Multifactor Regulation on Expressions of MMP-9 and TIMP-1 in Endometrial Stromal Cells

Recent evidence suggests that preparation of the endometrium for implantation is notmerely a question of adequate hormonal stimulation but that implantation also depends on theinteraction between the blastocyst and the endometrium and is mediated by cytokines,growthfactors,and adhesion molecules,which are produced and secreted by the endometrium andthe blastocyst[1].Implantation is a complex process that involves embryo apposition andattachment to the maternal endometrial epithelium,the extrace…     

孕激素通过HOXA9对人卵巢癌细胞增殖和迁移的机制研究

  目的  探讨HOXA9在孕激素抑制卵巢癌发展过程中的作用机制。   方法  （1）按照孕激素醋酸甲羟孕酮（MPA）药物浓度梯度（0.1、1、10、50、100 μmol/L）培养人卵巢癌细胞HO-8910,作用24 h、 48 h 、72 h后,光学显微镜观察细胞形态; CCK-8检测细胞存活率,确定IC₅₀; Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率。（2）将细胞分为H0-8910细胞4组:（1）NC组;（2）孕激素组;（3）孕激素+si-HOXA9组;（4）孕激素+ov-HOXA9组。H0-8910细胞分别转染HOXA9敲降或过表达质粒后使用MPA处理或不转染质粒单独使用使用MPA处理72 h,qPCR 和Western blot 分别用于检测HOXA9 mRNA和蛋白表达水平以及上皮间质转化（EMT）相关蛋白 （Vimentin,N-cadherin,E-cadherin）的表达变化;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell 实验用于检测细胞侵袭能力。   结果  （1）孕激素刺激后,HO-8910细胞株生长状态变差,排列稀疏,细胞增殖,迁移以及侵袭能力受到抑制（P < 0.0001）,且细胞凋亡率上升（P < 0.0001）;（2）通过cck8结果计算得MPA处理H0-8910细胞72 h的IC50值为2.680 μmol/L;（3）相较于人卵巢上皮细胞CP-H055,HOXA9在人卵巢癌细胞株HO-8910,SKOV3,A2780和OVCAR3中mRNA均高表达（P < 0.01）,HOXA9蛋白在HO-8910中同样高表达（P < 0.001）;（4）孕激素可抑制HOXA9的表达（P < 0.0001）,敲降HOXA9 后,孕激素对HO-8910侵袭和迁移能力的抑制更为明显（P < 0.0001）,而过表达HOXA9后,孕激素对HO-8910侵袭和迁移能力的抑制稍有减弱（P < 0.0001）;（5）孕激素使E-cadherin蛋白表达上升（P < 0.01）,而Vimentin,N-cadherin蛋白表达下降（P < 0.001）;敲降HOXA9 后,孕激素对HO-891中EMT相关蛋白表达影响更为明显（P < 0.05）,而过表达HOXA9后,孕激素对HO-891中EMT相关蛋白表达影响减弱（P < 0.05）。  结论  孕激素通过抑制HOXA9基因的表达,抑制细胞增殖,迁移,侵袭以及EMT进程等恶性生物学表型,从而抑制卵巢癌发展进程。     

地塞米松对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响及机理研究

目的 观察地塞米松(dexamethasone，DEX)以及DEX和RU486共同作用时对hCG诱导的大鼠间质细胞睾酮分泌的影响和间质细胞中原癌基因c-myb表达的情况，从而探讨DEX的作用机制。方法 用放射免疫方法测定离体大鼠间质细胞的睾酮分泌量；用S-P免疫组织化学方法观察离体大鼠间质细胞中c-Myb蛋白表达的变化。结果 10^-8mol／L的DEX可降低hCG诱导的离体大鼠间质细胞睾酮分泌．并使间质细胞c-Myb蛋白免疫组织化学染色明显下降。上述DEX作用可被糖皮质激素受体功能阻断剂RU486(10μmol／L)所阻断。结论 DEX很可能通过降低间质细胞中c-Myb蛋白表达而抑制hCG诱导的间质细胞睾酮分泌。     

雌、孕激素对子宫内膜癌细胞孤儿受体ERRα的调控作用

目的:探讨孤儿受体ERRα与雌激素(E)、孕激素(P)之间的相互关系及其在子宫内膜癌发病中的作用.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测不同浓度(10-10,10-8,10-6mol/L)17β-雌二醇(17β-E2)作用于Ishikawa细胞系不同时间(0 min,15 rmin,30 min和24 h)后ERRα mRNA的变化,并应用ER拮抗剂ICI182780同时作用细胞,观察是否可阻断E2对ERRα的调控作用;检测不同浓度孕酮(10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)作用于Ishikawa细胞系24 h后ERRα mRNA的变化.结果:10-10mol/L 17β-E2作用于Ishikawa细胞系15 min,30 min及24 h后ERRα mRNA水平与未加E2相比均稍有增加,而10-8,10-6mol/L 17β-E2作用于细胞系15 min,30 min及24 h后ERRα mRNA明显减小,以10-8mol/L作用后减少最明显.同时加入E2和ICI182780作用于细胞系后,E2对ERRα mRNA的减小作用被阻断.10-8mol/L孕酮作用于细胞系24 h后,ERRα mRNA与对照组相比无明显变化,但加入10-7,10-6和10-5mol/L孕酮后,ERRα mRNA表达均出现明显增加.结论:17β-E2可减少子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞ERRα mRNA的表达,此减少作用是通过ER介导完成的.孕酮可增加ERRα mRNA的表达.     

硫酸脱氢表雄酮对MIN6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响

目的探讨硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)对胰岛β细胞株MIN6葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响。方法以葡萄糖刺激浓度为2.8mmol/L和16.7mmol/L的对数生长期MIN6细胞作为实验对象,分别以1、5、10μmol/LDHEAS干预10min和24h(不同浓度DHEAS组),以5μmol/LDHEAS或与10μmol/L糖皮质激素受体阻断剂RU486联合干预24h(DHEAS和DHEAS+RU486组),设立空白对照组。ELISA法测定细胞培养上清液中胰岛素分泌量,Real-TimePCR检测细胞胰岛素mRNA表达。结果干预后10min和24h时点,5μmol/L和10μmol/LDHEAS组MIN6细胞培养上清液中的胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P<0.05);干预后24h时点,DHEAS+RU486组与DHEAS组MIN6细胞培养上清液中胰岛素分泌量比较差异无统计学意义(P>0.05),但均显著高于空白对照组(P<0.05)。干预后24h时点,5μmol/L和10μmol/LDHEAS组MIN6细胞胰岛素mRNA表达均显著高于空白对照组(P<0.05)。结论 DHEAS对MIN6细胞葡萄糖刺激的胰岛素...     

Effects of Progestin and Antiprogestin on the Expression of FSH Receptor and LH Receptor mRNA in Porcine Granulosa and Thecal Cells

We havereported thattheprogestin and antiprogestin both inhibited secretion ofsteroid by porcine granulosa and thecal cells cultured in a dual chambersystem.Theprevious results suggested that this inhibition seemed to be via reduction of go-nadotropin stimulation[1 ,2 ] . The anterior pituitary cell types are responsible for thesynthesis and secretion of LH and FSH known as gonadotropes. LH and FSH exerttheir effects through activation of gonadotropin receptors present on the plasmamembran…     

Effects of Progestin and Antiprogestin on the Expression of FSH Receptor and LH Receptor mRNA in Porcine Granulosa and Thecal Cells

In order to investigate the mechanism of progestin and antiprogestin in the regula tion of ovarian steroidogenesis, a dual-chamber culture system was prepared with the amnion membrane of human placenta. Isolated porcine granulosa and thecal cells from 4～6 mm-diameter follicles were grown on both sides of the amnion, respectively, and co-cultured with or without LNG and RU486. After 48 h incubation, the mRNAs of FSH receptor (FSH-R) and LH receptor (LH-R) of both cells were observed by in situ hybridization. The results showed that granulosa cells expressed both FSH-R mR NA and LH-R mRNA, while thecal cells expressed LH-R mRNA only. Under the stimulation of FSH, both LNG and RU486 increased FSH-R mRNA expression of granulosa cells. Under the stimulation of LH, LNG enhanced LH-R mRNA expres sion of thecal cells; while RU486 decreased its expression. When granulosa and thecal cells were exposed to FSH and LH both, the actions of LNG and RU486 in thecal cells showed the same result as that stimulated by LH alone. In granulosa cells LNG de creased LH-R mRNA expression, while RU486 increased its expression. These data suggest that: (1) granulosa cells expressed FSH-R mRNA significantly;(2) both the progestin and antiprogestin directly acted on the mRNA expression of gonadotropin re ceptors of ovarian cells, but effects were different; (3) the response of granulosa or thecal cells to the action of LNG and RU 486 was not the same. The mechanism needs to be further investigated.     

槲皮素对宫颈癌细胞C33A增殖和凋亡的影响

目的 观察槲皮素对人宫颈癌细胞C33A增殖和凋亡的影响,初步探讨其相关作用机制.方法 用不同浓度槲皮素(空白对照、20、40、80 μmol/L),顺铂(空白对照、5、10、15、20 μg/mL)以及两者联合(槲皮素40 μmol/L+顺铂10 μg/mL)分别作用于C33A细胞24 h和48 h后,噻唑蓝(MTT法)检测细胞活力的变化;流式细胞术检测槲皮素对C33A细胞周期的影响;Western blot检测槲皮素对C33A细胞Cyclin D1、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的影响.结果 MTT结果显示,经过槲皮素处理24 h后,各组细胞活力分别为86.92 ±3.953)%(20 μmol/L组)、(66.54 ±3.932)%(40 μmol/L组)和(52.21 ±2.970)%(80 μmol/L组),均低于空白对照组的(98.35 ±1.230)%;经过槲皮素处理48 h后,各组细胞活力分别为(65.19 ±7.071)%(20 μmol/L组)、(47.04 ±8.881)%(40 μmol/L组)和(29.71 ±6.505)%(80 μmol/L组),均低于空白对照组的(96.97 ±1.788)%.;此外,槲皮素40 μmol/L+顺铂10 μg/mL联合作用于C33A细胞24h后,细胞活力下降为(31.12 ±2.835)%;48 h后,细胞活力下降为(17.86 ± 3.182)%,同空白对照组相比均出现了明显的下降,(31.12 ±2.835)%;48 h后,细胞活力下降为(17.86 ±3.182)%(P<0.05).细胞周期检测结果显示,槲皮素可增加C33A细胞G0/G1期数量,减少S期数量.Western blot 结果显示,槲皮素可下调C33A细胞Cyclin D1蛋白的表达,还可上调Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达.结论 槲皮素通过下调Cyclin D1蛋白的表达可以抑制C33A细胞的活力和增殖,槲皮素通过上调Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达,可以诱导C33A细胞的凋亡.     

孕激素诱导的microRNA-152对子宫内膜上皮细胞增殖的抑制作用

目的 研究孕激素诱导microRNA-152的表达及其对子宫内膜上皮细胞增殖的抑制作用。方法 培养子宫内膜上皮细胞Ishikawa,将其分为4组,分别为空白对照组（control,C组）、10-8mol/L雌激素处理组（estrogen,E组）、10-6mol/L孕激素处理组（progesterone,P组）以及相应浓度的雌、孕激素联合处理组（estrogen plus progesterone,E&P组）,利用实时定量PCR检测microRNA-152的成熟体microRNA-152-3p的表达。将microRNA-152-3p拟似剂转染雌激素预处理的细胞,microRNA-152-3p抑制剂转染雌、孕激素联合处理的细胞,CCK-8法观察microRNA-152-3p对细胞增殖的影响。利用microRNA靶蛋白数据库预测microRNA-152-3p的靶蛋白,并利用Western blot加以验证。结果 实时定量PCR结果显示E组与C组相比,其细胞microRNA-152-3p的表达量无明显变化（ P＞0.05）;P 组细胞microRNA-152-3p的表达量相比C组增加（ P<0.05）;且E&P组的microRNA-152-3p表达量高于C组和P组（ P均<0.05）。对microRNA-152-3p靶蛋白的预测表明CDC14A是其一个重要的靶蛋白。转染microRNA-152-3p拟似剂能够抑制雌激素对子宫内膜上皮细胞的增殖效应（ P<0.05）,同时下调CDC14A蛋白的表达（ P<0.05)。而microRNA-152-3p抑制剂能一定程度解除孕激素对子宫内膜上皮细胞的增殖抑制效应（ P<0.05）,同时上调CDC14A蛋白水平（ P<0.05)。结论 孕激素可通过诱导microRNA-152-3p的表达抑制子宫内膜上皮细胞的增殖,CDC14A蛋白可能是microRNA-152-3p抑制子宫内膜上皮细胞增殖的靶蛋白。     

孕酮、他莫西芬对子宫内膜癌细胞增殖及雌激素受体相关受体表达的影响

目的探讨孕酮及他莫西芬（tamoxifen,TAM）对子宫内膜癌细胞生长的影响及其对雌激素受体相关受体（ERRα）表达的影响。方法体外培养子宫内膜癌Ishikawa细胞,采用MTT法检测不同浓度孕酮及TAM对子宫内膜癌细胞生长的影响,同时采用Western Blot方法检测细胞中ERRα蛋白水平的变化。结果不同浓度孕酮对Ishikawa细胞体外增殖具有抑制作用,呈剂量-时间依赖性。TAM对Ishikawa细胞体外增殖具有双向作用,在×10-9~×10-7mol/L TAM作用下促进细胞增殖,并呈剂量-时间依赖性;在×10-5mol/L TAM作用下抑制细胞增殖。×10-9~10-6mol/L TAM作用后下调细胞中ERRα蛋白表达,×10-5mol/L TAM及孕酮作用后上调ERRα蛋白表达。结论孕酮及高浓度他莫西芬（×10-5mol/L）可抑制子宫内膜癌细胞的增殖,这种抑制作用可能通过调控细胞中ERRα表达实现;而低浓度他莫西芬则促进子宫内膜癌细胞的增殖。     

三氟拉嗪对人子宫内膜癌Ishikawa细胞的抑制作用

目的观察盐酸三氟拉嗪（TFP）在体外对人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和增殖的影响,探讨可能的作用机制。方法采用MTT法检测不同浓度TFP体外干预对Ishikawa细胞生长的抑制作用,计算药物的半抑制浓度（IC50）并选择最佳作用时间。流式细胞仪分析TFP对Ishikawa细胞周期的影响;Real—TimePCR检测TFP对Ishikawa细胞内叉头框转录因子O亚族1（FOXO1）和抑癌基因Kruppel样因子6（KLF6）表达的调控作用。结果不同浓度TFP对Ishikawa细胞的生长均有抑制作用,呈剂量和时间依赖性,IC50为16．56μmol／L;20μmol／L作用24h的抑制效果最佳。20μmol／LTFP干预Ishikawa细胞24h,S期细胞比例明显降低（P〈0．01）,KLF6mRNA表达显著上调（P〈0．05）。结论三氟拉嗪体外干预可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的生长和增殖,其作用机制可能与抑癌基因KLF6表达上调有关。     

降钙素基因相关肽对人支气管上皮细胞分泌MMP-9的影响

目的:探讨降钙素基因相关肽(calcitonin-gene-related peptide,CGRP)对人支气管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)/明胶酶B的影响及其机制.方法:采用逆转录聚合酶链式反应及明胶酶谱法,观察给予不同浓度的CGRP(10-10～10-6 mol/L)刺激及CGRP 10-6mol/L刺激后不同时间点(6,12,18,24,36和48 h)MMP-9活性和基因表达量的变化.结果:体外培养的人支气管上皮细胞能分泌MMP-9;CGRP干预呈剂量及时间依赖方式上调人支气管上皮细胞MMP-9的活性和MMP-9 mRNA的表达(P＜0.01);CGRP上调人支气管上皮细胞MMP-9活性和表达的作用可为蛋白激酶C阻断剂H-7及钙调蛋白阻断剂W-7部分逆转(P＜0.05).结论:CGRP可明显上调人支气管上皮细胞MMP-9的活性和表达,其胞内信号转导机制与蛋白激酶和钙调蛋白信号途径有关.     

雌激素对子宫内膜癌细胞膜雌激素受体α调控的时效和量效关系

目的:研究17β-雌二醇(17β-E2)对细胞膜雌激素受体α(mERα)调控的时效和量效关系.方法:以10^-6 mol/L 17β-E2分别作用于Ishikawa细胞0 min,3 min,10 min,30 min,2 h,12 h和48 h,以10^-12 mol/L,10^-10 mol/L,10^-8 mol/L和10^-6 mol/L 17β-E2分别作用Ishikawa细胞30 min,对各组细胞均进行免疫荧光染色,以流式细胞仪分别测定细胞膜荧光染色阳性率及平均荧光强度.结果:给予17β-E2后随时间延长mERα的荧光强度逐渐增加(P＜0.05),于给药后30 min达到最高值,给药2 h后逐渐下降;在低浓度17β-E2作用下(尤其是10^-10 mol/L),mERα的表达量较高,随着17β-E2浓度的升高,mERα的表达量反而下降.结论:mERα在17β-E2作用30 min时表达最强,其后逐渐减弱;mERα在生理浓度的17β-E2作用下表达最强.     

HOXA1基因反义寡核苷酸对食管癌细胞生长的影响

  目的  探讨同源异形盒A1(HOXA1)基因反义寡核苷酸（ASODN）对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制。  方法  采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测正常食管上皮细胞Het-1A和人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白的表达,筛选高表达的食管鳞癌细胞进行后续实验;设计合成HOXA1 ASODN链、正义寡核苷酸(SODN)链及无义寡核苷酸（N-ODN）链;将筛选出的高表达的食管鳞癌细胞分为HOXA1 ASODN组（5、10、15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞）、对照组（细胞常规培养,不进行细胞转染）、SODN组（细胞转染15 μmol/L的SODN）和N-ODN组（细胞转染15 μmol/L的N-ODN）。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、Transwell小室分别检测细胞活力、凋亡率及侵袭迁移能力;Western blot检测HOXA1、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、细胞增殖核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。  结果  与正常食管上皮细胞Het-1A比较,人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白表达均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。HOXA1蛋白在Eca109细胞表达最高,因此选用Eca109细胞进行后续实验。转染HOXA1 ASODN的Eca109细胞HOXA1蛋白表达降低（P<0.05）。随着Eca109细胞转染HOXA1 ASODN浓度及时间增加,Eca109细胞活力降低,与对照、SODN、N-ODN组比较差异有统计学意义（P<0.05）。15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞后,与对照组比较,细胞侵袭和迁移能力降低,凋亡率升高,p-AKT、PCNA和MMP-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高（P<0.05）。  结论  HOXA1基因反义寡核苷酸可抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导凋亡,机制与抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路可能有关。     

硝呋齐特对甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的 探讨硝呋齐特对甲状腺乳头状癌细胞BCPAP和TPC-1的增殖、迁移及侵袭的影响。方法 用不同浓度（0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）硝呋齐特处理BCPAP和TPC-1细胞,采用MTT法和克隆形成实验观察硝呋齐特对细胞增殖的影响;采用Hoechst 33258染色及流式分选技术观察对细胞凋亡的影响;通过Western blot法检测硝呋齐特处理后BCPAP细胞凋亡相关蛋白及迁移侵袭相关蛋白的表达情况;采用Transwell小室观察细胞迁移和侵袭能力。结果 硝呋齐特0、1.25、2.5 μmol/L处理BCPAP细胞,0、1.25 μmol/L处理TPC-1细胞,24、48、72 h后细胞增殖力均未受到明显抑制（ P>0.05）;硝呋齐特5、10、20 μmol/L处理BCPAP细胞,10、20 μmol/L处理TPC-1细胞,24、48、72 h后细胞增殖力均受到明显抑制（ P<0.05）,且随浓度增加和时间延长其抑制作用逐渐增强;此外,2.5、5 μmol/L硝呋齐特对TPC-1细胞的增殖抑制作用分别从72 h和48 h起效（ P<0.05）。暴露于10 μmol/L硝呋齐特10 d后,BCPAP和TPC-1细胞的克隆形成均受到抑制（ P<0.05）。10 μmol/L硝呋齐特处理48 h后,BCPAP和TPC-1细胞均出现细胞核改变,凋亡小体出现;流式分析显示BCPAP及TPC-1凋亡细胞增加（ P<0.05）。10 μmol/L硝呋齐特处理BCPAP细胞48 h,促凋亡蛋白CC-3、Bax的表达增加（ P<0.05）,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少（ P<0.05）;促迁移侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表达减少（ P<0.05）,MMPs家族抑制剂——金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-2表达增加（ P<0.05）。10 μmol/L硝呋齐特处理BCPAP和TPC-1细胞48 h,BCPAP细胞及TPC-1细胞迁移率与侵袭率均下降（ P<0.05）。结论 硝呋齐特于体外抑制人甲状腺癌细胞系BCPAP和TPC-1的增殖,通过上调CC-3和Bax蛋白的表达诱导细胞凋亡,通过降低MMP-2和MMP-9蛋白的表达阻断细胞的迁移与侵袭。     

三氧化二砷对膀胱癌T24细胞增殖及APC基因表达的影响

目的:探讨三氧化二砷（arsenic trioxide,As₂O₃）对人膀胱癌T24细胞增殖及腺瘤性结肠息肉病相关基因（adenomatous polyposis coli,APC）表达的影响。方法:采用2、4、8 μmol/L的As₂O₃处理T24细胞,MTT法检测T24细胞增殖抑制率;脱氧核糖核酸原位末端转移酶标记技术检测细胞凋亡;用RT-PCR及Western blot法分别检测As₂O₃对T24细胞中APC mRNA和蛋白表达的影响。结果:As₂O₃在2~8 μmol/L浓度范围内处理T24细胞72 h可有效抑制细胞增殖（P<0.01）;促进细胞凋亡（P<0.01）;增加APC mRNA和蛋白表达（P<0.01）。结论:在一定浓度范围内（2~8 μmol/L）As₂O₃可以有效抑制T24细胞增殖和诱导其凋亡,其机制可能与上调APC基因的表达有关。     

地塞米松对cAMP诱导胶质瘤细胞分化的影响

目的:探讨地塞米松对环腺苷酸(cAMP)诱导C6胶质瘤细胞分化的影响。方法:应用地塞米松和RU486单独或共同与cAMP作用于C6胶质瘤细胞,通过Western blotting检测胶质细胞分化标志蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达变化,光镜观察细胞形态学变化;通过Western blotting和细胞免疫荧光观察CREB磷酸化水平。结果:地塞米松与cAMP共作用于C6胶质瘤细胞48h,抑制GFAP表达和细胞形态改变;糖皮质受体抑制剂RU486逆转地塞米松的作用;地塞米松抑制cAMP诱导的CREB磷酸化。结论:地塞米松通过抑制CREB磷酸化逆转cAMP诱导的胶质细胞分化。     

腺病毒载体介导的可调控鼠白细胞介素12基因对大肠癌小鼠的治疗效果

目的 构建携带鼠白细胞介素(mIL)12基因并可经RU486诱导表达的重组腺病毒载体,研究其对小鼠大肠癌移植瘤的治疗效果及安全性.方法 将穿梭质粒pDC-RUmIL-12与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞后,构建出可调控的复制缺陷性重组腺病毒载体,用mIL-12引物对病毒进行鉴定;氯化铯密度梯度离心纯化病毒,最终稀释法测定其滴度.体外感染结肠癌C26细胞后,用ELISA法检测其基因调控表达.皮下注射C26大肠癌细胞构建小鼠大肠癌动物模型,将60只小鼠分成4个治疗组(Ad-缓冲液对照组、Ad-RUmIL-12对照组、Ad-RUmIL-12+RU486治疗组和Ad-mIL-12治疗组), 从各治疗组的肿瘤大小、病理及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平等方面评价各组的治疗效果及不良反应.结果 经PCR鉴定证实可调控腺病毒载体Ad-RUmIL-12构建正确,纯化后病毒滴度达到4.62×1010空斑形成单位(pfu)/ml.病毒感染体外培养的C26细胞后,给予诱导剂RU486则最高可诱导表达mIL-12蛋白(516 ±43)pg/ml,而去除和不加入RU486时,只有少量的mIL-12蛋白表达[(38±3)pg/ml、(42±5)pg/ml].在小鼠动物模型上, Ad-RUmIL-12治疗组和Ad-缓冲液组肿瘤生长较快;Ad-RUmIL-12+RU486 治疗组和Ad-mIL-12治疗组对肿瘤生长有明显的抑制作用,病理检查显示两组肿瘤有较明显的坏死,而前组小鼠的血清ALT水平和不良反应发生率明显低于后组(4/15比10/15,P<0.05).结论 成功构建了可调控重组腺病毒 Ad-RUmIL-12,可以通过RU486诱导mIL-12蛋白的表达,并对大肠癌移植瘤有杀伤作用,明显提高了肿瘤基因治疗的安全性.     

含有RU486诱导系统的IL-2基因表达质粒的构建及功能鉴定

目的： 构建含有RU486诱导系统的小鼠白细胞介素2 (IL-2) 基因表达质粒,研究RU486系统对IL-2基因表达的调控作用。方法： 用限制性内切酶Cla Ⅰ处理含有RU486诱导系统的质粒pRS17和编码IL-2基因的质粒pUC57-IL-2,将IL-2基因插入到pRS17构建pRS-IL-2;通过PCR及限制性酶切鉴定重组质粒;将重组质粒体外转染SMMC-7721细胞,用不同浓度的RU486进行处理;将重组质粒通过水流动力学注射法注射到小鼠体内,腹腔注射RU486进行诱导;通过ELISA方法检测细胞上清及血清中IL-2基因的表达。结果： 重组质粒pRS-IL-2经过限制性内切酶消化及PCR分析,显示了预期的片段。细胞在1×10-8 mol?L-1的RU486诱导下,IL-2表达水平最高,是无RU486组的1.95倍（P<0.001）。注射质粒后,接受RU486诱导的小鼠血清中IL-2水平较诱导前升高320倍,而未接受RU486的小鼠血清未检测到IL-2的表达。结论：成功构建了含有RU486诱导系统的IL-2基因表达质粒,IL-2基因的表达依赖于诱导剂RU486的存在。     

睾酮对3T3-L1脂肪细胞炎症因子生成的影响及其机制研究

目的 探讨睾酮对3T3-L1成熟脂肪细胞炎症因子生成的影响及分子机制.方法 3T3-L1前脂肪细胞诱导成熟,采用不同浓度睾酮(10-9、10-7、10-5mol/L)分别处理10～30 min及12、24及48 h后,提取上清液用ELISA法检测炎症因子白介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的浓度;RT-PCR检测细胞内IL-6、MCP-1mRNA的生成;免疫印迹检测核因子-κB(NF-κBp65)的磷酸化及表达.随后再用10-4mol/L NF-κB的抑制剂吡咯二烷二硫氨基甲酸(PDTC)预处理2 h,再加入睾酮,再观察上述结果的变化.结果 (1)与无睾酮组相比,睾酮3种浓度处理组3T3-L1脂肪细胞上清液IL-6、MCP-1的含量均明显增多(P<0.05),以10-5moL/L睾酮处理24 h时上清液两种因子含量较其他处理组明显增多(P<0.05).与无睾酮组相比,睾酮3种浓度处理组3T3-LI脂肪细胞12 h时,IL-6、MCP-1 mRNA的水平明显增加(P<0.05),以10-5moL/L睾酮处理12 h时两种因子的mRNA水平较其他组明显增加(P<0.05);(2)睾酮3种浓度短时间(10～30 min)处理3T3-L1脂肪细胞时,与无睾酮组相比,均可使NF-κBp65的磷酸化增加(P<0.05),其中以10-5mol/L的作用最明显(P<0.05);睾酮处理3T3-LI脂肪细胞12 h时,NF-κB p65的磷酸化明显增加(P<0.05),其中以10-9和10-5mol/L组较其他组作用明显(均P<0.05);(3)用NF-κB的抑制剂PDTC预处理2 h后,再用睾酮处理,上清液两种因子含量及其mRNA水平明显降低(均P<0.05).结论 睾酮可通过NF-κB途径促进成熟脂肪细胞炎症因子的分泌.