, Jagged-1, plays an essential role in tissue formation during embryonic development of primitive organisms. However, little is known regarding the role of Jagged-1 in the regulation of tissue-specific stem cells or its function in humans. Here, we show that uncommitted human hematopoietic cells and cells that comprise the putative blood stem cell microenvironment express Jagged-1 and the Notch receptors. Addition of a soluble form of human Jagged-1 to cultures of purified primitive human blood cells had modest effects in augmenting cytokine-induced proliferation of progenitors. However, intravenous transplantation of cultured cells into immunodeficient mice revealed that human (h)Jagged-1 induces the survival and expansion of human stem cells capable of pluripotent repopulating capacity. Our findings demonstrate that hJagged-1 represents a novel growth factor of human stem cells, thereby providing an opportunity for the clinical utility of Notch ligands in the expansion of primitive cells capable of hematopoietic reconstitution.     

High efficiency retroviral mediated gene transduction into single isolated immature and replatable CD34(3+) hematopoietic stem/progenitor cells from human umbilical cord blood

Umbilical cord blood is rich in hematopoietic stem and progenitor cells and has recently been used successfully in the clinic as an alternative source of engrafting and marrow repopulating cells. With the likelihood that cord blood stem/progenitor cells will be used for gene therapy to correct genetic disorders, we evaluated if a TK-neo gene could be directly transduced in a stable manner into single isolated subsets of purified immature hematopoietic cells that demonstrate self-renewed ability as estimated by colony replating capacity. Sorted CD34(3+) cells from cord blood were prestimulated with erythropoietin (Epo), steel factor (SLF), interleukin (IL)-3, and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and transduced with the gene in two ways. CD34(3+) cells were incubated with retroviral-containing supernatant from TK-neo vector-producing cells, washed, and plated directly or resorted as CD34(3+) cells into single wells containing a single cell or 10 cells. Alternatively, CD34(3+) cells were sorted as a single cell/well and then incubated with viral supernatant. These cells were cultured with Epo, SLF, IL-3, and GM-CSF +/- G418. The TK-neo gene was introduced at very high efficiency into low numbers of or isolated single purified CD34(3+) immature hematopoietic cells without stromal cells as a source of virus or accessory cells. Proviral integration was detected in primary G418-resistant(R) colonies derived from single immature hematopoietic cells, and in cells from replated colonies derived from G418R-colony forming unit-granulocyte erythroid macrophage megakaryocyte (CFU-GEMM) and -high proliferative potential colony forming cells (HPP-CFC). This demonstrates stable expression of the transduced gene into single purified stem/progenitor cells with replating capacity, results that should be applicable for future clinical studies that may utilize selected subsets of stem/progenitor cells for gene therapy.