mdr-1特异性核酶逆转卵巢癌的多药耐药

目的：探讨卵巢癌多药耐药的机制及应用核酶对阿霉素(ADM)引起的多药耐药(MDR)的逆转。方法应用共聚焦激光显微镜(confocal)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)等检测卵巢癌细胞株A2780及阿霉素耐药株A2780／ADM多药耐药基因(mdr-1)及其编码的p-糖蛋白(p-gp)的表达,并比较导入mdr-1特异性核酶后A2780／ADM细胞MDR表型的改变。结果：A2780／ADM细胞对ADM的耐药性是A2780细胞的8．43倍。A2780／ADM细胞中mdr-1基因和p-gp表达较A2780细胞增高,转染mdr-1核酶基因后,A2780／ADM细胞的mdr-1 mRNA和p-gp表达明显下降。结论:ADM所致的卵巢癌细胞MDR与mdr-1基因过度表达有关,应用mdr-1核酶能在一定程度上逆转A2780／ADM细胞的MDR。     

人类白血病多药耐药细胞株K562/ADM、HL60/ADM的耐药性及耐药逆转的研究

目的：研究K562／ADM、HL60／ADM的耐药性及CsA对其耐药的逆转作用。方法：MTT比色法检测细胞耐药性及CsA对细胞耐药性的影响，流式细胞仪检测Pgp、MRP的表达及细胞内柔红霉素(DNR)的浓度。结果：K562／ADM、HL60／ADM对DNR、ADM、VCR、Har、VP16、MIT交叉耐药，对Acla和Ara—C基本不耐药。K562／ADM细胞Pgp过度表达，HL60／ADM细胞的MRP过度表达。CsA使K562／ADM、HL60／ADM细胞内药物浓度增加，逆转了K562／ADM、HL60／ADM的耐药性，而对K562、HL60的耐药性基本无影响。结论：两种不同耐药机制的细胞株对8种常用化疗药物的耐药谱相似，对Acla基本不产生耐药性，故在防止和克服多药耐药的基础上，Acla可能取代DNR、ADM。环孢菌素A(CsA)对两种不同耐药机制的细胞株的耐药性均有逆转作用，主要是通过增加胞内药物浓度来达到逆转作用。     

MRP1介导肿瘤的多药耐药

目的:探讨多药耐药相关蛋白基因MRP1介导肿瘤耐药机制,寻找逆转耐药的方法.方法:建立肝细胞癌单基因耐药细胞株HepG2/MRP1,体外转录合成目的siRNA片断,脂质体介导转染单基因肝细胞癌耐药细胞株,MTT法检测细胞对化疗药的敏感性,流式细胞仪检测药物浓度及细胞表面MRP1蛋白表达.结果:成功建立多药耐药细胞株,并筛选出靶向MRP1基因高效的siRNA分子.转染HepG2/MRP1细胞后,MRP1 mRNA及MRP1表达水平明显下调,细胞内DNR蓄积量增加,对ADM的IC50下调,相对逆转率达90％.转染前后细胞对化疗药敏感性、细胞内药物浓度、细胞表面MRP1蛋白质表达均有显著差异.结论:肿瘤多药耐药与MRP1高表达密切相关,RNAi技术能有效逆转由MRP1介导的肿瘤细胞的多药耐药.     

聚束微波加热逆转MCF-7/ADM细胞对阿霉素耐药性的实验研究

目的 耐药性是化疗失败的主要原因之一,克服耐药性的方法之一是使用逆转剂.目前尚无一理想的、可应用于临床的阿霉素(ADM)耐药逆转剂.本研究探讨聚束微波加热对ADM耐药性的逆转作用及其机制.方法 体外利用人乳腺癌细胞株MCF-7的ADM耐药模型MCF-7/ADM,采用MTT法检测聚束微波加热对MCF-7/ADM细胞耐药性的逆转作用.用Real-Time PCR测定细胞P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(Multidrug resistance related protein,MAP)的表达水平.高效液相色谱法(HPLC)测定细胞内ADM浓度.结果 MCF-7/ADM细胞对ADM的耐药指数为45.5.经聚束微波加热后,ADM对MCF-7/ADM的半数抑制浓度(IC50)由(60.56±2.38)ug/ml下降至(22.86±2.76)ug/ml,逆转倍数为2.64倍.Real-Time PCR检测结果显示,MCF-7/ADM细胞的MAP与P-gp mRNA表达水平均明显高于MCF-7细胞,经聚束微波加热后,MCF-7/ADM细胞胞内的MAP与P-gp mRNA表达水平均明显下降.HPLC法测定细胞内ADM含量的结果显示,经聚束微波加热处理后,MCF-7/ADM细胞内ADM的含量明显增加.结论 聚束微波加热能逆转MCF-7/ADM对ADM的耐药性,聚束微波加热逆转ADM耐药性的机制可能是减少MCF-7/ADM细胞内MRP与P-gp mRNA的表达水平,从而增加了MCF-7/ADM细胞内ADM的蓄积.     

本芴醇衍生物LY980503对多药耐药肿瘤细胞株的耐药调节作用

目的:研究本芴醇衍生物LY980503对肿瘤多药耐药的逆转作用。方法:采用MTT法检测细胞毒作用,采用流式细胞术测定细胞内阿霉素浓度。结果:细胞毒实验显示,4μmol·L-1LY980503能大部分逆转多药耐药细胞株MCF/ADM和K562/ADM对阿霉素的耐药性,10μmol·L-1LY980503能完全逆转MCF/ADM和K562/ADM细胞对阿霉素的耐药性;药物蓄积实验表明,LY980503能显著增加MCF/ADM细胞内阿霉素蓄积。结论:LY980503在体外能有效逆转多药耐药细胞对阿霉素的耐药性。     

人舌癌细胞耐药系Tca8113/BLM的建立及其耐药机理的分析

目的 :建立舌癌平阳霉素 (BleomycinA5Hydrochloride ,BLM)耐药细胞系Tca8113/BLM ;研究Tca8113/BLM细胞P 糖蛋白 (P glycoprotein ,P gp)和多药耐药相关蛋白 (MRP)表达变化与其耐药的相关性。方法 :采用大剂量BLM(30 μg/ml)反复间歇 2 4小时暴露法处理舌癌细胞系Tca8113细胞 ;用MTT法检测该耐药细胞模型的多药耐药性 ;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测P gp、MRP ;并用流式细胞仪检测细胞周期的分布 ,细胞内阿霉素 (ADM)蓄积 ,以及经典钙离子生物泵阻断剂逆转剂黄体酮 (Progesterone,Prog)对ADM蓄积的影响。结果 :①Tca8113/BLM耐药性稳定 ,耐药指数为 12 ,且对其它化疗药物产生交叉耐药性 ;②Tca8113/BLM的倍增时间延长 ,G1期细胞减少 ,G2和S期细胞增多 ;③P gp和MRP在Tca8113/BLM细胞中强阳性表达 ,在Tca8113细胞中弱阳性表达 ,两者相比差异有显著性 (P <0 .0 1) ;④ADM在Tca8113/BLM细胞内蓄积明显低于Tca8113细胞 (P <0 .0 5 ) ;⑤Prog能显著提高Tca8113/BLM细胞内ADM蓄积 ,而对Tca8113细胞内ADM蓄积无明显作用。结论 :建立了舌癌BLM耐药细胞系Tca8113/BLM ,发现Tca8113/BLM的耐药性与P gp和MRP过表达有密切关系     

槲皮素对多药耐药细胞株KB-MRP的耐药逆转研究

目的:研究槲皮素(quercetin)对多药耐药细胞株KB-MRP的耐药逆转作用。方法:使用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度槲皮素对细胞株KB-MRP的抑制率,确定其非细胞毒性浓度。用MTT法分别检测阿霉素(ADM)、依立替康(CPT-11)、长春新碱(VCR)、环磷酰胺(CTX)对细胞株KB-3-1、KB-MRP以及使用槲皮素处理后的KB-MRP的半数抑制浓度(IC50)。通过流式细胞术检测KB-3-1、加入槲皮素前后KB-MRP细胞内的化疗药物阿霉素(ADM)的荧光强度以及加入槲皮素前后多药耐药细胞株KB-MRP的MRP1蛋白表达。结果:终浓度为0~40μmol/L的槲皮素对KB-MRP无明显细胞毒作用。KB-MRP对ADM、VCR、CPT-11均有不同程度的耐药但对CTX不耐药。使用20μmol/L槲皮素处理后KB-MRP对上述ADM、CPT-11、VCR的敏感度均有不同程度的提高,胞内的化疗药物阿霉素(ADM)的荧光强度增强。槲皮素的浓度提高至40μmol/L时,KB-MRP对上述药物的敏感程度提高更明显。流式细胞仪结果显示经槲皮素处理后KB-MRP细胞MRP1表达明显下降。结论:槲皮素可以逆转KB-MRP的多药耐药,逆转效果与剂量相关,逆转机制可能与MRP1的表达下调有关。     

人肺腺癌多药耐药细胞系A549/cDDP的建立及相关基因表达检测

背景与目的 现有研究表明,肺癌细胞多药耐药造成的化疗失败是影响患者生存率的主要原因.本研究旨在建立人肺癌多药耐药细胞系,研究其耐药特性和机制.方法 应用人肺腺痛细胞株A549,采用顺铂(cDDP)大剂量间歇诱导法,建立多药耐药细胞系A549/cDDP.相差显微镜观察细胞形态和结构差异,绘制两种细胞的体外生长曲线.用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多耐药基因(MDR)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平.结果 A549/cDDP对多种抗癌药物耐药,各种抗癌药物IC50显著提高:(70.±4.9)%的A549/DDP细胞表面P-gp表达阳性,而对照细胞A549表达仅为(42.4±5.6)%;(29.4±2.9)%的A549/DDP细胞表面MRP表达阳性,而对照细胞A549表达仅为(21.4±3.5)%,二者有差异(t=11.94;t=5.56,P均<0.01);A549/cDDP和A549细胞的GSH/GST表达无明显变化(P>0.05).RT-PCR检测发现A549/cDDP中的MDR mRNA及MRP mRNA高表达.结论 建立的A549/cDDP具有明确的多药耐药性,其多药耐药基因MDR mRNA及MRP mRNA表达升高.     

槲皮素对人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR~(+/+))多药耐药基因mdr1及P-gp蛋白表达的影响

背景与目的:探讨槲皮素对人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)多药耐药基因mdr1及P-gp蛋白表达的影响.材料与方法:经槲皮素干预B-MD-C1(ADR+/+)细胞后,RT-PCR法检测细胞多药耐药基因mdr 1表达的变化;免疫组织化学法检测多药耐药蛋白P-gp表达的变化;共聚焦激光扫描显微镜检测耐药细胞及相应敏感细胞内阿霉素(ADM)的分布情况;MTT法检测槲皮素作用后B-MD-C1(ADR+/+)细胞对化疗敏感性的变化. 结果:经不同浓度槲皮素干预后,B-MD-C1(ADR+/+)细胞多药耐药基因mdr 1及相应蛋白P-gp表达水平下调(P<0.05);槲皮素干预后,能恢复ADM在B-MD-C1(ADR+/+)细胞内的分布,增加细胞内ADM浓度,从而逆转细胞的耐药性(P<0.05).结论:槲皮素逆转B-MD-CI(ADR+/+)细胞多药耐药性,该作用可能与下调细胞多药耐药基因mdr 1及其编码蛋白P-gp的表达有关.     

汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/ADM多药耐药性机制研究

目的 研究汉防己甲素(TTD)对慢性粒细胞白血病急性变白血病细胞株K562／ADM多药耐药(MDR)逆转的机理。方法 采用流式细胞仪检测细胞内化疗药物的浓度及细胞表面P糖蛋白(P-gp)的表达；荧光定量PCR法检测MDR1 mRNA；通过流式细胞仪检测Anexin—V判断凋亡细胞的数量。结果 10μmol/L的TTD处理K562／ADM细胞后，细胞内阿霉素(ADM)的浓度明显提高；K562／ADM细胞MDR1 mRNA／P-gp的表达下降；TTD能增强ADM致细胞凋亡的作用。结论 汉防己甲素的耐药逆转机制除了下调MDR1 mRNA／P-gp的表达引起细胞内抗癌药物的积聚外，增加抗癌药物致细胞凋亡也是耐药逆转的重要原因。．     

阿霉素诱导人肝癌细胞多药耐药株的建立及其生物学特性评价

背景与目的:多药耐药(multidrugresistance,MDR)是肿瘤治疗的主要障碍,为探讨体外逆转肿瘤MDR的新方法,本研究建立人肝癌细胞多药耐药模型HepG2/Adm,并研究其生物学特性。方法:以人肝癌细胞株HepG2为研究对象,用阿霉素(adriamycin,ADM)浓度梯度递增诱导法,建立HepG2/Adm。观察细胞的生长规律;用MTT法检测多药耐药性;流式细胞术检测细胞周期分布、细胞表面多药耐药基因(mdr1)的表达产物P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrugresistance-associatedprotein,MRP)、肺耐药蛋白(lung-relatedprotein,LRP)及谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferase,GST)的表达;逆转录PCR半定量检测4种MDR基因mRNA表达量。结果:与HepG2细胞比较,HepG2/Adm细胞倍增时间延长30.01h,S期细胞减少(5.6±0.03)%,G1、G2期细胞增多犤(4.2±0.09)%,(1.5±0.08)%犦。该细胞对多种抗肿瘤药物耐药,HepG2/Adm对阿霉素的耐药指数是亲本细胞的26倍,细胞表面多药耐药蛋白P-gp、MRP及GST的表达显著增加,LRP表达有一定的增加;上述四种耐药蛋白基因的表达均明显增加。结论:HepG2/Adm细胞具有多药耐药特性,其耐药性与P-gp、MRP及GST的过表达有关。     

膀胱肿瘤T24／ADM多药耐药细胞株的建立及耐药机制的研究

目的建立人类膀胱肿瘤多药耐药（MDR）细胞株并研究其耐药机制。方法以人类膀胱肿瘤细胞株T24为研究对象，用多柔比星（ADM）浓度梯度递增诱导法，建立人类膀胱肿瘤细胞多药耐药模型（简称T24／ADM）。用MTT法检测肿瘤细胞的MDR特性；RT—PCR检测膀胱肿瘤耐药细胞株MDR基因的表达情况。流式细胞术检测耐药细胞P-糖蛋白（P—gP）的表达。结果T24／ADM对多种化疗药物产生耐药，对ADM的耐药性提高了16-3倍。RT—PCR检测发现T24／ADM中MDR基因和P—gp的表达明显增强。结论T24／ADM细胞具有MDR特性，其耐药性与MDR基因和P—gP的过表达有关。     

In vitro and in vivo evaluation of WK-X-34, a novel inhibitor of P-glycoprotein and BCRP, using radio imaging techniques

Overexpression of the multidrug resistance proteins P-glycoprotein (Pgp) and breast cancer resistance protein (BCRP) results in treatment failure of many malignancies including ovarian cancer. Dual inhibition of Pgp and BCRP may restore the sensitivity of resistant cells to anticancer drugs. We report the synthesis and characterization of a novel anthranilic-acid based Pgp and BCRP modulator, WK-X-34. In vitro inhibition of Pgp activity was evaluated using 99mTc-Sestamibi and daunorubicin accumulation in Pgp overexpressing human ovarian cancer cells (A2780/Adr) and its sensitive counterpart (A2780/wt). Interaction with BCRP was examined with a mitoxantrone-efflux assay in BCRP-overexpressing MCF7/mx cells, with flow cytometry. Interactions with the multidrug resistance associated proteins (MRP) were evaluated in transfected MRP1, MRP2 and MRP3 cell lines, using a 5-CFDA efflux assay. In vivo 99mTc-Sestamibi imaging of human ovarian cancer xenografts was used to evaluate the in vivo efficacy of WK-X-34 in mice. Daunorubicin accumulation in A2780/Adr cells was inhibited by WK-X-34 at nanomolar concentrations (IC50: 82.1 +/- 6 nM). WK-X-34 inhibited mitoxantrone accumulation in BCRP-overexpressing cells at micromolar concentrations (IC50 = 26.5 +/- 4.6 microM), whereas WK-X-34 did not significantly alter 5-CFDA accumulation in MRP transfected cells. In vivo, uptake of 99mTc-Sestamibi was significantly increased in A2780/Adr xenograft tumors, brain and intestine (AUCs(0-4h) 136%, 147% and 138%; p < 0.05) in mice dosed with WK-X-34 (20 mg/kg i.p.). WK-X-34 selectively modulates Pgp and BCRP in vitro and in vivo in multidrug resistant ovarian cancer cells, and thus may have potential utility in the treatment of multidrug resistant tumors.     

槲皮素逆转白血病细胞株HL-60/ADM多药耐药的研究

目的探讨槲皮素(Que)逆转白血病细胞多药耐药在膜转运蛋白方面的机制。方法通过四唑蓝体外药敏法,检测Que对柔红霉素(DNR)的增敏作用,并以不同浓度作用于HL-60／ADM耐药株及相应敏感株HL-60;运用逆转录多聚酶链式反应和流式细胞术,检测HL-60／ADM和HL-60细胞株多药耐药相关基因1(MRP1)及其膜蛋白产物MRP1蛋白的表达情况;借助激光共聚焦显微镜,观察DNR在亚细胞水平的分布变化。结果20～40μmol／L终浓度的Que在体外能明显提高DNR对HL-60／ADM耐药株的敏感性,并能下凋MRP1基因及其膜蛋白产物MRP1的表达,使DNR回归于细胞核内,从而逆转多药耐药,而且对细胞本身无明显毒性作用。结论Que有可能成为蒽环类药物治疗白血病的有效且低毒的化疗增敏剂。     

PI-3K/Akt抑制剂LY294002对卵巢癌细胞A2780/Taxol多药耐药性的逆转作用

背景与目的:磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3 kinase,PI-3K)可抑制细胞凋亡,对PI-3K抑制剂的研究可以更好地了解PI-3K的促癌机制,为多种癌症如卵巢癌、乳腺癌等的基因治疗提供线索。本研究目的在于探讨PI-3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对卵巢癌耐紫杉醇细胞株A2780/Taxol多药耐药的逆转作用。方法:用LY294002处理A2780/Taxol细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞对紫杉醇的药物敏感性,RT-PCR检测MDR1mRNA的表达,Western blot方法分析LY294002作用前后磷酸化Akt及P-gp蛋白的表达。结果:10和50μmol/L LY294002干预A2780/Taxol细胞24h后,A2780/Taxol细胞凋亡率分别为(8.84±1.65)%和(20.78±2.47)%,显著高于未干预细胞的凋亡率(1.25±0.78)%(P<0.05);A2780/Taxol细胞对紫杉醇的半数抑制浓度(IC50)显著降低(P<0.01),相对逆转效率最高可达(78.08±0.37)%;MDR-1mRNA、磷酸化Akt及P-gp蛋白均明显降低。结论:PI-3K/Akt信号通路的激活与卵巢癌细胞多药耐药的产生有关,PI-3K/Akt抑制剂LY294002可逆转卵巢癌细胞A2780/Taxol的多药耐药。     

卵巢癌细胞拓扑替康耐药机制的探讨

目的　探讨人卵巢癌细胞对拓扑替康 (TPT)的耐药机制。方法　流式细胞仪检测卵巢癌TPT耐药细胞与亲本细胞的胞内罗丹明 (Rh12 3)荧光强度 ,RT PCR法检测各膜转运蛋白 (P gp、MRP、BCRP)的基因表达。将包含BCRPmRNA翻译起始位点的反义寡核苷酸 (ASODN)片段转染进耐药细胞 ,分别检测耐药细胞经体外转染后 ,BCRP的基因表达及胞内Rh12 3荧光强度的改变。结果　耐药株的胞内Rh12 3荧光强度是亲本细胞的 31.19% (P <0 .0 1)。耐药株中无P 糖蛋白 (P gp)的基因表达 ;多药耐药相关蛋白 (MRP)基因有极微弱表达 ,相对表达值为 0 .0 5 7;而BCRP基因在耐药株中高表达 ,相对表达值为 0 .6 6 ,亲本细胞不表达BCRP基因。将ASODN转染进耐药细胞后 ,BCRP的基因表达显著下降了 5 9.4 2 % (P <0 .0 5 ) ,胞内Rh12 3荧光强度由 5 .4 2增加到 16 .6 3(P <0 .0 5 )。结论　BCRP的高表达致胞内化疗药物浓度减少 ,是卵巢癌细胞对TPT耐药的主要原因。     

马钱子碱对白血病K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用

目的：研究马钱子碱（vauqueline）对人白血病K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用。方法：采用噻唑蓝（MTT）法检测马钱子碱的细胞毒作用;采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）分别检测非细胞毒浓度（IC10）的马钱子碱对K562/A02细胞MDR1 （multidrug resistance gene 1）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein,MRP）、拓扑异构酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ,TopoⅡ）、谷胱苷肽-S-转移酶（glutathione s-transferase,GST-π）mRNA及其蛋白表达的影响。结果：非细胞毒浓度（IC10）的马钱子碱作用后,K562/A02细胞中MDR1mRNA及P-gp表达降低（P<0.01）。而MRP、TopoⅡ、GST-π mRNA及其蛋白的表达无明显变化（P>0.05）,同时马钱子碱能增加化疗药物在白血病细胞内的积累。结论：马钱子碱能部分逆转K562/A02细胞的耐药性,其作用机制可能与下调K562/A02细胞MDR1 mRNA的表达,导致细胞膜上P-gp的表达量减少,化疗药物从细胞内溢出减少有关。     

Mechanistic Analysis of Taxol-induced Multidrug Resistance in an Ovarian Cancer Cell Line

Objectives: To establish a taxol-resistant cell line of human ovarian carcinoma (A2780/Taxol) and investigateits biological features. Methods: The drug-resistant cell line (A2780/Taxol) was established by continuous stepwiseselection with increasing concentrations of Taxol. Cell morphology was assessed by microscopy and growth curveswere generated with in vitro and in vivo tumor xenograft models. With rhodamine123 (Rh123) assays, cell cycledistribution and the apoptotic rate were analyzed by flow cytometry (FCM). Drug resistance-related and signalassociated proteins, including P-gp, MRPs, caveolin-1, PKC-α, Akt, ERK1/2, were detected by Western blotting.Results: A2780/Taxol cells were established with stable resistance to taxol. The drug resistance index (RI) was430.7. Cross-resistance to other drugs was also shown, but there was no significant change to radioresistance.Compared with parental cells, A2780/Taxol cells were significantly heteromorphous, with a significant delay inpopulation doubling time and reduced uptake of Rh123 (p < 0.01). In vivo, tumor take by A2780 cells was 80%,and tumor volume increased gradually. In contrast, with A2780/Taxol cells in xenograft models there was notumor development. FCM analysis revealed that A2780/Taxol cells had a higher percentage of G0/G1 and lowerS phase, but no changes of G2 phase and the apoptosis rate. Expression of P-gp, MRP1, MRP2, BCRP, LRP,caveolin-1, PKC-α, Phospho-ERK1/2 and Phospho-JNK protein was significantly up-regulated, while Akt andp38 MARK protein expression was not changed in A2780/Taxol cells. Conclusion: The A2780/Taxol cell line isan ideal model to investigate the mechanism of muti-drug resistance related to overexpression of drug-resistanceassociated proteins and activation of the PKC-α/ERK (JNK) signaling pathway.