新型烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素的研究进展

带有烯二炔结构发色团的抗肿瘤抗生素力达霉素对肿瘤细胞有极强的杀伤力,是近年来发现的抗肿瘤活性较强的化合物之一,在肿瘤的化学治疗方面有良好的应用前景。本文介绍力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、分子作用机制与抗肿瘤活性、单克隆抗体高效偶联物、组合生物合成等方面研究的最新进展。     

基因工程重组力达霉素的制备及抗肿瘤活性

目的 制备重组力达霉素rLDM,研究其抗肿瘤活性。方法 构建完整力达霉素辅基蛋白表达载体pET30-sldp,并在大肠埃希菌中诱导表达重组辅基蛋白rLDP,纯化后的rLDP蛋白与力达霉素发色团AE在体外进行组装制备rLDM,MTT法检测rLDM和LDM的体外抗肿瘤活性,利用流式细胞仪检测两者对肿瘤细胞周期的影响。结果 rLDP蛋白以可溶形式在大肠埃希菌中分泌表达,与发色团组装后经HPLC检测在340nm处出现特定吸收峰,表明rLDM制备成功;MTT实验结果显示rLDM和LDM对SKOV3细胞的IC50值相近,无显著性差异;流式细胞仪检测结果证明两者对SKOV3细胞周期的影响趋势相似。结论     

力达霉素抗肿瘤作用及其分子机制研究新进展

力达霉素属于烯二炔类抗肿瘤抗生素,由一个酸性蛋白和一个烯二炔发色团通过非共价键结合而成,通过多种作用机制在体内外对多种肿瘤产生强烈的抗肿瘤作用.目前,力达霉素已经进入Ⅱ期临床研究,本文介绍了力达霉素的抗肿瘤作用和分子作用机制方面的新进展,为进一步研究力达霉素提供参考.     

烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素的作用机制研究进展

力达霉素（lidamycin,LDM）是一种用精原细胞法筛选得到的链霉菌Streptomyces globisporus C-1027代谢产物中分离获得的九元环烯二炔类抗肿瘤抗生素.LDM对体外试验培养癌细胞有极强的细胞毒作用,体内试验中对移植瘤疗效显著.现主要从断裂DNA、诱导细胞凋亡和裂亡、致细胞产生衰老样表型、抑制血管生成和改变肿瘤侵袭调节基因表达等方面阐述LDM强烈抗肿瘤作用的分子机制.     

力达霉素的体外代谢

旨在研究力达霉素在血浆和肝微粒体中的体外代谢性质,指导临床合理用药。选择HPLC-MS/MS测定方法,通过测定力达霉素的活性成分,考察力达霉素在大鼠、比格犬、猕猴和人血浆及肝微粒体中的代谢稳定性以及在人肝微粒体中对细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)各亚型酶的抑制作用。结果表明,力达霉素在4个种属血浆中均有代谢,其代谢速率为大鼠>比格犬>人>猕猴;在4个种属肝微粒体中,只有在猕猴肝微粒体中代谢;在浓度为0.000 5～10 ng·mL-1时,对人肝微粒体中细胞色素P450各亚型酶几乎无抑制作用。可见力达霉素在人体内的代谢性质与比格犬体内较相似,而且临床上当力达霉素与通过CYP450酶代谢的药物合用时,不会导致这些药物的代谢减慢。     

微生物法测定力达霉素的效价

建立力达葛素效价测定的微生物检定法，检定菌为枯草芽孢杆菌。当力达葛素的浓度为1.85～13.51μg／ml时，其抑菌圈直径与反应剂量呈线性关系，并与HPLC法进行比较，测定结果基本一致。     

单链抗体与力达霉素辅基蛋白在大肠埃希菌表达的发酵工艺

目的 确定工程菌E.coli BL21(DE3)StarTM/pEFL表达抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白构成的融合蛋白Fv-LDP的摇瓶发酵工艺.方法 比色法测定菌体浓度,干燥失重法测定细菌干重,SDS-PAGE-Spot Denso法测定融合蛋白Fv-LDP表达量,单因素或正交设计优化发酵工艺.结果 确定了融合蛋白Fv-LDP表达的最佳培养基配方和培养条件,融合蛋白Fv-LDP表达量为830μg/ml左右,比LB培养基的产量提高5.6倍.结论 优化工程菌发酵工艺大大提高了融合蛋白Fv-LDP表达水平,不仅为下一步中试研究和规模化生产奠定了基础,而且为其它生物来源的抗体和抗生素组分在基因工程大肠埃希菌的生产提供了发酵方面的实验证据.     

抗癌抗生素力达霉素诱导人肝癌BEL-7402细胞死亡的特征

目的　研究抗癌抗生素力达霉素(LDM)诱导人肝癌BEL-7402细胞死亡的特征。方法用荧光染料Hoechst 33342和PI联染;琼脂糖凝胶电泳检测;流式细胞术检测等。结果　LDM1μmol.L^-1处理该细胞后6h,可观察到一种有别于典型凋亡的染色质凝集方式：核膜一直保持完整,细胞仍贴壁,无凋亡小体形成;琼脂糖凝胶电泳检测到DNA梯带。流式细胞术检测到的G1亚峰,仅在LDM处理BEL-7402细胞后24h出现。LDM处理BEL-7402细胞后6h,caspase-3,6的活性分别增高5,4倍。染色质开始凝集的时间比caspase-6活性达到高峰的时间早。结论　力达霉素诱导人肝癌BEL-7402细胞死亡的特征有别于典型的凋亡,此结果可能有助于解释其极高活性地杀死肿瘤细胞的分子机制。     

不同力达霉素与抗Ⅵ型胶原酶单抗偶联物的抗肿瘤作用

研究不同偶联方法制备的力达霉素（LDM）与抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11免疫偶联物的选择性抗肿瘤作用。采用SPDP和SMBS作为偶联剂，将LDM辅基蛋白69位赖氨酸与2-亚氨基四氢噻吩修饰的单抗3G11连接，制备免疫偶联物；ELISA法测定偶联物的免疫活性，克隆形成法及人HT-1080细胞免疫缺陷小鼠移植模型观察两种偶联物的抗肿瘤作用。偶联物保留了单抗3G11对Ⅳ型胶原酶的免疫活性，3G11-SMBS-LDM对体外培养的HT-1080细胞的杀伤作用强于LDM和3G11-SPDP-LDM。动物实验显示，LDM在等摩尔剂量条件下3G11-SMBS-LDM的抑瘤率为86.1%，游离的LDM组为71.2%，3G11-SPDP-LDM组为77.1%，3G11-SMBS-LDM的抑制作用显著增强。3G11-SMBS-LDM组动物的平均生存时间延长为163.7%，3G11-SPDP-LDM组为125.3%，LDM组为71.9%，3G11-SMBS-LDM能显著延长荷瘤鼠的生存期，两个偶联物之间有显著性差异。3G11-SMBS-LDM偶联物更具有选择性抗肿瘤作用，疗效显著提高，荷瘤动物生存期延长，毒性明显降低，可能成为新的肿瘤治疗药物。     

力达霉素标准品量值传递方法的研究

目的：建立力达霉素标准品量值传递的方法。方法：选用稳定物质头孢唑林为表征性参比物质；通过HPLC测定表征性参比物质与力达霉素发色团的标准曲线，以其斜率的比值表征二者的摩尔紫外吸收系数比值，并作为校正因子；通过表征性参比物质的量值结合校正因子来传递力达霉素的量值。结果：表征性参比物质与力达霉素的校正因子为36．58，RSD为2．5％(n=6)。结论：通过校正因子可将力达霉素标准品的量值准确的传递下去。     

Non-caspase-mediated apoptosis contributes to the potent cytotoxicity of the enediyne antibiotic lidamycin toward human tumor cells

Enediyne antibiotics have been reported to be the most potent cytotoxic antitumor agents. The pathway by which these compounds cleave DNA and induce apoptosis of tumor cells may be different from the caspase-mediated pathways that initiate typical apoptosis. In this report, we studied the apoptosis induced by lidamycin (LDM), a member of the enediyne antibiotic family, and compared the characteristics of LDM-induced apoptosis with those of typical apoptosis induced by mitomycin C or etoposide. Chromatin condensation occurred very rapidly and appeared as speckles in human hepatoma BEL-7402 and breast carcinoma MCF-7 cells after treatment with 1 microM LDM. In addition, co-staining the cells with the mitochondria-specific dye Mitosensor and the DNA-specific dye Hoechst 33342 enabled the visualization of mitochondria in normal control and LDM-treated cells but not in mitomycin C-treated cells. Neither the caspase inhibitor VAD-fmk nor the caspase-3 inhibitor DEVD-fmk was able to inhibit the DNA ladder patterns caused by LDM in BEL-7042 or MCF-7 cells. Smaller fragments of histone H1 cleaved by LDM were detected by SDS-PAGE, indicating that the site of LDM action is the internucleosomal structure. Although caspase-9, caspase-3/7, and caspase-6 activities were increased in BEL-7402 cells, and caspase-7 activity was increased in MCF-7 cells after treatment with 1 microM LDM, this occurred much later, indicating that chromatin condensation reached the maximal level rapidly while caspase activities still remained low. Taken together, these results demonstrate that LDM induced rapid DNA cleavage and chromatin condensation independently of caspase activities; this may contribute to its highly potent cytotoxicity toward tumor cells.     

用生物检定法研究力达霉素在小鼠和犬的药代动力学

目的用生物检定法测定力达霉素活性浓度和研究其药代动力学。方法体外细胞毒检测法测定血清力达霉素浓度。结果方法学确证基本符合药代动力学研究要求。小鼠iv力达霉素100,50和10 μg·kg^-1后浓度曲线符合二房室模型，α和β相t_1/2分别是0.77~1.8 min和5.6~7.2 min。AUC分别是2 851.3，887.8和166.4 μg·min·L^-1，随剂量非线性增加。AUC增加和抑瘤疗效增长趋势相似。犬iv力达霉素12 μg·kg^-1后浓度低并迅速下降，AUC仅16 μg·min·L^-1，比小鼠浓度低和消除快。首次给药后15 d进行第2次给药，第2次给药浓度低于首次。结论用生物检定法成功测定血清力达霉素浓度和研究其药代动力学。力达霉素药代动力学存在种属、单次及多次给药差别。     

力达霉素经线粒体依赖通路介导细胞凋亡

力达霉素(lidamycin，LDM)是具有我国自主知识产权的烯二炔类抗生素，具有较强的抗肿瘤活性，其抗肿瘤机制有待深入阐明。本研究主要利用人肝癌BEL-7402和乳腺癌MCF-7细胞研究了力达霉素对线粒体凋亡通路相关因子的影响。通过MTT法检测不同剂量力达霉素对肿瘤细胞增殖毒性；蛋白印迹技术检测线粒体和细胞质细胞色素c、总Bax，Bcl-2及p53表达；RT-PCR检测p53和bax mRNA表达等。结果发现，LDM能迅速激活肿瘤细胞线粒体凋亡通路，在2 h内就引起线粒体中细胞色素c释放至细胞质中。同时Bcl-2家族成员中促凋亡成员Bax持续增加，而抗凋亡成员Bcl-2先增加后减少。p53蛋白在6 h显著增加。Bax蛋白表达升高与其mRNA转录水平升高有关，p53蛋白表达升高与转录后水平有关。 Caspase抑制剂可以部分抑制LDM的增殖毒性。因此LDM可以通过激活细胞色素c启动的线粒体凋亡通路发挥抗肿瘤作用。     

由发酵液提取泰乐菌素C的初步研究

研究了从发酵液中提取泰乐菌素C的工艺条件，确定了甲苯为萃取溶剂，在pH9．25～10．02萃取3次，继而用乙酸乙酯在pH9．44条件下进一步萃取，30％酒石酸溶液反萃取至水相（pH3．88），得到纯度84％的酒石酸泰乐菌素C溶液。     

力达霉素的蛋白和发色团相互作用的分析

目的:通过采用计算机模拟研究力达霉素发色团被蛋白质保护的作用机理的分析。方法:应用InsightⅡ和HyperChem等软件通过分子力学和分子动力学方法研究发色团和蛋白质之间的相互作用。结果:蛋白质通过静电引力和范德华力以及π电子同发色团相互作用。结论:力达霉素的蛋白质部分通过与发色团形成各种作用力使得发色团得到稳定存在,防止其进一步重排,从而为保证发色团发挥抗癌药效,提供科学依据。     

两种测定小鼠体内力达霉素药代动力学方法的比较

目的对测定小鼠血清浓度的总放射性方法和经过高效液相色谱分离后再测定放射性的两种方法进行比较。方法首先对力达霉素进行同位素标记并且分离纯化。给小鼠尾iv ¹²⁵I-力达霉素(100 μg·kg^-1)，采集血样，样品经两种方法测定。对得到的药代动力学参数进行统计学处理。结果两种方法测定得到的药代动力学参数(V_d, t_1/2α, t_1/2β, k₂₁, k₁₀, k₁₂, AUC和CL) 存在显著性的差异 (P<0.05)。结论采用色谱分离后再测定¹²⁵I-力达霉素原形的放射性较为合理和准确。     

力达霉素对人肝癌BEL—7402细胞基因组DNA的影响

目的：深入研究力达霉素对人肝癌BEL－7402细胞基因组DNA的影响。方法：琼脂糖凝胶电泳检测DNA泳带;Suthern杂交检测对基因的损伤;中性凝胶电泳检测DNA断裂修复;超螺旋GEM质粒检测断裂DNA位点。结果：力达霉素1μmol/L处理BEL-7402细胞,15,30,60min,可检测到明显的DNA梯带。低浓度的力达霉素对活跃基因N－ras的外显子和内含子均有明显的损伤作用,但对沉默IL－2基因没有影响。力达霉素断裂DNA后,DNA损伤难以修复。力达霉素断裂GEM质粒DNA的位点是－OH HO－。结论 ：力达霉素明显地损伤人肝癌BEL－7402细胞的基因组DNA。该结果有助于解释其高活性地杀伤肿瘤细胞的分子机制。     

发酵液中洛伐他汀及其开环酸的HPLC测定

建立了HPLC法同时测定发酵液中洛伐他汀及其开环酸的含量。采用C8柱，流动相为10mmol／L磷酸-乙腈（40：60），检测波长238nm。洛伐他汀及其开环酸分别在0．012-0．096mg／ml和0．01-0．08mg／ml范围内线性关系良好，平均回收率分别为99．8％和98．7％。